0、20.0 mg/L维生素 A、E混合标准溶液。
[0034] (4)样品预处理
[0035] 准确称取2. 0-5. 0g(精确至0.0 lg)样品于50mL离心管中，加入15mL脱醛乙 醇，5mL10%抗坏血酸水溶液和5mL50%氢氧化钾溶液，充氮，摇匀。避光80°C水浴中加热 30min，不时摇匀，使皂化完全。皂化后立即放入冰水浴中冷却，加入5mL乙酸调节pH至中 性，转移至50mL容量瓶中定容。移取其中30mL皂化液至离心管中，以10,000r/min转速离 心lOmin，取上清液经0. 45 μ m滤膜过滤后进样分析。
[0036] (5)线性范围、检出限和精密度
[0037] 分别取适量经过浓度校准的维生素 A、E标准储备液在棕色容量瓶中混合、稀释、 定容配制成系列混合标准溶液，每种浓度进样100 μ L，以峰面积对浓度作图绘制标准曲线， 以3倍信噪比（S/N)计算检出限（L0D)。结果见表1。各组分在线性范围内峰面积与浓度 呈现良好的线性关系，相关系数不低于〇. 9998。
[0038] 表1方法的线性回归方程、线性范围及检出限
[0039]
[0040] 取l〇mg/L维生素 Α、Ε混合标准溶液连续进样6次，测得维生素保留时间的相对标 准偏差（1^0)<0.1%，峰面积的相对标准偏差〇?0)<2.6%，表明方法精密度良好。
[0041] (6)回收率和实际样品测定
[0042] 分别称取猪肝、配方乳粉和鸡蛋三种动物源食品样品各6份，其中3份用于本底值 测定，另外三份加入一定浓度的维生素 A、Ε混合标准溶液，经相同条件提取、在线固相萃取 净化后测定维生素 A、Ε总量。计算得到猪肝、配方乳粉和鸡蛋中维生素 A、Ε的平均回收率 在85. 5% -114. 1%，相对标准偏差（RSD)在1. 8% -4. 6%。实际样品色谱图见图5,测定结 果参见表2。所建方法各项性能参数符合检测要求，在保证良好回收率的同时同时实现了维 生素 A、α -维生素 Ε、（ β + Υ )-维生素 Ε和δ -维生素 Ε的分别测定，并且测定结果与国标 方法结果相当接近。具体结果参见表2和图4Α-4Β。
[0043] 表2样品含量测定与加标回收率结果
[0044]
[0045] *ND表示未检出
[0046] 对比例1
[0047] 参照《GB/T5009. 82-2003食品中维生素 A和维生素 E的测定》样品前处理和测定 条件，对比了质量浓度为30%、50%和70%氢氧化钾溶液对猪肝、鸡蛋和配方乳粉中维生 素 A、E的转化效率。猪肝样品采用30%、50%和70%的氢氧化钾溶液沸水浴皂化30min， 测得维生素 A含量分别为86. 2 μ g/g、148. 6 μ g/g和134. 3 μ g/g,维生素 E总量分别为 4.51^/^、8.91^/^和7.61^/^;鸡蛋样品采用30%、50%和70%的氢氧化钾溶液沸水浴 阜化30min,测得维生素 A含量分别为1. 1 μ g/g、1. 8 μ g/g和1. 9 μ g/g,维生素 E总量分别 为14. 7 μ g/g、20. 7 μ g/g和18. 5 μ g/g;配方乳粉样品采用30 %、50 %和70 %的氢氧化钾 溶液沸水浴阜化30min,测得维生素 A含量分别为3. 2 μ g/g、6. 3 μ g/g和5. 1 μ g/g,维生素 E总量分别为123. 2 μ g/g、167. 5 μ g/g和174. 5 μ g/g。结果表明50%氢氧化钾溶液可以更 好地满足样品皂化需要。
[0048] 对比例2
[0049] 参照《GB/T5009. 82-2003食品中维生素 A和维生素 E的测定》样品前处理和测定 条件，对比了 50°C、80°C和100°C的皂化温度对皂化的影响。猪肝样品分别在50°C、80°C和 100°C的50%氢氧化钾溶液中皂化30min，测得维生素 A含量分别为136. 2 μ g/g、155. 2 μ g/ g和148. 6 μ g/g，维生素 E总量分别为7. 5 μ g/g、8. 7 μ g/g和8. 9 μ g/g ;鸡蛋样品分别在 50°〇、801：和1001：的50%氢氧化钾溶液中皂化301^11，测得维生素4含量分别为1.4以 8/ g、2. 2 μ g/g 和 1. 8 μ g/g，维生素 E 总量分别为 18. 9 μ g/g、21. 5 μ g/g 和 20. 7 μ g/g ;配方 乳粉样品分别在50°C、80°C和100°C的50%氢氧化钾溶液中皂化30min，测得维生素 A含量 分别为 5. 7 μ g/g、7. 0 μ g/g 和 6. 3 μ g/g，维生素 E 总量分别为 156. 5 μ g/g、173. 5 μ g/g 和 167. 5 μ g/g。结果表明80°C可以更好地满足样品皂化需要。
[0050] 对比例3
[0051] 首先考察了 C18、C8和CN三种不同类型填料的固相萃取柱对维生素 A、E的富集 效果。采用甲醇和水作为萃取流路的流动相，分别测定了 10. 〇mg/L的维生素 A和维生素 E标准溶液在1. OmL/min流速下经体积比为40 %、50 %、60 %、70 %的甲醇溶液洗脱的回收 率，如图2A、2B所示，C18和C8固相萃取柱在萃取液中甲醇含量为40% -60%浓度范围内 对维生素 A、E具有良好的富集作用。接着考察了 C18、C8和CN三种不同类型填料的固相萃 取柱对动物源食品基质的净化效果。仍以甲醇和水作为萃取流路的流动相，分别测定了 2g 猪肝、鸡蛋和配方乳粉（如图3所示）皂化液在1. OmL/min流速下经体积比为40%、50%、 60%、70%的甲醇-水溶液洗脱并转移至分析柱的残余杂质色谱峰面积，结果表明C18和C8 固相萃取柱在萃取液甲醇含量为60 % -70 %浓度范围内对杂质清洗效果较好，并且C8萃取 柱的净化能力要略优于C18萃取柱。
[0052] 对比例4
[0053] 虽然60%甲醇溶液能够去除样品中大部分杂质，但是实验发现还有一定量的残余 杂质会通过阀切换转移到分析柱上，对保留时间较短的维生素 A形成干扰。为此，尝试采用 调节萃取液pH值的方法进一步提高在线固相萃取方法的净化能力。比较了萃取液水相在 pH3. 0-8. 0范围内对猪肝、鸡蛋和配方乳粉皂化液基质的洗脱效果，结果发现采用碱性和酸 性甲醇溶液清洗固相萃取柱，净化效果较之前的中性洗脱液有明显改善，转移至分析柱上 的杂质量显著减少，不再干扰维生素 A测定。最优选依次使用pH7. 5和pH3. 5的60%甲醇 水溶液来洗脱萃取柱，从而实现更佳的样品基质净化效果。
【主权项】
1. 一种对维生素A、E进行测定的方法，所述方法包括将经过预处理的待测样品进行在 线固相萃取分析，所述预处理包括在碱的存在下对样品进行皂化，其特征在于，所述在线固 相萃取分析包括如下步骤： (a) 将所述经过预处理的待测样品泵入固相萃取柱，通过洗脱除去杂质，将待测的维生 素A、E保留在所述固相萃取柱上； (b) 通过切换六通阀，将所述固相萃取柱与分析柱在流路上串联，进行维生素A、E的分 离； (c) 使所述分析柱的流出液进入检测器进行检测。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相萃取柱采用C8作为填料；和/或 所述分析柱采用C18作为填料； 其特征还在于，所述步骤a、b和c采用甲醇水溶液作为流动相。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤a采用体积比为60:40的甲醇-水 溶液；和/或所述步骤b和c采用体积比为98:2的甲醇-水溶液； 优选地，在步骤a中，依次使用pH7. 5和pH3. 5的甲醇水溶液来洗脱所述固相萃取柱。4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在所述预处理的过程中，使用 50%氢氧化钾溶液作为皂化剂，在80°C下皂化反应30min;和/或对预处理过程进行避光处 理和氮气保护； 优选地，在皂化后立即放入冰水浴中冷却,加入乙酸调节pH至中性，以10, 000r/min转 速离心lOmin，取上清液经0. 45um滤膜过滤后进样分析。5. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法采用包含第一泵和第 二泵的双梯度泵进行实施，所述第一泵用于实施所述步骤a，所述第二泵用于实施所述步骤 b和c〇6. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器，检测 波长为325nm和300nm。7. -种用于对维生素A、E进行检测的在线固相萃取分析系统，所述系统包含第一泵、 进样器、六通阀、固相萃取柱、第二泵、分析柱和检测器，所述进样器在流路上串联于所述第 一泵的下游，所述检测器在流路上串联于所述分析柱的下游，其特征在于，所述六通阀用于 切换所述系统的两种工作状态：在第一工作状态下，所述固相萃取柱在流路上串联于所述 进样器的下游，所述分析柱在流路上串联于所述第二泵的下游；在第二工作状态下，所述固 相萃取柱在流路上串联于所述第二泵的下游，所述分析柱在流路上串联于所述固相萃取柱 的下游。8. 如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述第一泵和所述第二泵被包含在一个双 梯度泵中。9. 如权利要求7或8所述的系统，其特征在于，所述固相萃取柱采用C8作为填料；和/ 或所述分析柱采用C18作为填料； 其特征还在于，由所述第一泵和所述第二泵驱动的流路均采用甲醇水溶液作为流动 相。10. 如权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，由所述第一泵驱动的流路采用 体积比为60:40的甲醇-水溶液；和/或由所述第二泵驱动的流路采用体积比为98:2的甲 醇-水溶液； 优选地，在由所述第一泵驱动的流路中，依次使用pH7. 5和pH3. 5的甲醇水溶液来洗脱 所述固相萃取柱。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种对动物源食品中的维生素A、E进行测定的方法。具体而言，本发明采用固相萃取与高效液相色谱联用技术，建立了一种在线固相萃取-高效液相色谱同时测定动物源食品中维生素A、E的分析方法。此外，本发明还提供了用于对维生素A、E进行检测的在线固相萃取分析系统。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/20
【公开号】CN105467019
【申请号】CN201410406346
【发明人】谢云峰, 王浩, 杨永坛, 刘佟, 任丹丹
【申请人】中粮营养健康研究院有限公司, 中粮集团有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年8月18日