%三氟乙酸的线性梯度 流速：5mL/分钟 检测器：吸光度280nm。
[0035] 由纯化后的肽通过常规方法脱离在肽化学合成步骤中附加的半胱氨酸保护基团 后，在上述分离条件（但是检测的吸光度以215nm为宜）下再次进行HPLC纯化，所得到的 纯化物可以用作免疫原。
[0036] 如上所述制造的HbAlc的β链N末端区域为数个残基的尺寸，因此用作免疫原的 情况下，可以与适当的载体蛋白（例如甲状腺球蛋白、麻仁球蛋白等）结合，与适当的佐剂 (例如完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂等）混合而免疫于动物（人除外）。由此如上所述可 以在该动物体内诱发针对免疫原的抗体，可以由该动物回收脾细胞，通过杂交瘤法制备单 克隆抗体。
[0037] 具有相对于HbAlc的优选特异性的抗HbAlc抗体的筛选可以如下实施：准备固 相化了通常的血红蛋白的板和固相化了 HbAlc的板，确认所得到的多列抗体对两者的反应 性，由此实施上述筛选。对通常的血红蛋白的结合性为背景程度以下、并且对HbAlc的反应 性高的抗体可以优选用作HbAlc特异性抗体。
[0038] 以上作为测定对象物，以HbAlc作为例子说明了本发明的免疫测定试剂的使用方 法，但是只要是能够使用未致敏胶乳颗粒进行免疫测定的物质，则本发明的免疫测定试剂 可以用于任意物质的测定。 实施例
[0039] 以下基于实施例对本发明进行更具体的说明。但是本发明不被下述实施例限定。
[0040] < 研究 1 > 将公知的HbAlc免疫测定试剂盒中含有的未致敏胶乳试剂（以下Rl试剂）和抗HbAlc 抗体液（以下R2试剂）分别约5mL分注到IOmL管。将管在-20°C的冷库保存一夜，使得 Rl试剂和R2试剂冷冻。将它们在室温下放置、解冻，肉眼确认试剂的状态。
[0041] 对于Rl试剂而言，胶乳产生白色的凝集沉淀，沉淀后的液体变为透明。作为免疫 测定试剂，明显是不能使用的状态。另一方面，R2试剂没有外观上的变化。因此，将冷冻- 解冻〇次的R2试剂和冷冻解冻1次的R2试剂与冷冻解冻0次的Rl试剂一起安装于 日立7170自动分析仪，测定HbAlc标准品描绘标准曲线，结果标准曲线一致。由此确认抗 体液即使经过冷冻解冻，也不会对测定性能造成影响。因此，对于胶乳试剂，进行保护不会 形成冷冻所导致的劣化的研究。
[0042] 〈研究 2> 向Rl试剂在3w/v%~lOw/v%的范围每1%加入甜菜碱（三甲基甘氨酸），调查冷冻· 解冻的影响。将加入有各浓度甜菜碱的Rl试剂3等分，一根在4°C下保存。另两根与研究 1同样地保存于_20°C的冷库一夜，次日通过室温放置进行解冻。没有胶乳凝集沉淀的情 况，但是在管的底部，白色的胶乳浓度升高，因此轻轻颠倒混合。两根中一根在4°C下保存， 剩余的一根在_20°C下保存一夜。次日室温下解冻，轻轻颠倒混合。
[0043] 将冷冻解冻0次、1次、2次的Rl试剂并排安装于日立7170自动分析仪，对于 HbAlc标准品在副波长800nm/主波长660nm下进行测定，描绘标准曲线。各标准品的两点 终点法（2 point end)的信号如表1所示。
[0045] 确认到甜菜碱浓度为6w/v%左右时，即使重复冷冻解冻、信号的数值也稳定。若甜 菜碱浓度降低则存在由于冷冻解冻的重复而信号升高的倾向，另外若甜菜碱浓度升高则观 察到由于冷冻解冻的重复而信号降低的倾向。
[0046] 〈研究 3> 通过研究2的结果，认为加入到Rl试剂的甜菜碱的浓度为6w/v%左右是合适的。因 此，制备添加有甜菜碱6w/v%或7w/v%的Rl试剂，分割为各7根，1根在4°C下保存。剩余 6根在-20°C下保存一夜，次日取出全部根数，在室温下解冻，轻轻颠倒混合，将1根转移到 4°C，剩下的在_20°C下保存一夜。重复此操作，准备冷冻解冻次数为0次~6次的Rl试 剂。将这些Rl试剂和R2试剂安装于日立7170自动分析仪，描绘标准曲线。
[0047] 图1表示在胶乳试剂Rl加入6w/v%甜菜碱时直至冷冻解冻次数6次为止的标 准曲线的信号的变化。直至冷冻解冻3次为止，没有观察到特别大的变化，但是冷冻解 冻第4次以后观察到信号的降低。7w/v%甜菜碱的情况也为同样的结果。
[0048] 图2重叠示出添加有6w/v%甜菜碱的Rl试剂的直至冷冻解冻3次为止的标准 曲线。由于信号几乎没有变化，判明即使胶乳试剂万一冷冻，只要解冻来使用，则与没有经 过冷冻·解冻的Rl试剂同样地进行反应。即，满足严格要求的试剂的稳定性。添加有7w/ v%甜菜碱的Rl试剂也得到同样的结果。
[0049] 〈研究 4> 在公知的HbAlc免疫测定试剂盒中含有的未致敏胶乳试剂同等品（Rl试剂）中以达到 5%~25%的方式添加甜菜碱。由于胶乳浓度因添加甜菜碱而降低，因此加入胶乳原液进行 调整。将该添加有甜菜碱的未致敏胶乳试剂的一部分在_20°C下放置2夜后，室温下放置解 冻。该解冻后，将颠倒混合的Rl试剂和冷藏保存的Rl试剂并排安装于日立7170自动分析 仪，描绘标准曲线。需要说明的是，抗HbAlc抗体液（R2试剂）使用敏化剂的量稍微增加的 抗体液。
[0050] 表2示出副波长800nm/主波长660nm下的各标准品的两点终点法的信号。没有 观察到Rl试剂的冷冻的有无时的差异。另外，描绘标准曲线进行对照的测定，结果测定值 也恒定。
[0052] 表3制备Rl试剂的胶乳浓度增量50%的样品来使用，除此之外与表2的研究同样 地进行。通过提高胶乳浓度，标准品的两点终点法的信号大幅升高，也没有观察到由于冷冻 的有无所导致的差异。添加5%甜菜碱时，由于超过了所设定的ABS，因而没有绘制标准曲 线，但是绘制标准曲线时，对照的测定值也是恒定的。
[0054]〈比较例〉 制备在胶乳试剂Rl添加0. lv/v%作为表面活性剂的Tween 20来替代甜菜碱的样品。 将加入有表面活性剂的Rl试剂采集于管，将其在_20°C下保存一夜，次日室温下解冻。若肉 眼观察则没有发现胶乳的凝集沉淀。因此，使用加入有表面活性剂的Rl试剂利用日立7170 描绘标准曲线。其结果与研究3的结果汇总示于图2。由于完全没有反应性，因此可知由于 表面活性剂而阻碍HbAlc在胶乳表面的物理吸附。
【主权项】
1. 免疫测定试剂，其在溶剂中含有未致敏的胶乳颗粒和三甲基甘氨酸。2. 根据权利要求1所述的试剂，其中，试剂中的三甲基甘氨酸浓度为5~30w/v%。3. 根据权利要求1所述的试剂，其中，试剂中的三甲基甘氨酸浓度为5~10w/v%。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的试剂，其为利用凝集法的免疫测定试剂。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的试剂，其为血红蛋白Alc的免疫测定试剂。6. 免疫测定试剂的劣化防止方法，其包括使三甲基甘氨酸共存于含有未致敏胶乳颗粒 的免疫测定试剂中。7. 根据权利要求6所述的方法，其中，试剂中的三甲基甘氨酸浓度为5~30w/v%。8. 根据权利要求6所述的方法，其中，试剂中的三甲基甘氨酸浓度为5~10w/v%。9. 根据权利要求6~8中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定试剂为利用凝集法的 免疫测定试剂。10. 根据权利要求6~9中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定为血红蛋白Alc的 免疫测定试剂。
【专利摘要】公开了良好地维持免疫测定试剂盒中的胶乳试剂的分散状态，防止由于温度变化所导致的凝集沉淀的产生而保护试剂不会形成测定性能的劣化的，即使对于少量分注胶乳试剂的方式的免疫凝集测定试剂盒也可以适用的新型手段。本发明的免疫测定试剂，其在溶剂中含有未致敏的胶乳颗粒和三甲基甘氨酸。试剂中的三甲基甘氨酸浓度优选为5～10w/v%。该试剂例如可以优选用作血红蛋白A1c的免疫测定试剂。
【IPC分类】G01N33/531, G01N33/72, G01N33/545
【公开号】CN105122062
【申请号】CN201480011899
【发明人】铁本融, 平田稔
【申请人】富士瑞必欧株式会社
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年2月18日
【公告号】CA2900740A1, EP2963419A1, WO2014132833A1