°C下振荡孵育120 min，离心除去未与钴钯纳米粒子纳米粒子CoPdNPs结合的亲和素，制得亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs ;再向亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入100 μ L的10 μ g*mL 1生物素修饰的Apt2，在37 °(:下，振荡孵育30 min，离心以除去未与钴钯纳米粒子CoPdNPs结合的Apt2 ;重新分散于2 mL、pH7.4的PBS缓冲溶液中，制得2 mg*mL 1的钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，储存在4 °(:下备用；
(4)AuiGS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2夹心型电化学适配体传感器的制备
O用氧化铝粉对玻碳电极进行预处理，无水乙醇超声清洗，将电极置于5 mmol-L 1铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6 V电位下扫循环伏安，峰电位差小于110 mV ；
2)将金纳米粒子修饰的甲酰基咪卩坐修饰还原石墨稀AuiGS-FI超声分散处理，制得分散性好的AuO GS-FI溶液； 3)将分散好的AuOGS-FI溶液滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下烤干；
4)在电极上滴涂上凝血酶捕获探针Aptl，置于4°C下晾干；
5)将6-巯基己醇滴涂电极上，置于4°C下晾干，用于封闭非特异性活性位点；
6)在电极上滴涂一定浓度的凝血酶，置于4°C下晾干；
7)滴涂钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，置于4°C下瞭干，制得AuO GS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器。
[0012]实施例3 —种快速检测凝血酶的电化学适配体传感器的制备方法
(I)选择巯基修饰的凝血酶捕获探针Aptl和生物素修饰的凝血酶报告探针Apt2 ; (2)合成金纳米粒子修饰的甲酰基咪卩坐修饰还原石墨稀AuOGS-FI ;称取质量比为1: 1.2的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯GS-FI和氯金酸，用水分散24 h，离心去除上清液，重新用水分散，并用盐酸调节pH < 2，搅拌至少30 min，逐滴加入60 mmol?L 1的NaBH4溶液至氯金酸全部还原，最后，离心并用超纯水洗三次，在真空干燥箱中烘干；
(3)钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2的制备
将5 mg、粒径9 nm左右的钴钯纳米粒子CoPdNPs，加入到2.5 mL浓度为0.05 mol*L 1的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB溶液中，超声30 min,将油溶性的钴钯纳米粒子CoPdNPs改性为水溶性，离心除去多余的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB，将离心后的钴钯纳米粒子CoPdNPs重新分散于pH 7.4的PBS缓冲溶液中；向钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入120yL的I mg^mL1的亲和素，37 °C下振荡孵育120 min，离心除去未与钴钯纳米粒子纳米粒子CoPdNPs结合的亲和素，制得亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs ;再向亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入120 μ L的10 μ g*mL 1生物素修饰的Apt2，在37 °(:下，振荡孵育30 min，离心以除去未与钴钯纳米粒子CoPdNPs结合的Apt2 ;重新分散于2 mL、pH7.4的PBS缓冲溶液中，制得2 mg*mL 1的钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，储存在4 °(:下备用；
(4)AuiGS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2夹心型电化学适配体传感器的制备
O用氧化铝粉对玻碳电极进行预处理，无水乙醇超声清洗，将电极置于5 mmol-L 1铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6 V电位下扫循环伏安，峰电位差小于110 mV ；
2)将金纳米粒子修饰的甲酰基咪卩坐修饰还原石墨稀AuiGS-FI超声分散处理，制得分散性好的AuO GS-FI溶液；
3)将分散好的AuOGS-FI溶液滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下烤干；
4)在电极上滴涂上凝血酶捕获探针Aptl，置于4°C下晾干；
5)将6-巯基己醇滴涂电极上，置于4°C下晾干，用于封闭非特异性活性位点；
6)在电极上滴涂一定浓度的凝血酶，置于4°C下晾干；
7)滴涂钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，置于4°C下瞭干，制得AuO GS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器。
[0013]实施例4凝血酶的测定
(1)将AuOGS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，连接到电化学工作站上；
(2)设置计时电流参数，测量电位为-0.4 V，在10 mL底液为pH 7.4的PBS缓冲溶液中测定，用微量注射器加入10 yL,5mol*L 1的H 202溶液，记录计时电流信号； (3)根据所测定的计时电流信号的变化值与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线；凝血酶的线性范围为0.0lO?2.00 ng.mL \检测限为0.0032ng.mL、
【主权项】
1.一种快速检测凝血酶的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (I)选择巯基修饰的凝血酶捕获探针Aptl和生物素修饰的凝血酶报告探针Apt2 ; (2)合成金纳米粒子修饰的甲酰基咪卩坐修饰还原石墨稀AuiGS-FI 称取质量比为1:1 ~ 1.2的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯GS-FI和氯金酸，用水分散24 h，离心去除上清液，重新用水分散，并用盐酸调节pH <2，搅拌至少30 min，逐滴加入40-60 mmol*L 1的NaBH4S液至氯金酸全部还原，最后，离心并用超纯水洗三次，在真空干燥箱中烘干； (3)钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2的制备 将3~5 mg、粒径7~9 nm左右的钴钯纳米粒子CoPdNPs，加入到1.5~2.5 mL浓度为0.05mol*L 1的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB溶液中，超声30 min，将油溶性的钴钯纳米粒子CoPdNPs改性为水溶性，离心除去多余的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB，将离心后的钴钯纳米粒子CoPdNPs重新分散于pH 7.4的PBS缓冲溶液中；向钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加Λ 80-120 yL的I mg*mL 1的亲和素，37 °C下振荡孵育120 min，离心除去未与钴钯纳米粒子纳米粒子CoPdNPs结合的亲和素，制得亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs ;再向亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入80~120 μ L的10 μ g*mL 1生物素修饰的Apt2，在37 °(:下，振荡孵育30 min，离心除去未与钴钯纳米粒子CoPdNPs结合的Apt2 ;重新分散于2 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液中，制得2 mg*mL 1的钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，储存在4 °(:下备用； (4)AuiGS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2夹心型电化学适配体传感器的制备 O用氧化铝粉对玻碳电极进行预处理，无水乙醇超声清洗，将电极置于5 mmol-L 1铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6 V电位下扫循环伏安，峰电位差小于110 mV ； 2)将金纳米粒子修饰的甲酰基咪卩坐修饰还原石墨稀AuiGS-FI超声分散处理，制得分散性好的AuO GS-FI溶液； 3)将分散好的AuOGS-FI溶液滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下烤干； 4)在电极上滴涂上凝血酶捕获探针Aptl，置于4°C下晾干； 5)将6-巯基己醇滴涂电极上，置于4°C下晾干，用于封闭非特异性活性位点； 6)在电极上滴涂一定浓度的凝血酶，置于4°C下晾干； 7)滴涂钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，置于4°C下瞭干，制得AuO GS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器。2.如权利要求1所述的制备方法制备的适配体凝血酶电化学传感器用于凝血酶的测定，其特征在于，包括如下步骤: (1)将AuOGS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，连接到电化学工作站上； (2)设置计时电流参数，测量电位为-0.4 V，在10 mL底液为pH 7.4的PBS缓冲溶液中测定，用微量注射器加入10 yL,5mol*L 1的H 202溶液，记录计时电流信号； (3)根据所测定的计时电流信号的变化值与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
【专利摘要】本发明涉及一种电化学技术领域的检测方法，具体是利用金纳米-甲酰基咪唑修饰还原石墨烯和钴钯纳米粒子构建一种快速检测凝血酶的夹心型电化学适配体传感器，属于新型功能材料及生物传感分析技术领域。用于凝血酶的检测，线性范围为0.010～2.00ng·mL-1，检测限为0.0032ng·mL-1。
【IPC分类】G01N27/48
【公开号】CN105158319
【申请号】CN201510471527
【发明人】马洪敏, 魏琴, 庞雪辉, 曹伟, 罗川南, 胡丽华, 杜斌, 范大伟, 吴丹, 张勇
【申请人】济南大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年8月5日