[0029] 试验 1 :
[0030] 1、试验方法：本试验丝瓜络的高效液相色谱指纹图谱的建立方法，是按以下步骤 进行：
[0031] -、供试品溶液的制备：a、取丝瓜络药材，加10倍质量的质量百分浓度为75%乙 醇，浸泡12h，超声30min，过滤，分别收集固相物A和液相物A，将固相物A加入10倍质量的 质量百分浓度为75%乙醇中浸泡8h，超声30min，过滤，收集液相物B，然后将液相物A和B 混合，得到浸提液，将浸提液减压浓缩得浸膏；
[0032] b、将浸膏用少量蒸馏水溶解后上到聚酰胺色谱柱上，先用蒸馏水洗涤4个柱体 积，再用质量浓度为30%的乙醇洗脱4个柱体积，收集洗脱液，然后减压浓缩洗脱液至干， 得到干燥固体C;
[0033] c、将步骤b得到的干燥固体C，用甲醇溶解成浓度为2mg/mL的溶液，用微孔滤膜进 行过滤，滤液即为供试品溶液；
[0034] 二、指纹图谱的制作：将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以体积比 为1:1的甲醇和乙腈的混合溶液为A相，质量百分浓度为0. 5 %的乙酸水溶液为B相进行梯 度洗脱；其中，高效液相色谱条件为：1、色谱柱填料Thermo C18,规格为250X4. 6mm，5ym; 柱温为35°C ;采用梯度洗脱方式Omin - 20min - 50min - 80min，体积比为1:1的甲醇和 乙腈混合溶液5 % - 16 % - 25 % - 40 % ;流速0. 8mL/min，检测波长280nm，进样量20 y L ;
[0035] 2、试验仪器：HITACHI L-2000高效液相色谱仪；HITACHI L-2400紫外检测器； AT-130色谱柱柱温箱；HITACHI D-2000色谱工作站。
[0036] 3、试验材料：10批丝瓜络药材来自湖南、山东、安徽、浙江、广西、山西、江苏等地。
[0037] 按照本试验的丝瓜络的高效液相色谱指纹图谱的建立方法，对10批丝瓜络药材 建立了高效液相色谱指纹图谱，得到的谱图导入中药色谱指纹图谱相似度计算软件（中 华人民共和国药典委员会，2004年版），确定了 7个共有特征峰，以7号峰为对照峰，共有 特征峰的相对保留时间分别为号共有特征峰相对保留时间为0. 368±0. 003%，2号峰 相对保留时间为0. 433±0. 01%，3号峰相对保留时间为0. 462±0. 025%，4号峰相对保 留时间为〇. 613±0. 016%，5号峰相对保留时间为0. 667±0. 02%，6号峰相对保留时间 为0. 881 ±0. 028%，7号峰相对保留时间为1. 000,上述共有特征峰构成了丝瓜络的指纹特 征，可作为丝瓜络的标准指纹图谱。
[0038] 本试验得到的丝瓜络的标准指纹图谱如图1所示。由图1可以看出，通过本方法 可以清晰地得到具有7个共有特征峰的丝瓜络的标准指纹图谱，为整体评价丝瓜络的质量 提供了良好的依据。
[0039] 4、方法学考察
[0040] 4. 1方法重现性试验
[0041] 取同一批丝瓜络药材6份，按照试验方法中丝瓜络供试品溶液的制备方法制备供 试品溶液，进行指纹图谱测定，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计，结果 如表1所示，RSD%均不超过3%，显示本发明的方法重现性良好。
[0042] 4. 2指纹图谱精密度试验
[0043] 取方法重现性试验用的供试品溶液一份，连续进样5次，分别对共有峰的相对保 留时间及相对峰面积进行统计，RSD%均不超过3% (如表2)，结果显示本发明的方法精密 度良好。
[0044] 4. 3指纹图谱稳定性试验
[0045] 取方法重现性试验用的供试品溶液一份，进行指纹图谱测定，考察供试品溶液48 小时内的稳定性，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，RSD%均不超过 3% (如表3)，结果显示供试品溶液在48小时内稳定。
[0046] 以上试验结果显示，该测定方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定。
[0047] 表1重现性试验结果（n = 6)
[0048]
[0049]
[0050] 表2精密度试验结果（n = 5)
[0051]
[0052] 表3稳定性试验结果（n = 5)
[0053]
【主权项】
1. 一种丝瓜络的高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于该方法按以下步骤进 行： 一、 供试品溶液的制备：a、取丝瓜络药材，加10倍质量的质量百分浓度为75%乙醇，浸 泡12h，超声30min，过滤，分别收集固相物A和液相物A，将固相物A加入10倍质量的质量 百分浓度为75 %乙醇中浸泡8h，超声30min，过滤，收集液相物B，然后将液相物A和B混合， 得到浸提液，将浸提液减压浓缩得浸膏； b、 将浸膏用蒸馏水溶解后上到聚酰胺色谱柱上，先用蒸馏水洗涤4个柱体积，再用质 量浓度为30%的乙醇洗脱4个柱体积，收集洗脱液，然后减压浓缩洗脱液至干，得到干燥固 体C; c、 将步骤b得到的干燥固体C，用甲醇溶解成浓度为2mg/mL的溶液，用微孔滤膜进行过 滤，滤液即为供试品溶液； 二、 指纹图谱的制作：将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以体积比为 1:1的甲醇和乙腈的混合溶液为A相，质量百分浓度为0. 5 %的乙酸水溶液为B相进行梯度 洗脱；其中，高效液相色谱条件为：色谱柱填料ThermoC18,规格为250X4. 6mm，5ym;柱温 为35°C;流速0. 8mL/min，检测波长280nm，进样量20yL;在此条件下分析供试品溶液，得到 丝瓜络的指纹图谱。2. 根据权利要求1所述的一种丝瓜络的高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在 于梯度洗脱顺序为：步骤一中的微孔滤膜过滤是采用〇. 45ym微孔滤膜进行过滤的。3. 根据权利要求1所述的一种丝瓜络的高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在 于步骤二中梯度洗脱顺序为：〇min- 20min- 50min- 80min，体积比为1:1的甲醇和乙腈 混合溶液 5 % - 16 % - 25 % - 40 %。4. 采用权利要求1所述的一种丝瓜络的高效液相色谱指纹图谱的建立方法得到的丝 瓜络标准指纹图谱。5. 根据权利要求4所述的丝瓜络标准指纹图谱，其特征在于丝瓜络的指纹图谱有7 个共有特征峰，以7号峰为对照峰，共有特征峰的相对保留时间分别为：1号共有特征峰相 对保留时间为0. 368±0. 003%，2号峰相对保留时间为0. 433±0. 01%，3号峰相对保留 时间为〇. 462±0. 025%，4号峰相对保留时间为0. 613±0. 016%，5号峰相对保留时间为 0. 667±0. 02%，6号峰相对保留时间为0. 881 ±0. 028%，7号峰相对保留时间为1. 000,这 7个共有特征峰构成了丝瓜络的指纹特征，可作为丝瓜络的标准指纹图谱。6. 丝瓜络标准指纹图谱的用途，其特征在于丝瓜络标准指纹图谱作为标准指纹图谱用 于丝瓜络质量控制中。
【专利摘要】一种丝瓜络的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途，涉及一种丝瓜络指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途。本发明方法为：一、制备供试品溶液；二、制作指纹图谱，将供试品溶液注入高效液相色谱仪；本发明丝瓜络的指纹图谱有7个共有特征峰，这些共有特征峰构成了丝瓜络的指纹特征，可作为丝瓜络的标准指纹图谱。本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。本发明丝瓜络标准指纹图谱的用途是指丝瓜络指纹图谱作为标准指纹图谱用于丝瓜络药材的真伪、产地和品质的鉴别和质量控制。本发明应用于医药领域。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/06
【公开号】CN105203670
【申请号】CN201510732396
【发明人】刘丽娟, 简颖
【申请人】黑龙江大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年11月2日