055] 多肽序列3 (GPYEGPVKKPVALKC)与载体蛋白0VA偶联，制备抗原包被板，分别与多肽 序列1 (GPYTGPLERQKPLKC)、2(GPYAGPMERQKPLKC)、3(GPYEGPVKKPVALKC)免疫后的血清反应， 结果如表1-3:
[0056] 表1-3免疫后血清效价的测定
[0057]
[0058]
[0059] 从表1-1，1-2，1-3看出，多肽序列1(6?￥了6?1^1^!1^1^〇与载体蛋白0￥六偶联，制备 的抗原包被板，与多肽序列l(GPYTGPLERQKPLKC)免疫后的血清反应效果最好，本发明选取 GPYTGPLERQKPLKC 作为抗原。
[0060] 2、酶标板的制备：
[00611将与载体蛋白0VA偶联的合成肽抗原，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为100ng/mL， 按1 ΟΟμL孔加入聚苯乙烯微孔板中，4 °C放置过夜，甩干；用200μLν孔含5mg/mLBSA的pH7.4 的磷酸盐缓冲溶液4°C封闭lh，甩干;置于干燥室干燥后，装入含有干燥剂的包装中密封保 存。
[0062] 实施例2:
[0063] 一种抗口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单克隆抗体的制备方法，其步骤是：
[0064] 1、饲养细胞的制备：
[0065] 在融合前一天，取一只正常雌性BALB/c鼠，75% (V/V)酒精消毒5min，甩干后移入 超净工作台内，固定于经紫外消毒的泡沫板上，用灭菌眼科剪、弯头镊子剪开皮肤(不可损 伤腹膜），经钝性剥离使腹膜充分暴露。用10mL-次性注射器吸满含20% (V/V)胎牛血清的 HAT选择培养液注入小鼠腹腔，右手固定注射器不动，左手用镊子夹取酒精棉轻揉小鼠腹 部，再用注射器抽出腹腔内的培养液，注入灭菌平皿中，加上述培养液调整细胞密度至1〇 6 个/mL，用多道移液器分别接种至4块96孔细胞培养板，每孔100uL，置37°C，5 %C02培养箱中 培养。
[0066] 2、制备免疫脾细胞：
[0067]取合适浓度的3B-KLH抗原与等体积佐剂充分混匀，免疫5周龄的BALB/c小鼠，注射 剂量为60~lOOyg。每间隔两周皮下免疫一次、连续免疫三次后，融合前3天腹腔加强免疫。 第一次免疫时使用弗式完全佐剂，第二、三次使用弗式不完全佐剂，加强免疫时不使用佐 剂。
[0068] 取经最后加强免疫的BALB/c鼠，眼球摘除放血，分离血清作阳性对照用。将小鼠按 上法进行消毒和剥离皮肤，无菌取出脾脏，放入已盛有基础培养液的平皿中清洗，剥离结缔 组织。将脾脏移入另一盛有10mL基础培养液的平皿中，用针头在顶端穿孔，用一次性无菌注 射器吸取5mL基础培养液，从脾脏一端缓慢注入，使液体从脾脏另一端针孔流出，重复三次。 将脾细胞悬液转至10mL无菌离心管中，lOOOrpm离心10min，细胞沉淀用基础培养基离心洗 涤一次，然后将细胞重悬，计数后备用。
[0069] 3、制备骨髓瘤细胞：
[0070]在融合前两周将在液氮中冻存的SP2/0骨髓瘤细胞取出复苏，用加有8-氮鸟嘌呤 的1640完全培养基选择培养三代，以保持HGPRT缺陷型。选择生长旺盛，形态良好的细胞作 种子细胞用1640完全培养基进行扩大培养。融合当天，取刚好处于对数生长期，形态良好的 细胞(细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐，呈半致密分布），l〇〇〇rpm离心10min，弃去培养 液，用基础培养液洗2次后将细胞重悬，记数后备用。
[0071] 4、细胞融合：
[0072] 先将免疫脾细胞1000r/min离心5min去掉上清，于37°C放置备用。将1 X 107个SP2/ 0与1〇8个免疫脾细胞于50mL离心管中混匀，离心10min。倒空上清，用灭菌的滤纸吸干管壁， 轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37°C水浴中。然后在 lmin内慢慢滴入预温至37°C的50%PEG0.8mL(Sigma)，边加边轻轻用吸管尖搅拌。继续搅拌 lmin。然后慢慢加入37°C预温的基础液10mL。具体方法为第一分钟逐滴滴入lmL。第二分钟 加 lmL，第3-4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。 最后加入30mL 1640液，也需慢慢加入。800r/min离心5min，去上清于37°C放置5min。用HAT 培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮饲养脾细胞与融合后的细胞混合，根据需要补加适量 的HAT培养基，分种于96孔细胞培养板中，约200yL/孔。一次融合可接种4块96孔板。于37°C 5 % C02培养箱中培养。融合后第二天开始观察，有无污染，于第5天补加1滴培养基，第8天吸 去100yL培养基换HT培养基lOOyL。待融合细胞集落长至培养孔1/4,培养基略变黄时，进行 抗体检测。
[0073] 5、阳性细胞的筛选和克隆：
[0074]在包被有口蹄疫非结构蛋白3B-0VA合成肽抗原的包被板中加入96孔细胞培养板 上的细胞上清，于3 7 °C温育1 h，洗涤3次，加入1: 5 0 0 0稀释的羊抗鼠 I g G - H R P，3 7 °C反应 30min，洗涤3次，加入显色液显色，终止反应之后，用酶标仪测每孔的读值。同时设无集落生 长孔作为阴性对照。选取生长旺盛的阳性孔进行克隆。
[0075] 6、阻断单抗的筛选鉴定：
[0076]在包被有口蹄疫非结构蛋白3B-0VA合成肽抗原的包被板中加入稀释好的口蹄疫 非结构蛋白3ABC抗体阴、阳性血清，37°C温育lh，洗涤3次后加入初步筛选阳性孔细胞的上 清，37 °C温育lh，洗涤3次后加入稀释好的羊抗鼠 IgG-HRP，37 °C反应30min，洗涤3次，加入显 色液显色，终止反应之后，用酶标仪测每孔的读值，当加入阳性血清孔0D值低于加入阴性血 清孔0D值的一半左右时，此单抗即具有阻断效果的单抗，对此单抗进行连续三次克隆，得到 100 %表达口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阳性杂交瘤细胞株，该细胞分类命名：杂交瘤细胞株 4G6,保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC N0:C201639。
[0077] 7、单克隆抗体生产：
[0078] 用常规培养液培养上述鉴定阳性杂交瘤细胞株。大量生产单克隆抗体，可采用小 鼠体内诱生法。通过将上述得到的产生抗口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的杂交瘤细胞注入经 不完全弗式佐剂处理的雌性小鼠（6~8周龄)腹腔内，10天后收集腹水，离心除去固体成分， 其上清液即含有抗口蹄疫非结构蛋白3ABC的单克隆抗体。
[0079] 8、单克隆抗体的纯化：
[0080]抗体的纯化采用辛酸一硫酸铵法，具体如下：向一份预处理过的腹水中加入两份 0·06mo 1 /L(pH = 5·0)的乙酸缓冲液，用0· lmo 1 /L的盐酸调pH值至4.7。室温(20~25°C)搅拌 下在30min内逐渐滴加入辛酸（每毫升稀释前的腹水加33yL)，4°C静置2h，12000rpm离心 30min，弃沉淀。上清经滤纸过滤后调pH至7.4。在4°C冰浴下缓慢加入pH为7.4的饱和硫酸 铵，使硫酸铵最终饱和度不超过45%，搅拌30min，静置2~4h或4°C过夜。4°C下12000r/min 离心20min弃去上清。沉淀用0.01mol/L的PBS(pH=7.4)重悬，用pH为8.0的10mmol/L Tris-Hcl透析过夜。收集抗体后用分光光度计检测其浓度。
[0081 ] 9、单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：
[0082] 称取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于lmL双蒸水中，加500yL新配制的0.06m〇VL的 NaI04,4°C放置30min，勿超过此时间，此时溶液呈草绿色，加入0.5mL乙二醇(0.16mol/L)室 温(20~25°C)避光反应30min。再加入5mg/mL的纯化抗体lmL，在0.05M pH9.5的碳酸盐缓冲 液中4 °C透析过夜。吸出后加5mg/mL新配的NaBH4 0.2mL 4 °C放置2h，再加等体积的饱和硫 酸铵溶液，4 °C放置30min，7000r/min离心10min，弃上清，用生理盐水重悬，再在0.15M pH7.4的PBS中透析过夜。收集透析袋中标记的抗体进行工作浓度标定，然后分装(每个批次 的酶标抗体都要进行工作浓度标定）。
[0083]实施例3:试剂盒组成
[0084]试剂盒含96孔ELISA检测板2块，酶标抗口蹄疫非结构蛋白3ABC单克隆抗体1瓶 (20mL/瓶），阴、阳性对照各1管（1.5mL/管），样品稀释液1瓶(50mL/瓶），20倍浓缩洗涤液1瓶 (30mL/瓶），显色液A、显色液B、终止液各1瓶(10mL/瓶），附说明书1份。
[0085] 20倍浓缩洗涤液：160g氯化钠、10mL Tween-20溶于1000mL蒸馏水中。
[0086]封闭液:含5mg/mL BSA的磷酸盐缓冲液。
[0087] 样品稀释液:含0.5% (M/V)BSA的PBS缓冲溶液。
[0088]阳性对照、阴性对照的制备:将筛选获得的标准阳性血清按1000U/mL加入青霉素 和链霉素，无菌过滤，作为阳性对照;将筛选获得的标准阴性血清按l〇〇〇U/mL加入青霉素和 链霉素，无菌过滤，作为阴性对照。
[0089] 实施例4:
[0090] 一种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的检测方法，其步骤是：
[0091] 1)将待检血清按1:2比例稀释于血清稀释板中，吸取稀释好的样品液加入包被好 抗原的酶标板中，每孔加入100yL，37°C反应lh;
[0092] 2)次日，用洗涤液洗板5次，最后一次拍干；
[0093] 3)加入100yL酶标抗体，37 °C作用lh;
[0094] 4)取出酶标板，甩掉孔中溶液，