专利名称：离子交联的多糖微球体的生产方法
技术领域：
本发明涉及含有可离子交联的聚合物的微球体的生产方法以及进行该方法的系统。
本申请中，术语“可离子交联的聚合物”是指可溶性聚离子型聚合物，其与含有二价、多价(multivalent)或聚合型多价(polyvalent)离子的胶凝溶液接触时，能够即刻形成微溶性或不溶性凝胶，其中所述二价、多价或聚合型多价离子具有与可离子交联的聚合物相反的电荷。
可以在本申请中使用的聚离子型聚合物包括天然或合成来源的聚阴离子型和聚阳离子型聚合物。
在第一个实施方案中，聚离子型聚合物是可以通过二价、多价或聚合型阳离子交联的天然或合成聚阴离子。天然聚阴离子是例如含有羧酸或硫酸基团的多糖(例如藻酸，一些形式的角叉菜胶，结冷胶，果胶，硫酸纤维素和硫酸葡聚糖)。合成聚阴离子是例如聚(甲基)丙烯酸，聚苯乙烯磺酸盐及其共聚物，或聚磷腈类的聚合物。
在另一个实施方案中，可交联聚合物是可以通过多价或聚合型多价阴离子交联的天然或合成聚阳离子。天然聚阳离子是例如氨基官能化的多糖，例如壳聚糖，氨基-葡聚糖，或多肽，例如鱼精蛋白。合成聚阳离子是例如聚(烯丙胺盐酸盐)，聚(乙烯亚胺)，聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚酰胺-聚胺-表氯醇。
一组特别优选的可离子交联的聚阴离子型聚合物是阴离子型多糖，其是含有羧酸基团的单糖的共聚物，这里称作“阴离子型多糖”。阴离子型多糖在配方技术中有广泛的应用。很多阴离子型多糖的一个特别有用的特性是它们能够易溶作为游离酸和/或一价阳离子的盐的形式，同时与二价阳离子或聚合型多价阳离子接触时形成牢固的凝胶的能力。在本申请的范围内，将通过与二价或聚合型多价阳离子反应即刻形成凝胶的阴离子型多糖称作“可离子交联的阴离子型多糖”。
藻酸是一种天然存在的葡萄糖醛酸(G)及其C-5差向异构体甘露糖醛酸(M)的无支链二元共聚物。已经发现，G-和M-单元以嵌段的方式结合在一起。藻酸的盐通常称作藻酸盐。藻酸盐可从褐色海藻中大量提取。聚合物中G和M的比例以及G和M嵌段在聚合物中的分布取决于藻酸盐的来源(参见Carbohydrates in Europe 1996，14，6-31)。
在大多数应用中，藻酸盐凝胶形成是通过用钙离子实现的。然而，藻酸盐与大部分二价和多价阳离子形成凝胶。一价阳离子和Mg2+离子不引发胶凝，而诸如Ba2+和Sr2+的离子可产生比Ca2+更强的藻酸盐凝胶。凝胶强度取决于葡萄糖醛酸的含量，和还取决于G-嵌段中G-单元的平均数。
交联的藻酸盐可用作例如流变控制添加剂，伤口敷料或用于固定诸如植物细胞、哺乳动物细胞、酵母、细菌、疫苗或食物制品等材料。在大部分应用中，藻酸盐凝胶的形成通过使用钙离子来实现。
已开发了将生物材料固定在藻酸盐珠内的很多不同的方法。一种形成藻酸盐凝胶珠的常用方法是向胶凝离子(如氯化钙)的溶液中逐滴添加藻酸盐溶液。液滴的大小将决定球的尺寸。使用注射针来形成藻酸盐液滴。然而，珠尺寸的减小受到注射针直径和溶液粘度的限制。结果，难以产生直径小于1mm的珠。为使珠尺寸减小，曾尝试采用在针上的空气射流碰撞(Miyawaki等，Agric.Biol.Chem.1980，44，2865)、静电脉冲(EP 0 167 690 B1)或振动针(Hulst等，J.Chem.Technol.Biotechnol.1985，35B，198)。
需要具有约10μm平均直径的微球体，因为可以制成含有此粒度微球体的稳定的不沉积的悬浮液，并且因为具有10μm或更小直径的微球体可以被细胞所吸收，从而使药物在细胞内得到更有效的释放(D.T.O′Hagan，J.Anat.189，1996，477-482)。
藻酸盐溶液的细滴可以通过使用喷雾头来产生，例如，在US5,387,522和US 6,465,226中所公开的。通过上述方法可获得直径约200μm至约300μm的藻酸盐颗粒。
藻酸钙微球体还可以通过使用乳化方法来获得。Poncelet等，Appl.Microbiol.Biotechnol 1995，43，644描述了通过分散在植物油内的藻酸盐溶胶的乳化/内胶凝作用来产生藻酸盐微球体。藻酸盐溶胶内的胶凝作用通过降低pH以从不溶性配合物中释放钙来引发。获得了具有50-1000μm平均直径的藻酸盐微球体。
通过进一步优化乳化技术中各种操作和配制因素的影响，获得了直径约10μm的更细的藻酸盐微球体(D.Lemoine，等，InternationalJournal of Pharmaceutics 1998，176，9)。
生产藻酸盐微球体的乳化技术是使用油和/或有机溶剂。敏感的生物分子(蛋白质，酶)可能与油和/或有机溶剂不相容。从藻酸盐微球体中去除油和/或有机溶剂是一项冗长且不完善的过程。
因此，需要一种由可交联的阴离子型多糖制成的、具有约3-20μm尺寸的微球体的制备方法，该方法不使用任何油和/或有机溶剂。
意想不到地，已经发现，通过由水溶性阴离子型多糖的溶液产生细液体气溶胶滴，使其进入气体物流，随后将含有这些液滴的气体物流引入含有凝胶形成用阳离子的胶凝溶液中，可以完全不用油和/或有机溶剂来获得具有约3-20μm直径的交联的阴离子型多糖的微球体。
因此，本发明一方面涉及一种制备含有离子交联的聚合物的微球体的方法，该方法包括(a)通过采用超声雾化器，由含有可离子交联的聚离子型聚合物的溶液(3)产生液体气溶胶滴(13)，使其进入连续气体物流中；(b)将气体物流转移至含有二价、多价或聚合型多价离子的胶凝溶液(10)中，从而形成交联的聚合物微球体(14)；(c)将微球体从胶凝溶液中分离，和(d)非必需地，将微球体通过筛网过滤。
本发明另一方面涉及一种用于制备含有离子交联的聚合物的微球体的系统，该系统包括(a)位于雾化室(2)内的超声发生器(1)，其中雾化室(2)中填充有含可离子交联的聚合物的溶液(3)；
(b)与雾化室相连的散热器盘管(4)；(c)非必需地，用于使雾化室(2)内的气体-流体水平(5)保持在预定恒定水平的装置(6)；(d)与雾化室(2)相连的气体入口(7)；(e)用于胶凝溶液(9)的容器，其装配有搅拌装置(11)；和(f)与雾化室相连的转移管道(8)，其将雾化室和容器相连，其中管道适于浸没在胶凝溶液(10)中。
搅拌装置(11)选自已知的形成分散液或乳液的工具。优选的搅拌装置是超声。
附图简述
图1是本发明用于生产微球体的系统的示意图。
图2是通过本发明方法制备的藻酸盐微球体的粒度分布。
图3是通过本发明方法制备的藻酸盐微球体的图像，其中所选择的微球体的直径已被确定。
本系统的关键部件是超声雾化器。可以使用空调系统中用于空气增湿的设备。一种适宜的雾化器是例如空气增湿设备SCA 1000，由Stulz GmbH，D-22457汉堡制造。
优选，散热器盘管(4)与用于将待雾化溶液的温度保持在预定范围的装置相连。待雾化溶液的优选温度范围为15-50℃，特别是25-35℃。
优选，将连接雾化室(2)和容器(9)的管道尽可能深地浸在胶凝溶液(10)的浴中，以允许含有可交联聚合物的气溶胶滴(13)与胶凝溶液中的二价、多价或聚合型多价抗衡离子相互作用，形成交联的微球体(14)。还优选，浸没在胶凝溶液中的管道的下部包含分配孔(12)。
如上所述，本发明的方法可以针对不同的可离子交联的聚合物来进行。
优选的可交联天然聚阴离子选自藻酸、角叉菜胶、硫酸纤维素、硫酸葡聚糖、结冷胶(gellan)、果胶及其水溶性盐。最优选的阴离子型多糖是藻酸或其水溶性盐。特别优选的可交联天然聚阴离子是藻酸的Na+-、K+-、NH4+-和Mg2+-盐以及结冷胶、角叉菜胶和硫酸纤维素的Na+-、K+-和NH4+-盐。
优选，待雾化的含有可交联天然聚阴离子的液体(3)的浓度为0.1-5.0％重量，特别是0.75-1.5％重量。特别优选的待雾化的液体含有0.75-1.5％重量的低粘度藻酸钠。优选的可交联合成聚阴离子选自直链或支链聚丙烯酸、聚(甲基)丙烯酸、聚苯乙烯磺酸盐，聚磷腈类的聚阴离子及其共聚物和水溶性盐。
优选的可交联天然聚阳离子选自氨基官能化的多糖，例如壳聚糖、氨基-葡聚糖、多肽，例如鱼精蛋白、及其水溶性盐。
优选的可交联合成聚阳离子选自聚烯丙胺，聚(乙烯亚胺)，聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，聚酰胺-聚胺-表氯醇，(氨基-)葡聚糖，多肽及其水溶性盐。
气体物流可以通过加压空气产生。然而，其它气体，特别是惰性气体，例如氮气或氩气，也是非常合适的。气体应当在使用前经过纯化。
胶凝溶液中含有凝胶形成用二价或多价阳离子或阴离子、聚合型多价阳离子或阴离子的盐，例如聚阳离子或聚阴离子的水溶性盐，这取决于可交联聚合物的性质。
用于天然或合成聚阴离子的胶凝溶液中含有凝胶形成用二价、多价或聚合型多价阳离子的盐，其浓度为0.1％重量至饱和溶液。含有凝胶形成用二价或多价阳离子的盐的浓度优选为0.5-5％重量。凝胶形成用二价或多价阳离子是例如Pb2+，Be2+，Ca2+，Ba2+，Sr2+，Zn2+Cu2+，Mn2+，Co2+，Fe2+，Fe3+，Al3+和Sn4+。
在通过本发明方法形成藻酸盐微球体的情形中，优选采用选自Ba2+、Sr2+和Ca2+的凝胶形成用阳离子。用于交联藻酸盐的最优选的阳离子是Ca2+。
凝胶形成用聚合型多价阳离子是例如聚(烯丙胺盐酸盐)，聚(乙烯亚胺)，聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，聚酰胺-聚胺-表氯醇，壳聚糖，氨基-葡聚糖和硫酸鱼精蛋白。
用于天然或合成聚阳离子的胶凝溶液中含有凝胶形成用多价或聚合型多价阴离子的盐，其浓度为0.1％重量至饱和溶液。
凝胶形成用多价阴离子是例如磷酸根、硫酸根、柠檬酸根、草酸根、硼酸根。凝胶形成用聚合型多价阴离子是例如聚(甲基)丙烯酸，聚苯乙烯磺酸盐，葡聚糖硫酸盐。
应当理解的是，胶凝溶液需要根据具体的可交联聚合物的胶凝性能进行调整。本领域技术人员知道如何选择适宜的二价或聚合型多价阳离子或阴离子。
胶凝溶液优选基本上是含水的，但可以含有最多25％重量、优选0-10％重量的一种或多种助溶剂。适宜的助溶剂包括醇类，例如，乙醇，异丙醇，二醇和甘油；酯类，例如，乙酸乙酯；或酰胺类，例如，二甲基甲酰胺。
优选，胶凝溶液中含有最多1.0％重量、特别是0.05-0.15％重量的表面活性剂。适宜的表面活性剂是例如聚氧乙烯-脱水山梨糖醇(例如，TWEEN_)，聚氧乙基化二醇单醚，或含有氧化乙烯和/或氧化丙烯的嵌段共聚物的表面活性剂(例如，poloxamers或poloxamines)。一种特别优选的表面活性剂是聚(氧乙烯)20-脱水山梨糖醇单月桂酸酯(TWEEN_20)。
胶凝溶液中还可以含有聚电解质，用于通过表面涂布稳定交联的微球体。
通过本发明所述方法制备的藻酸盐微球体是具有低微米范围的无需采用乳液方法生产的第一种微球体。因而，不必使用可能会干扰生物分子或活体细胞的油或非极性有机溶剂。因此，无需随后冗长的纯化步骤来除去任何残余的油或非极性有机溶剂。
小的藻酸盐微球体可以添加至溶液中(例如果汁，药用滴剂)而不会沉积。因此，可以制备捕集在藻酸盐微球体内的药物的均相悬浮液。此外，如上所述，具有低于10μm平均直径的微球体可以被细胞所吸收，从而允许药物更有效地在细胞内释放。
除此之外，相比文献中描述的其它方法，通过本发明方法生产的微球体的粒度分布非常窄并且可再现(通常约2-15μm，平均直径约8μm)。
优选，通过本方法生产的微球体的≥95％具有3-20μm的直径。藻酸盐微球体的这种窄粒度分布保证了药物或生物分子更均匀填充和释放。对于受控药物释放而言，具有恒定的释放速率对于避免剂量过大或过低是非常重要的。为实现此，严格控制微球体的表面-体积比是必要的。表面-体积比由粒度分布所决定。因此，窄粒度分布可以导致可再现的表面-体积比并且最终导致受控的药物释放。
实施例制备藻酸盐微球体将藻酸钠(Sigma，来自褐色海藻macrocystis pyrifera(海藻)，低粘度)在超纯水中的1％wt溶液装填至根据图1所示系统的雾化室(2)中。调节散热器盘管(4)的温度，以便保持雾化室中的温度为25-30℃。将转移管道(8)浸入超声浴(35kHz)中，其中该超声浴中装填有1500ml胶凝溶液，其是5％重量的CaCl2和0.1％重量TWEEN 20(聚(氧乙烯)20-脱水山梨糖醇单月桂酸酯)于水中的溶液。调节加压空气，以便产生通过CaCl2浴的空气泡的微小物流。然后，将超声发生器开启30分钟。沉淀浴变浑浊，表明形成藻酸盐球体。为除去非常大的颗粒(其由转移管壁上的气溶胶滴冷凝而形成)，将藻酸盐-CaCl2混合物通过50μm滤布过滤。通过离心(10min，1000xg)和倾析上清液，将藻酸盐微球体与CaCl2浴分离。藻酸盐微球体的粒度经显微镜成像测定为在5-10μm之间(参加图3)。
用激光散射颗粒粒度分布分析仪(LA-910，来自Horiba，Ltd.Kyoto，日本)测定藻酸盐微球体的粒度分布。使用1.35折光指数来分析该藻酸盐微球体。超过90％的球体在5-13μm范围内，平均为8μm(图2)。
权利要求
1.一种制备含有离子交联的聚合物的微球体的方法，该方法包括(a)通过采用超声雾化器，由含有可离子交联的聚离子型聚合物的溶液(3)产生液体气溶胶滴(13)，使其进入连续气体物流中；(b)将气体物流转移至含有二价、多价或聚合型多价离子的胶凝溶液(10)中，从而形成交联的聚合物微球体(14)；(c)将微球体从胶凝溶液中分离，和(d)非必需地，将微球体通过筛网过滤。
2.权利要求1的方法，其中可离子交联的聚合物是聚阴离子型聚合物，和其中胶凝溶液含有聚合型多价阳离子。
3.权利要求2的方法，其中胶凝溶液中的聚合型多价阳离子选自聚(烯丙胺盐酸盐)，聚(乙烯亚胺)，聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，聚酰胺-聚胺-表氯醇，壳聚糖，氨基-葡聚糖和硫酸鱼精蛋白。
4.权利要求1的方法，其中可离子交联的聚合物是聚阴离子型聚合物，和其中胶凝溶液含有二价、多价或聚合型多价阳离子。
5.权利要求4的方法，其中聚阴离子型聚合物选自阴离子型多糖，直链或支链聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸盐。
6.权利要求5的方法，其中阴离子型多糖选自藻酸，角叉菜胶，硫酸纤维素，硫酸葡聚糖，结冷胶，果胶及其水溶性盐。
7.权利要求6的方法，其中阴离子型多糖是藻酸或其水溶性盐。
8.权利要求4-7任一项的方法，其中，在步骤(a)中，聚阴离子型聚合物的存在浓度为0.1-5.0％重量。
9.权利要求4-8任一项的方法，其中胶凝溶液中的离子是选自Pb2+，Cu2+，Ba2+，Sr2+，Cd2+，Ca2+，Zn2+，Co2+和Ni2+的金属阳离子。
10.权利要求9的方法，其中胶凝溶液中的金属阳离子选自Ba2+，Sr2+和Ca2+。
11.权利要求10的方法，其中胶凝溶液中的金属阳离子是Ca2+。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中胶凝溶液还含有最多1％重量的表面活性剂。
13.权利要求12的方法，其中表面活性剂的存在量为0.02-1.0％重量，优选0.05-0.15％重量。
14.权利要求12或13的方法，其中表面活性剂选自聚氧乙烯-脱水山梨糖醇和含有氧化乙烯和/或氧化丙烯的嵌段共聚物的表面活性剂。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中将步骤(a)中的可离子交联的聚离子型聚合物的溶液的温度保持在15-50℃，优选25-35℃。
16.权利要求4的方法，其中，步骤(a)中，溶液含有0.75-1.5％重量的低粘度藻酸钠，其中阳离子是Ca2+；和其中胶凝溶液含有0.05-0.15％重量的聚(氧乙烯)20-脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
17.一种用于制备含有离子交联的聚合物的微球体的系统，该系统包括(a)位于雾化室(2)内的超声发生器(1)，其中雾化室(2)中填充有含可离子交联的聚合物的溶液(3)；(b)与雾化室相连的散热器盘管(4)；(c)非必需地，用于使雾化室(2)内的气体-流体水平(5)保持在预定恒定水平的装置(6)；(d)与雾化室(2)相连的气体入口(7)；(e)用于胶凝溶液(9)的容器，其装配有搅拌装置(11)；和(f)与雾化室相连的转移管道(8)，其将雾化室和容器相连，其中调整管道以便浸没在胶凝溶液(10)中。
全文摘要
本发明涉及一种制备含有离子交联的聚合物的微球体的方法，该方法包括(a)通过采用超声雾化器，由含有可离子交联的聚离子型聚合物的溶液(3)产生液体气溶胶滴(13)，使其进入连续气体物流中；(b)将气体物流转移至含有二价、多价或聚合型多价离子的胶凝溶液(10)中，从而形成交联的聚合物微球体(14)；(c)将微球体从胶凝溶液中分离，和(d)非必需地，将微球体通过筛网过滤。
文档编号H01M4/02GK1933903SQ200580008977
公开日2007年3月21日 申请日期2005年2月22日 优先权日2004年2月23日
发明者S·卡默迈尔, T·默克尔, K·施密德, A·米勒 申请人:视觉股份公司