r>[0081] 实施例6 1材料与方法 1. 1材料 1. 1. 1主要器材 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、羟基磷灰石（HAP) (Sigma公司）；羊抗鼠IgG-HRP、牛 血清蛋白、S印hadexG-25 (生兴生物技术（南京）有限公司）;硫酸铵、邻苯二胺0PD、PBST (淮安国药化学试剂有限公司，AR);DEAE纤维素DE-52、透析袋(南京森贝伽生物科技有限公 司）;全自动酶标仪StatFax3200(Awareness公司）;微量移液枪NichpetEX(日本NICHIRY0 公司）；紫外可见光分光光度计UV2300(上海天美科学仪器有限公司）；可拆卸酶标板（上 海天呈医流科技有限公司产品）。
[0082] 1. 1. 2供试动物与菌株 6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠、健康雄性新西兰大白兔(复旦大学医学院实验动物中 心）；产TDH毒素副溶血弧菌ATCC33846、副溶血弧菌1. 2164 (上海海洋大学食品安全实验 室提供）；金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特杆菌、非致病性副溶血弧菌(编号 江苏财经职业技术学院微生物实验室保藏）；大黄鱼、带鱼、对虾、鲈鱼等海产品(购 于淮安市永辉超市)。
[0083] 1. 2方法 1. 2. 1TDH-PAb与KrPAb的制备 选购6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠，饲养观察1周无异样后，从眼球采血，与TDH毒素 做试管凝集试验，无凝集反应者用于制备阴性血清，-20°C保存。取一定量纯化后IDH毒素 分别于等量的弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂充分结合后，分多次、剂量递增的方法腹腔 分别注射两组小鼠，基础免疫采用结合弗氏完全佐剂的4呢IDH，随后每隔2周进行1次加 强免疫(免疫剂量见表6)，每隔2周进行1次鼠眼球采血0. 5ml，测定免疫血清效价，在最后 一次免疫结束后一周，眼球大量采血，血液移至4°C冰箱过夜，取上清液，于3000r/min离心 lOmin，制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清，置-20°C冰箱保存。KfPAb的制备可采用现有 常规方法。
[0084] 表6TDH毒素免疫BALB/c小鼠进稈 1. 2. 2DAS-ELISA法检测流程
包被TDH-PAb-洗涤、拍干一封闭一洗涤、拍干一加待测样品（或TDH毒素抗原）一洗 涤、拍干一加KfPAb-洗涤、拍干一加酶标二抗一洗涤、拍干一加底物一洗涤一加终止液 -测定〇D492值。
[0085] 1. 2. 3DAS-ELISA法最适工作条件的确定 1. 2. 3. 1棋盘滴定法选择TDH-PAb最适包被浓度和TDH抗原最适工作浓度 将制备好的待包被的IDH-PAb免疫血清，由1:1000倍比稀释至1:32000,包被至酶标 板上，50°C烘干后，5%的小牛血清封闭抗原，37°C恒温恒湿孵育3h，按3lVml、6lVml、9lV ml、12Pg/ml、15Pg/ml、18Pg/ml浓度加入100W的用PBS稀释的TDH毒素抗原，同时以PBST 和阴性血清分别设置空白对照和阴性对照，封板37°C，恒温恒湿孵育2h后，洗涤、拍干，每 孔加入1:2000的KrPAb免疫血清，37°C恒温恒湿孵育2h，洗涤、拍干，每孔加入100W的 1 :1000 (说明书推荐用量）的山羊抗兔IgG-HRP，37°C孵育lh，洗涤、拍干，每孔加入100W 的OPD底物，30°C恒温避光反应20min，每孔加入50W2mol/L的硫酸终止酶反应，酶标仪
中测定〇D492值，按公￥ 计算P/N值，以0D492接近于1. 0,P/N 值较大的抗原、抗体浓度作为最佳的TDH-PAb最适包被浓度和TDH毒素工作浓度。
[0086] 1. 2. 3. 2捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原最适反应时间选择 将捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原稀释至1. 2. 3. 1确定的最适工作浓度，反应时间 设置为l〇min，20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min，其他反应条件和操作同 1. 2. 3. 1，选择0D492值不变化的最短时间作为捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原最适反应时间。
[0087] 1. 2. 3. 3酶标板封闭时间选择 采用1. 2. 3. 1、1. 2. 3. 2确定的最适TDH-PAb包被浓度、TDH抗原浓度及抗原抗体最适反 应时间，设置封闭时间分别为 20min，40min，60min，80min，lOOmin，120min，150min，180min， 其他反应条件和操作同1. 2. 3. 1，DAS-ELISA试验后测定0D492值，选择OD492值不变化的最 短时间为最佳封闭时间。
[0088] 1. 2. 3. 4检测抗体KrPAb最适工作浓度的选择 采用1. 2. 3. 1~1. 2. 3. 3确定的最适TDH-PAb包被浓度、TDH抗原浓度和封闭时间，将KfPAb由1:1000倍比稀释至1 :32000,每孔加入100W上述稀释液，其他反应条件和操作 同1. 2. 3. 1，DAS-ELISA试验后测定0D492值，以0D492接近于1. 0,P/N值较大的KrPAb稀 释度作为其最佳工作浓度。
[0089] 1. 2. 3. 5检测抗体KfPAb与TDH抗原最适反应时间的选择 采用1. 2. 3. 1~1. 2. 3. 4确定的最佳工作条件，反应时间设置为20min，30min，40min， 50min，60min，70min，80min，90min其他反应条件和操作同1. 2. 3. 1，选择0D492值不变化的 最短时间作为检测抗体KfPAb与TDH抗原的最适反应时间。
[0090] 1. 2. 3. 6山羊抗兔IgG-HRP与检测抗体KfPAb最适反应时间选择 采用1. 2. 3. 1~1. 2. 3. 5确定的最佳工作条件，分别设置山羊抗兔IgG-HRP与KfPAb反应时间为 30min，40min，45min，50min，60min，65min，70min，山羊抗兔IgG-HRP的稀释度 采用商品推荐最佳浓度1:1〇〇〇,其他反应条件和操作同1. 2. 3. 1，DAS-ELISA试验后测定 〇D492值，选择0D值不变化的最短时间为山羊抗兔IgG-HRP与KfPAb反应时间选择最佳反 应时间。
[0091] 1. 2. 4DAS-ELISA法灵敏度试验 将TDH抗原浓度设置 3)^g/ml、4)^g/ml、5)^g/ml、6)^g/ml、7)^g/ml，8)^g/ml、lOl^g/ml、12Kg/ml，采用1. 2. 4所确定的最适工作条件进行DAS-ELISA试验，以P/N彡2. 1作为阳性判定标 准，确定本法对TDH毒素的最低检测限。
[0092] 1. 2. 5DAS-ELISA法特异性试验 将致病性的金黄色葡萄球菌，沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特杆菌和非致病性副溶血弧菌K舛~5菌株作为供试菌株，于细菌增菌液中37°C摇床培养24h后，培养液于10000r/min离 心lOmin，分别取各供试菌上清液和lOPg/mL的TDH溶液作为检测样品，采用1. 2. 4所确定 的最适工作条件进行DAS-ELISA试验，阳性判定标准为P/N多2. 1，判定DAS-ELISA法的检 测准确度。
[0093] 1. 2. 6DAS-ELISA法检测食品中副溶血弧菌IDH 以无菌操作称取25g食品样品，加入225mL的0. 01mol/L，pH7. 4的磷酸盐缓冲液，置 于灭菌均质杯中均质，制成样品均液（1:10)。样品均液于l〇〇〇〇r/min离心lOmin，取上清 夜进行DAS-ELISA检测。同时按照食品安全强制性国标方法GB4789. 7-2013进行检验，比 较DAS-ELISA检测的准确性。
[0094] 2结果与分析 2. 1捕获抗体TDH-PAb最适包被浓度和TDH抗原最适工作浓度和反应时间的确定 由表7可以看出，能满足0D492接近于1. 0,P/N值具有一定规律行的有两组抗原-抗 体，分别是TDH浓度为12Pg/ml和15Pg/ml的两组。当TDH浓度为12Pg/ml时，TDH-PAb稀 释度在1:4000和1:8000下的0D492均在1左右，但1:8000的P/N值为19. 72大于1:4000 的P/N值15. 36,当TDH浓度为121^/ml时，与其反应最适合的TDH-PAb稀释度为1:8000 ; 当TDH浓度为15Pg/ml时，TDH-PAb稀释度在1:4000和1:8000下的0D492均在1左右，但 1:4000的P/N值为17. 12大于1:8000的P/N值11. 23,当TDH浓度为12Pg/ml时，与其反 应最适合的TDH-PAb稀释度为1:8000 ;本研究选取两组中的P/N较大的一组作为TDH-PAb 最适包被浓度和TDH抗原最适工作浓度的确定，也即捕获抗体TDH-PAb的最适包被浓度为 1:8000,TDH抗原最适工作浓度为12Pg/ml。
[0095] 表7棋盘滴定法选择TDH-PAb最适包被浓度和TDH抗原最适工作浓度
注：表中第一行数据为〇D492值，第二行数据为P/N值。
[0096] 图5显示，反应时间在10~60min，随着时间的延长0D492值呈明显上升趋势，说明此 过程中捕获抗体TDH-PAb正与TDH抗原发生反应。而在60min以后，0D492均在1. 2左右，且 基本维持不变，说明此时捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原已反应完全，因此我们确定捕获抗体 TDH-PAb与TDH抗原最佳反应时间为60min。
[0097] 2. 2酶标板封闭时间的确定 图6显示，封闭时间在20-80min，随着时间的延长0D492值下降显著，说明此阶段，小牛 血清正在封闭酶标板多余的孔隙。而在80min以后，0D492均在1. 0左右，且基本维持不变， 说明此时酶标板孔隙已经被封闭完全，因此我们确定酶标板的最佳封闭时间80min。
[0098] 2.3检测抗体KrPAb最适工作浓度的确定 从表8可以看出，KrPAb的稀释度为1:4000和1:8000时，对应的0D492值均在1. 0左 右，而稀释度1:4000对应的P/N为18. 11远高于1:8000的P/N值11. 45,固选择了 1:4000 作为检测抗体KfPAb的最适工作浓度。
[0099] 表8检测抗体KrPAb最适工作浓度的选择
2. 4检测抗体KfPAb与TDH抗原最适反应时间的选择 图7显示，反应时间在20~40min，随着时间的延长0D492值呈上升趋势不明显，可能检测 抗体处于识别TDH抗原阶段。而在20~40min之间，0D492显著升高，说明抗原抗体正在迅速 反应。而在70min以后，0D492均在1. 2左右，且基本维持不变，说明此时抗原抗体反应完全， 因此我们确定检测抗体KrPAb与TDH抗原最佳反应时间为70min。
[0100] 2. 5山羊抗兔IgG-HRP与检测抗体KfPAb最适反应时间确定 图8显示，反应时间在30-55min，随着时间的延长0D492值呈明显上升趋势，说明此过