一种提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法，属于基因工程领 域。
【背景技术】
[0002] 氧化葡萄糖酸杆菌是维生素C经典两步发酵法的生产菌株之一，也是目前维生素 C一步发酵法研宄最具潜力的菌株。为了探宄该菌维C相关代谢网络及有效利用各种代 谢工程，基因工程等手段改造氧化葡萄糖酸杆菌，尤其是基因组改造，同源重组效率不可忽 视。传统的基因工程模式菌株，如大肠杆菌，酿酒酵母，同源重组效率都很高。而氧化葡萄 糖酸杆菌的同源重组效率非常低下，严重阻碍了对氧化葡萄糖酸杆菌基因组水平的改造。
[0003] Red重组酶系统来源于A噬菌体，包括Exo、Beta、Gam三种蛋白，各蛋白协同作 用可指导同源重组过程。本发明将外源Red重组酶引入氧化葡萄糖酸杆菌（G.oxydans WSH-003)，得到重组菌G. oxydans WSH-003/Red，并转入同源片段进行同源重组。经验证， G. oxydans WSH-003/Red重组效率相比野生菌有了极大提高。此外，本发明以片段作为同源 臂供体，利用外源重组酶辅助氧化葡萄糖酸杆菌同源重组改造。证明外源Red重组酶参与 并有效促进了氧化葡萄糖酸杆菌的同源重组过程，并且以片段作为同源臂供体相对于质粒 载体更加简化。这对氧化葡萄糖酸杆菌甚至葡萄糖酸杆菌属基因组改造都均有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的第一个问题是提供一种同源重组效率提高的氧化葡萄糖酸杆菌 工程菌，是表达了外源Red重组酶。
[0005] 在本发明的一种实施方式中，编码所述Red重组酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，将携带编码Red重组酶的重组载体PKD46转入氧化 葡萄糖酸杆菌，获得所述氧化葡萄糖酸杆菌工程菌。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述重组载体pKD46的构建是以质粒pINT-ts为 载体，通过酶切连接的方法，将来源于噬菌体的y、e、ex〇三个基因置于ParaB启动子 控制之下° 具体参见 One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 2000Jun 6 ；97 (12):6640-5. DatsenkoKA,WannerBL0
[0008] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述同源重组效率提高的氧化 葡萄糖酸杆菌工程菌的方法，是将编码Red重组酶的基因连接表达载体后转入氧化葡萄糖 酸杆菌。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，是将携带编码Red重组酶的重组载体PKD46通过电 转化方法导入氧化葡萄糖酸杆菌。
[0010] 所述电转条件：1800V电场强度，200 D电阻和25 y F电容。电转后涂布于氨苄青 霉素抗性山梨醇培养基平板，通过控制培养温度（30°C )和抗性浓度（50 yg/ml)筛选重组 菌 G.oxydans WSH-003/Red〇
[0011] 所述山梨醇培养基（g/L):山梨醇15,酵母粉1. 0, pH 4. 8?5. 1，琼脂20 (固体培 养基），121°C 灭菌 15min。
[0012] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述同源重组效率提高的氧化 葡萄糖酸杆菌工程菌进行同源重组（敲除）的方法，所述方法主要包括（1)分别截取目标 基因序列上游SOO-IOOObp和下游SOO-IOOObp作为上游同源臂和下游同源臂，（2)设计引 入酶切位点的融合PCR引物，扩增并融合上下游同源臂，（3)标记基因通过酶切连接插入上 下游同源臂之间，构建得到重组用的同源片段，（4)将同源片段转化氧化葡萄糖酸杆菌工程 菌，利用标记基因筛选得到目标菌株。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述标记基因包括卡那基因（kana)和胞嘧啶脱氨 酶基因（codBA)，分别来自质粒pBBRMCS-2和大肠杆菌（E. coli K12)基因组。
[0014]目前用于氧化葡萄糖酸杆菌大规模基因同源重组的手段极其有限，本发明提供的 提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法，将为利用同源重组进行多基因敲除或整合提 供有效途径。此外，现有氧化葡萄糖酸杆菌同源重组主要是基于载体利用野生菌本身的重 组系统进行同源重组，本发明通过外源引入同源重组酶并采用同源片段进行同源重组，简 化了质粒构建过程，有效提高了同源重组效率。
【附图说明】
[0015] 图1为同源片段构建过程
【具体实施方式】
[0016] 实施例 1 质粒 pKD46 导入 G. oxydans WSH-003
[0017] 通过电转化将pKD46导入G. oxydans WSH-003。具体过程分三步：
[0018] 1.电转感受态制备：
[0019] 1)取G. oxydans WSH-003甘油管在山梨醇平板上划线，30°C培养24-48h至可辨别 单菌落；
[0020] 2)挑取一个单菌落接入装有25ml山梨醇液体培养基的250ml三角瓶中，30°C、 220rpm 预培养 24-36h，至 0D_>2 ;
[0021] 3)取2. 5ml预培养的菌液接入装有25ml山梨醇培养基的250ml三角瓶中，30°C、 220rpm 培养 6-8h 后测 0D_，至 OD6tltl到 1. 6-1. 8 ;
[0022] 4) 4°C 下 5000rpm 离心 5min，去上清；
[0023] 5)将菌体置于冰上，加20ml预冷却至0°C的10%甘油溶液重悬菌体，使菌体充分 扩散；
[0024] 6) 4°C，5000rpm 离心 5min，去上清；
[0025] 7)重复步骤5)和6);
[0026] 8)将菌体置于冰上，加0. 5ml预冷的10%甘油溶液，轻微混匀；
[0027] 9)按每管100 y 1进行分装至I. 5ml离心管，保持冰浴状态。分装后以_80°C保存。
[0028] 2?转化 pKD46
[0029] 1)在冰上预冷纯化后的质粒pKD46和0,1cm电转化杯，同样将感受态置入冰中融 化；
[0030] 2)把5 y 1质粒PKD46 (质粒浓度50-100ng/ y 1)加入细胞并用微量移液器进行轻 柔混合（避免引入气泡），冰浴30min;
[0031] 3)将该混合物加入预冷的电转杯中（放入之前应将电转杯外壁水珠擦拭干净）；
[0032] 4)按照Bio-Rad电转仪的说明进行电转化，1800V电场强度，200 D电阻和25 y F 电容；
[0033] 5)电激结束，立即加入400 y