. 5~7. 5w/v%。通过在胶乳试剂中含有甜菜碱， 抑制由于试剂的运输中、储藏中的温度变化（例如由于过度冷所导致的冷冻以及此后的融 解）而产生的胶乳颗粒的凝集沉淀的产生，可以防止作为免疫测定试剂的性能的劣化。若 甜菜碱浓度处于5~30w/v%的范围，则对于冷冻解冻0次和1次而言，信号检出值没有差 异，得到冷冻劣化防止效果。甜菜碱浓度不足5w/v%时，若重复冷冻解冻则存在信号检出 值升高的倾向，难以得到正确的测定值。另一方面，若甜菜碱浓度超过8. 5w/v%则存在由于 重复冷冻·解冻而信号检出值稍微降低的倾向，但是冷冻·解冻〇次的信号检出值也降低， 若按照比率评价由于冷冻·解冻的次数所导致的降低则确认任意一浓度都大致相同。也就 是说，对于超过8. 5w/v%的浓度而言，仅测定信号的绝对值进一步降低，得不到防止性能劣 化的效果自身，劣化防止的效果不会进一步升高。因此，虽然没有特别限定，但是甜菜碱的 使用浓度为8. 5w/v%以下例如7. 5w/v%以下为宜。但是胶乳试剂中含有的甜菜碱的最合适 浓度可以根据胶乳的种类或浓度、缓冲液的种类而变化，因此可以适当研究最合适的甜菜 碱浓度。例如若试剂中的胶乳浓度升高则信号检出值升高，因此在以升高的浓度使用甜菜 碱的情况下，以升高胶乳浓度为宜。
[0023] 作为利用未致敏的胶乳试剂的免疫测定法的具体例，可列举出血红蛋白 Alc(HbAlc)的免疫测定方法。HbAlc为在具有由2根α链和2根β链组成的异源四聚体 结构的血红蛋白（Hb)中，β链的N末端缬氨酸的α氨基非酶学糖基化而成的糖化血红蛋 白，近年作为糖尿病的判定基准，使用HbAlc。区别没有糖化的Hb和HbAlc进行免疫测定的 情况下，使用作为HbAlc特异性区域的β链N末端区域的抗体。该β链N末端区域埋没、 存在于HbAlc分子的高级结构中，若在胶乳表面吸附HbAlc则HbAlc的β链N末端区域露 出，因此即使没有特别的变性处理，也能够进行利用抗HbAlc抗体的免疫测定。使用未致敏 胶乳试剂的市售的HbAlc免疫测定试剂盒是利用这种原理的试剂盒。本发明的试剂例如可 以优选适用于这种HbAlc免疫测定试剂盒。
[0024] 使用了本发明的免疫测定试剂的利用凝集法的HbAlc的免疫测定，除了未致敏胶 乳试剂含有甜菜碱之外，可以如通常那样使用上述市售的HbAlc免疫测定试剂盒进行。以 下具体说明测定的步骤，首先通过使本发明的试剂与血液等检样试样接触，在胶乳颗粒表 面吸附血红蛋白（包含通常的血红蛋白和作为糖化血红蛋白的HbAlc)。检样无需变性处 理，但是可以根据需要实施稀释溶血处理、离心处理等前处理。接着使吸附于胶乳颗粒上的 HbAlc与抗HbAlc抗体接触。通过抗HbAlc抗体介由HbAlc而使胶乳颗粒结合、凝集，因此 反应液的浊度增加。通过肉眼确认反应液的浊度，可以检测HbAlc的存在（定性地检测）。 或者通过自动分析仪等光学测定浊度，也可以定量HbAlc量。后者的情况下，可以预先准 备HbAlc浓度已知的标准试样进行测定，光学测定各标准试样的浊度，绘制浊度测定值与 HbAlc浓度的关系制成标准曲线。通过将检样的测定值适用于该标准曲线，可以求出检样中 的HbAlc量。
[0025] 不过吸附于胶乳颗粒上的HbAlc也可以与胶乳颗粒一起用作免疫测定的样品，因 此也可以通过凝集法以外的免疫测定法来测定胶乳颗粒上的HbAlc。免疫测定的方法自身 在该领域中周知，若基于反应形式分类则有三明治法、竞争法、凝集法、免疫层析法、蛋白印 迹法等，若以标记进行分类则有放射免疫测定、荧光免疫测定、酶免疫测定（EIA)、生物素免 疫测定等，它们都包含于本发明中所称的"免疫测定"。
[0026] 例如通过三明治法测定HbAlc的情况下，可以预先将抗Hb抗体（与包含HbAlc的 全部血红蛋白结合）固定化于固相，使得本发明的免疫测定试剂与检样接触了的反应液与 固相化抗体反应，洗涤后，与标记了的抗HbAlc抗体反应，洗涤后，基于源自标记的信号测 定与固相结合的标记抗体。也可以使用抗HbAlc抗体作为固相化抗体、使用抗Hb抗体作为 标记抗体。测定HbAlc浓度已知的标准试样，绘制信号强度与HbAlc浓度的关系制成标准 曲线，若将检样的测定值适用于该标准曲线，则可以将检样中的HbAlc量定量。
[0027] 作为三明治法的一例，例如在用侧向流动方式的免疫层析测定HbAlc的情况下， 免疫层析仪器可以使用以下构成的仪器。
[0028] 由硝基纤维素膜等多孔性原材料形成的基质通常形成为带状。在该基质上设置固 相化了抗HbAlc单克隆抗体的检测区，在其上游侧（后述的展开液流动方向的上游侧）设 置点样标记了的抗Hb单克隆抗体的标记试剂区。标记试剂区通常通过点样了标记抗体的 多孔性的垫（pad)构成。在基质的上游端设置储藏展开液的展开液槽。使用酶作为标记的 情况下，可以将点样了标记酶的底物的底物区设置于标记试剂区的上游。
[0029] 测定时，可以将HbAlc吸附于胶乳颗粒表面之后的反应液与颗粒一起添加到标记 试剂区。添加后若弄破展开液槽则展开液利用基质的毛细管现象而向下游流动。展开液依 次通过底物区和标记试剂区，底物、标记抗体和吸附了血红蛋白的胶乳颗粒与展开液一起 流到下游。此时胶乳颗粒表面的血红蛋白与标记抗Hb抗体通过抗原抗体反应而结合。若 该免疫复合体到达检测区则通过胶乳颗粒表面的血红蛋白中的HbAlc，标记抗体被检测区 的抗HbAlc抗体捕获。由于底物也同时流过，因此捕获了标记抗体的检测区显色。可以通 过肉眼判定该显色。基于显色的有无能够进行HbAlc的定性检测，除此之外基于检测区的 显色的强度也能够进行大致定量。
[0030] 需要说明的是，免疫层析仪器中，也可以使固相化于检测区的抗体为抗Hb抗体、 使点样于标记试剂带的标记抗体为抗HbAlc抗体。另外，也可以将标记物质的抗体点样于 上述检测区的邻接处、设置对照区，从而可以确认是否适当产生标记抗体的展开。
[0031] 抗HbAlc抗体是公知的，使用了抗HbAlc抗体的HbAlc免疫测定试剂盒也有各种 市售品。本发明中，可以使用这种公知的抗HbAlc抗体。另外，抗体的制作方法也是周知的 常规方法，因此可以与没有糖化的通常的血红蛋白进行区别而制作能够特异性识别HbAlc 的抗体来使用。如上所述，HbAlc特异性部位为β链N末端区域，因此若使用该HbAlc的 β链N末端区域作为免疫原，将动物（人除外）免疫，在该动物体内诱发针对HbAlc的抗 体，则可以由该动物的血清得到针对HbAlc的多克隆抗体。另外，由所免疫的动物回收脾细 胞，通过常规方法的杂交瘤法，可以制备HbAlc特异性结合的抗HbAlc单克隆抗体。从免疫 测定中的再现性等观点考虑，优选使用抗HbAlc单克隆抗体。
[0032] 作为上述免疫原使用的HbAlc的β链N末端区域的制备方法、以及针对该区域的 单克隆抗体的制作方法的具体例例如在日本专利第2677753号等中详细说明，若为本领域 技术人员则可以适当制备。以下对其工艺进行具体说明。
[0033] 作为免疫原使用的HbAlc的β链N末端区域可以通过合成相当于血红蛋白β链 的N末端区域的肽，并使作为N末端氨基酸残基的缬氨酸的α氨基与葡萄糖非酶学结合来 制备。实施糖化处理的肽的合成可以使用市售的肽合成机通过常规方法实施。所合成的血 红蛋白β链N末端区域可以为数个残基左右。序列编号1示出了人血红蛋白β链N末端 的5残基的序列。将制备后的N末端肽溶解于乙酸，在吡啶存在下添加摩尔比2倍量的葡 萄糖，室温下搅拌约10天，由此可以将N末端肽糖化。若肽被糖化则HPLC中的保留时间缩 短，因此糖化反应的进行可以通过HPLC检查。利用HPLC的分析条件如以下所述。 色谱柱：TSKgel、ODS-I2OA (4. 6 X 25〇mm、东 y-社制） 仪器：岛津HPLC系统 流动相：由10%乙腈/〇. 1%三氟乙酸到60%乙腈/0. 1%三氟乙酸的线性梯度 流速：0. 8mL/分钟 时间：25分钟 检测器：吸光度280nm。
[0034] 所得到的糖化肽（HbAlc的β链N末端区域）例如可以在以下的分离条件下进行 HPLC纯化。 色谱柱：TSKgel、0DS-120A(21. 5X300mm、东 y -社制） 流动相：由10%乙腈/〇. 1%三氟乙酸到60%乙腈/0. 1