一种重组利迪链霉菌及其应用
【专利说明】-种重组利迪链霉菌及其应用
[0001] 本申请是申请号为201210579816. 5、申请日为2012年12月27日、发明创造名称 为"产纳他霉素的重组利迪链霉菌及其构建方法与应用"的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及基因工程菌及其构建方法与应用，特别涉及一种重组利迪链霉菌及其 应用。
【背景技术】
[0003] 随着农作物种植结构的调整和栽培方式的变化，许多作物真菌性病害的发生和 危害日趋严重，如甘蓝枯萎病（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)、小麦纹枯病菌 (R. cerealis)、桃褐腐病菌（M. fructicola)、苹果轮纹病菌（B. berengeriana)、百合根腐 病菌（F. oxysporum)等病原菌的危害也十分严重（耿丽华等，2009)。一般的化学农药都难 以凑效，且频繁使用增加了病原菌的抗药性，污染了生态环境，因此亟待开发新的、环境友 好型的高效微生物农药已成为近年病害生防领域的一大热点。
[0004] 纳他霉素（natamycin)是一种多烯大环内酯类抗生素，也称匹马菌素或游霉 素（Pimaricin),分子式为C 33H47O13。研究报道natamycin对几乎所有的酵母菌、霉菌 具有抗性，是一种极具有潜力的广谱抗菌剂，能够显著抑制甘蓝枯萎病菌（F. oxysporum f.s.conglutinans)、苹果轮斑病菌（A.mali)、辣椒灰霉病菌（B.cinerea)、葡萄灰霉病菌 (13.(3；[116代3)、黄瓜枯萎病菌（?.；^8。.01101111161'；[1111111)、爺子早疫病菌（4.801311；0、番爺灰 霉病菌（B.cinerea)、桃褐腐病菌（M. fructicola)、李子褐腐病菌（M. fructicola)等病 原菌的生长，并且不易产生抗药性，在防治植物真菌病害方面显示了良好的应用前景（te Welscher et al.，2008 ;Du et al.，2009;隋勤等，2007)。此外，natamycin 作为食品防腐 剂是我国批准使用仅有的2种食品生物防腐剂之一（另一个是乳酸链球菌素，Nisin)，还被 应用于临床医疗，用于治疗真菌引起的皮肤和粘膜感染等（Davidson andDoan, 1993;程良 英，2010)。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的一个技术问题是提供纳他霉素产量高的重组利迪链霉菌及其 构建方法。
[0006] 本发明所提供的构建重组利迪链霉菌的方法，包括将纳他霉素合成正调控基因导 入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到纳他霉素产量高于所述宿主菌的重组利迪链霉菌 的步骤；
[0007] 所述纳他霉素合成正调控基因编码如下a)或b)的蛋白质：
[0008] a)氨基酸序列如SEQ ID Nol所示的蛋白质；
[0009] b)将SEQ ID No. 1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与 纳他霉素合成相关的由a)衍生的蛋白质。
[0010] 其中，SEQ ID No. 1由192个氨基酸残基组成。
[0011] 上述方法中，所述纳他霉素合成正调控基因的编码序列为SEQ ID No.2的第 433-1011位。所述纳他霉素合成正调控基因的序列具体可为SEQ ID No. 2的第14-1011 位。
[0012] 其中，SEQ ID No. 2由1019个核苷酸组成，第1-13位为NdeI识别位点和保护碱 基，第14-432位为红霉素抗性基因启动子，第433-1011位为纳他霉素合成正调控基因的编 码序列，第1012-1019为EcoRI识别位点和保护碱基。
[0013] 上述方法中，所述将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌包括 如下步骤：将所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体导入大肠杆菌中得到重组大肠杆 菌，再将所述重组大肠杆菌与所述作为宿主菌的利迪链霉菌进行双亲接合获得所述重组利 迪链霉菌；所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体中，启动所述纳他霉素合成正调控基 因的启动子是红霉素抗性基因启动子。
[0014] 在本发明的一个实施例中，所述红霉素抗性基因启动子的核苷酸序列是SEQ IDNo. 3。
[0015] 其中，SEQIDNo. 3由199个核苷酸组成。
[0016] 在本发明的实施例中，所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体为将所述纳他霉 素合成正调控基因插入PIB139的所述红霉素抗性基因启动子下游得到的重组表达载体， 具体是将SEQ ID No. 2所示的DNA片段经NdeI和EcoRI酶切后插入pIB139的NdeI和 EcoRI位点得到的重组表达载体pIB139-slnM。
[0017] 在本发明的实施例中，所述作为宿王囷的利迪链霉囷可为利迪链霉 菌（Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654，所述大肠杆菌为去甲基化 E.coliET12567(pUZ8002)〇
[0018] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供由上述任一种方法得到的重组利迪链 霉菌。
[0019] 所述重组利迪链霉菌具体可为利迪链霉菌AM02,其在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 6815。
[0020] 本发明所要解决的再一个技术问题是提供所述重组利迪链霉菌的用途。
[0021] 本发明所提供的用途是下述1)或2)或3):
[0022] 1)所述重组利迪链霉菌在生产那他霉素中的应用；
[0023] 2)所述重组利迪链霉囷在制备植物病原真囷抑制剂中的应用；
[0024] 3)所述重组利迪链霉菌在抑制植物真菌病害中的应用。
[0025] 上述应用中，所述植物病原真菌为下述至少一种：甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. niveum);所述植物 真菌病害为下述至少一种：由甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)引 起的病害和由西瓜枯萎病菌（F. oxysporum f.sp. niveum)引起的病害。
[0026]实验证明，利迪链霉菌（Streptomyces lydicus) AM02CGMCC No. 6815 纳他 霉素产量在YEME培养基上约是野生型菌株利迪链霉菌（Streptomyces lydicus) A02CGMCCNO. 1654的3倍（图3)，在发酵培养基上约是野生型菌株利迪链霉菌 (Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654 的 2 倍（图 4)。利迪链霉菌（Streptomyces 1丫(1;[(3118)4]\10206]\0^1^〇.6815对甘蓝枯萎病菌（？11831'；[11111(?5^口01'11111；1^8口.（301^1111:;[仙118) 的抑菌活性是利迪链霉菌（51:代。1:01115^8 17(1;[(3118)40206]\1(1^〇.1654的1.8倍，对西瓜枯 萎病菌（F. oxysporum f. sp. niveum)的抑菌活性是利迪链霉菌（Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654的2. 2倍。本发明的重组利迪链霉菌，具有比野生型显著提高的产纳他 霉素和抑菌能力，由于纳他霉素可以作为食品保鲜剂及饲料添加剂，因此，本发明的重组利 迪链霉菌可以应用于食品、生物能源及饲料添加等方面。
[0027] 生物材料信息
[0028]分类命名：利迪链霉菌（Streptomyces lydicus)
[0029] 菌株编号：AM02
[0030] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0031] 保藏机构简称：CGMCC
[0032] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0033] 保藏日期：2012年11月12日
[0034] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 6815
[0035] 下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
【附图说明】
[0036]图 1 为 pIB139_slnM 的 NdeI 和 EcoRI 酶切结果。
[0037] 其中，泳道M为DNA分子量标准，1为pIB139_slnM。
[0038] 图2为阿泊拉霉素抗性PCR验证转化子的电泳图谱。
[0039]图 3 为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus) AM02 和利迪链霉菌（Streptomyces lydicus) A02在YEME培养基中的纳他霉素产量比较。
[0040]图 4 为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus) AM02 和利迪链霉菌（Streptomyces lydicus) A02在发酵培养基中的纳他霉素产量比较。
[0041]图 5 为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus) AM02 和利迪链霉菌（Streptomyces lydicus)A02的抑菌活性比较。
[0042] A中的病原菌为甘蓝枯萎病菌，左侧为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus)A02 对甘蓝枯萎病菌的抑菌圈，右侧为利迪链霉菌（Str印tomyces lydicus) AM02对甘蓝枯萎病 菌的抑菌圈。
[0043] B中的病原菌为西瓜枯萎病菌，左侧为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus)A02 对西瓜枯萎病菌的抑菌圈，右侧为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus) AM02对西瓜枯萎病 菌的抑菌圈。
[0044] 图6A为利迪链霉菌活性产物的HPLC第一次分离谱图。
[0045] 图6B为利迪链霉菌活性产物的HPLC第三次分离谱图。
[0046]图7为纳他霉素样品的紫外扫描图谱。
[0047] 图8为纳他霉素样品的红外吸收光谱。
[0048] 图9A为纳他霉素样品的高分辨质谱图（负离子）。
[0049] 图9B为纳他霉素样品的高分辨质谱图（正离子）。
[0050] 图10A为纳他霉素样品的核磁共振碳谱（500MHz)。
[0051] 图IOB为纳他霉素样品的核磁共振氢谱（500MHz)。
【具体实施方式】
[0052] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0053] 下述实施