诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞诱导领域，尤其涉及诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 干细胞治疗被认为是临床上一种组织损伤修复的安全、有效的治疗方法。现有技 术中，以骨髓或脐血充间质干细胞作为创面修复材料的技术已有报道。但是，骨髓充间质干 细胞（BMSCs)存在病毒污染的隐患，且随着供者年龄增长，其细胞数量和扩增、分化能力出 现明显下降趋势，不适合批量制备。而来源于脐血或胎盘的充间质干细胞虽然可以克服上 述缺陷，却仅能在出生时保存，并非所有患者都能提供。从人体脂肪组织中分离出来的脂肪 间充质干细胞（ADSCs)可通过分泌多种生长因子，控制和调节临近的受损细胞，发挥重要 功能，而且ADSCs容易从吸脂的脂肪中获得，对患者创伤小，干细胞分离效率高，具有多能 分化的能力，因此ADSCs近年来已经成为种子细胞的研宄热点。
[0003] 但是，将ADSCs用于制备创面修复材料首先面临的问题就是分化。2008年有报道 称，利用脂肪干细胞于人脱细胞真皮基质复合，移植到裸鼠皮肤缺损处，发现植入的细胞向 血管内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞分化，并能有效促进创面愈合。而皮肤作为人体面积 最大的器官，发生大面积缺损或难愈合是现如今困扰临床工作着的一大难题，ADSCs无疑成 为种子细胞和支架材料的理想选择。现有技术中对ADSCs分化为表皮细胞的研宄较少，仅 有的研宄结果显示，ADSCs分化成为表皮细胞所需的时间约在20天左右，时间较为漫长。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种快速诱导脂肪干细胞分化为表 皮细胞的方法。
[0005] 在本发明的实施例中，诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞的方法：将脂肪干细胞于 EGF、bFGF、ATRA和IGF-I存在条件下诱导培养，得到表皮细胞。
[0006] EGF即为表皮生长因子，能够促进受损表皮的修复与再生。
[0007] bFGF为成纤维细胞生长因子，具有促进有丝分裂的作用，能够促进创伤组织愈合 与组织修复，促进组织再生。
[0008] ATRA为全反式维甲酸，是动物体内维生素A的代谢中间产物，能够促进上皮细胞 的分化与生长，维持上皮组织正常角化过程。
[0009] IGF-I为类胰岛素一号增长因子，能够促进有丝分裂和细胞分化。
[0010] 本发明采用EGF、bFGF、ATRA和IGF-I作为诱导剂，诱导脂肪干细胞分化称为表皮 细胞。实验表明，经过7天的诱导脂肪干细胞向表皮细胞分化，且与其他对照组相比分化速 度更快。而现有技术中，将脂肪干细胞分化为表皮细胞需要20天左右的时间。
[0011] 在一些实施例中，诱导培养的培养基为含有5wt% FBS的DMEM/F12培养基。
[0012] 在一些实施例中，EGF的浓度为15?25ng/mL ;bFGF的浓度为3?7ng/mL ;ATRA 的浓度为3?7 ymol/L ;IGF_1的浓度为3?7ng/mL。
[0013] 在一些实施例中，EGF的浓度为lOng/mL ;bFGF的浓度为5ng/mL ;ATRA的浓度为 5 ymol/L ;IGF_1 的浓度为 5ng/mL。
[0014] 本发明通过实验表明，生长因子的种类、浓度对脂肪干细胞成表皮分化速度的影 响十分显著，改变生长因子的种类或浓度会导致分化速度的下降。
[0015] 在一些实施例中，诱导培养的培养基中还包括地塞米松。
[0016] 在一些实施例中，地塞米松的浓度为0.01?0.2 ymol/L。
[0017] 在一些实施例中，地塞米松的浓度为0,1 ymol/L。
[0018] 地塞米松作为抗炎剂使用。
[0019] 在一些实施例中，脂肪干细胞在诱导培养前，经胰蛋白酶消化、融合。
[0020] 具体的，脂肪干细胞的胰蛋白酶消化、融合为：取第三代?第五代的脂肪干细胞， 加入质量分数为0. 25%胰蛋白酶和质量分数为0. 02% EDTA进行消化，以血清终止消化后 1200r/min离心5min，以DMEM/F12培养基重悬细胞，调整密度为I X 104/mL，培养至40 %? 50 %融合。
[0021] 在一些实施例中，诱导培养过程中每2天更换诱导培养基。
[0022] 在一些实施例中，诱导培养的时间为7d，温度为37°0,〇)2体积分数5%，饱和湿度 95%〇
[0023] 在一些实施例中，第三代?第五代的脂肪干细胞的制备方法包括：将脂肪组织经 PBS缓冲液冲洗，以胶原酶消化后，经离心取细胞沉淀后以脂肪干细胞完全培养基培养至 80 %融合，以胰蛋白酶消化后传代培养至第三代?第五代。
[0024] 在一些实施例中，诱导培养后，还包括扩增培养、传代的步骤。
[0025] 在一些实施例中，扩增培养、传代的培养基为表皮细胞无血清培养基SFM。
[0026] 在一些实施例中，扩增培养、传代过程中，每2天更换培养基。
[0027] 在一些实施例中，扩增培养、传代的条件为温度为37°C，0)2体积分数5%，饱和湿 度 95%。
[0028] 本发明提供的诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞的方法为将脂肪干细胞于EGF、 bFGF、ATRA和IGF-I存在条件下诱导培养，得到表皮细胞。经试验证明，采用本发明提供的 方法，培养7天后细胞形态发生明显改变，由梭形的脂肪干细胞变化为椭圆形或圆形，CKlO 的表达量升高11倍，CK19的表达量升高78倍，显著优于对照组。说明，采用本发明提供的方 法，诱导7天后能够成功将脂肪干细胞诱导分化称为成纤维细胞，且分化速度优于对照组。 继续扩增培养、传代过程中，细胞进一步的分化、扩增，从而能够获得更大量的表皮细胞。
【附图说明】
[0029] 图1示原代培养脂肪干细胞的倒置显微镜（100X)观察结果，其中，图1-a示原代 培养48h后观察结果；图1-b示原代培养5天后观察结果；
[0030] 图2示流式细胞仪检测扩增培养至第三代的脂肪干细胞表面抗原表达情况；
[0031] 图3示脂肪干细胞成表皮细胞诱导培养后以倒置显微镜放大40倍观察细胞形态 结果；其中图3-a示诱导培养前脂肪干细胞形态，图3-b示实验组细胞诱导培养后形态；图 3-c示对照组1细胞诱导培养后形态；图3-d示对照组2细胞诱导培养后形态；图3-e示对 照组3细胞诱导培养后形态；图3-f?示对照组4细胞诱导培养后形态；
[0032] 图4示免疫荧光染色检测诱导分化后细胞CK19的表达情况；其中，图4-a示实验 组细胞CK19表达情况；图4-b示对照组1细胞CK19表达情况；图4-c示对照组2细胞CK19 表达情况；图4-d示对照组3细胞CK19表达情况；图4-e示对照组4细胞CK19表达情况。
【具体实施方式】
[0033] 本发明提供了诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴 本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技 术人员来说是显而易见