匀后离心，弃除上层的生理盐水；再向剩余的红细胞中加入等体积的生 理盐水，混匀后即得到分离好的红细胞样品。
[0026] 取50μL红细胞样品，置于螺旋盖玻璃离心管中，加入十七烧酸作为内标溶液，加 入lmL3mol/L的盐酸-甲醇溶液，混匀后置烘箱中，90°C避光反应3h，衍生化反应完毕后， 冷却至室温，加入2mL正己烷萃取甲酯化反应产物，取上清液并进行氮气吹干，然后向残渣 中加入正己烷作为复溶剂，混匀，得到样品检测液。其中，十七烷酸与红细胞样品的体积比 为1 :1 ;红细胞样品、盐酸-甲醇溶液、萃取剂及复溶剂的体积比为1 :20 :40 :8。
[0027] 通过上述前处理，将红细胞中的脂肪酸转化为挥发性较强、适用于气相色谱-质 谱仪检测的脂肪酸甲酯产物，并萃取分离出来，有效避免了其他物质对后续检测的干扰。
[0028] 实施例二全血红细胞脂肪酸的检测 将样品检测液使用气相色谱-质谱仪进行检测。
[0029] 色谱条件包括：色谱柱为规格为20m*0. 18mm(ID)*0· 20μm(film)的极性毛细管 色谱柱(购自安捷伦，型号DB-23,PartNumber122-2361 )，载气为99. 999%纯度的氦气，载 气流速为〇. 90mL/min，进样方式为不分流进样，进样体积为?μL，进样口温度为230°C，后运 行温度为240°C，后运行时间为2min，吹扫流量为4.OmL/min，总流量为55mL/min。程序升 温条件如表1所示。
[0030]
质谱检测采用电子轰击电离模式，采用全扫描和选择离子扫描方式。质谱条件包括：电 离源为电子轰击离子源（EI)，70ev;传输线温度为230°C，离子源温度为250°C，四极杆质量 分析器温度为150°C，溶剂延迟时间为3. 70min;扫描模式为全扫描（Scan)和选择离子扫描 (SHO,全扫描范围为m/z60. 00~450. 00,选择离子扫描（SHO模式参数如表2所示。
[0031]
全血红细胞中脂肪酸的定性、定量检测：以样品中各脂肪酸与标准品的甲酯产物保留 时间、全扫描所得的质谱图进行NIST谱库检索以及与标准物质的质谱图进行比对作为定 性依据，各脂肪酸甲酯的保留时间如表3所示。样品色谱图中所选择的定性定量离子的相 对丰度比与标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过预设规定范围，则可以判断样品中存 在对应的目标物质。用内标标准曲线法定量，二十烷三烯酸甲酯的峰面积与相应内标物甲 酯峰面积的比值为纵坐标，二十烷三烯酸的浓度与内标物的浓度比值为横坐标，绘制标准 曲线，结果如图1所示，计算人红细胞二十烷三烯酸的含量。
[0032]
采用上述方法，对1例全血红细胞样品中的脂肪酸进行了检测，得出了 20种脂肪酸各 自的含量，脂肪酸甲酯的总离子流色谱图如图2所示。从图2可以看出，各脂肪酸甲酯峰型 对称，没有拖尾现象，分离效果很好。全血红细胞样品中，二十烷三烯酸甲酯的选择离子色 谱图如图3所示，十七烷酸甲酯的选择离子色谱图如图4所示。
[0033]本发明的检测方法最低检出限达到了 0. 01mg/L，得出人红细胞样品中20种脂肪 酸在测定的浓度范围内，线性良好，决定系数R2在〇. 996-0. 999之间。
[0034]重复性实验：取同一来源的全血样品5份，进行相同的前处理和检测，结果20种脂 肪酸含量的RSD都在3°Ρ8%之间，表明该方法的重复性好。
[0035]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：包括如下步骤： A) 全血样品的前处理：从全血样品中分离红细胞，加入内标溶液和盐酸-甲醇溶液进 行衍生化反应，然后加入萃取剂萃取，取上清液并氮气吹干，残渣中加入复溶剂，混匀，得到 样品检测液； B) 对所述样品检测液采用气相色谱-质谱仪进行检测，气相色谱条件包括：色谱柱采 用极性色谱柱，载气为氦气，不分流进样，线速度流量控制方式，载气流量为0. 80~1. OOmL/ min，起始柱温60°C，先升温至180°C，然后升温至220°C，整个升温程序的梯度时间为 8~15min ;质谱条件为：采用电子轰击离子源，采用全扫描和选择离子扫描方式。2. 根据权利要求1所述的快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述内标溶液选自十七烷酸。3. 根据权利要求1所述的快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述萃取剂选自正己烷，所述复溶剂选自正己烷。4. 根据权利要求3所述的快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述内标溶液与红细胞的体积比为1 :(1~2);所述红细胞、盐酸-甲醇溶液、萃取剂及复溶剂 的体积比为 1 : (1〇~25) : (20~50) : (4~10)。5. 根据权利要求4所述的快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述红细胞、盐酸-甲醇溶液、萃取剂及复溶剂的体积比为1 :20 :40 :8。6. 根据权利要求1所述的快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述极性色谱柱选自规格为20m*0. 20 ym的极性毛细管色谱柱。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法，其 特征在于：所述气相色谱条件还包括：进样体积为1ML，进样口温度为220~230°C，后运行温 度为240~250°C，后运行时间为2min，吹扫流量为3. 0~5. OmL/min，总流量为50. 0~60. 0 mL/ min，平均线速度为35. 0~45. Ocm/s。8. 根据权利要求1至6中任一项所述的快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法，其 特征在于：所述质谱条件还包括：接口温度为210~230°C ;离子源温度为220~240°C ;四极杆 温度为140~160°C，溶剂延迟时间为3. 0~4. Omin，全扫描范围为m/z 60. 00~450. 00。9. 根据权利要求1至6中任一项所述的快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法，其 特征在于：还包括如下步骤：检测结果的定性判断和/或定量计算。
【专利摘要】本发明提供一种快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法，属于生物检测技术领域，包括如下步骤：A）全血样品的前处理；B）对所述样品检测液采用气相色谱-质谱仪进行检测。本发明提供的检测方法具有样品用量少，前处理简单，灵敏度高，特异性强，定性、定量功能强大，并且整个检测过程时间短、检测通量高等优点。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105241970
【申请号】CN201510545380
【发明人】刘菲菲, 燕启江, 梁耀铭, 程雅婷, 赵蓓蓓, 郭周萍, 赵强
【申请人】广州金域医学检验中心有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年8月31日