程 中酶标二抗正与KrPAb发生反应。而在50min以后，0D492均在1. 2左右，且基本维持不 变，说明此时酶标二抗与检测抗体反应完全，因此我们确定山羊抗兔IgG-HRP与检测抗体 KrPAb的最佳反应时间为55min。
[0101] 2.6DAS-ELISA法检测灵敏度 由表9可以看出，从TDH毒素浓度为6l^g/ml开始升高后，检测结果均呈现阳性，说明本 法的最低检测限度为6|ag/ml，换算成试剂食品样品检测的最低限度应该为60l^g/g。
[0102] 表9DAS-ELISA法检测灵敏度
2. 7DAS-ELISA法特异性 图9结果显示，两株致病性副溶血性弧菌P/N值显著大于2. 1，呈现强阳性，而非致病 性的副溶血弧菌K舛-4,致病性的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特杆菌的P/ N值明显低于2. 1，呈现阴性，说明DAS-ELISA法具有很强的特异性，检测准确度高。
[0103] 2. 8DAS-ELISA法检测食品中致病性副溶血弧菌 表10结果显示，运用DAS-ELISA法检测食品中致病性副溶血弧菌与GB4789. 7-2013 检测结果符合率基本为100%，在大黄鱼样品检测中，国标方法法有一个样品未检出，原因 可能是水产品中一些死亡的或者未可培养状态菌，国标法无法检测出，而DAS-ELISA法检 测的对象是TDH毒素不是菌体，因此检测结果不受未可培养状态菌的影响。总体来看， DAS-ELISA检测法准确、可靠。
[0104] 表10DAS-ELISA法检测食品结果
3结论 本研究以TDH+副溶血弧菌菌体及其TDH毒素制备免疫原，分别免疫新西兰大白兔 和BALB/c小鼠，制备了兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清和鼠抗TDH毒素多克隆抗体， 以鼠抗TDH毒素多克隆抗体为捕获抗体，兔抗副溶血弧菌多克隆抗体为检测抗体，建立 DAS-ELISA检测法，该法的检测参数如下：捕获抗体鼠抗TDH多克隆抗体的包被浓度为 1:8000,TDH毒素抗原的最佳工作浓度为12Pg/mL，检测抗体兔抗副溶血弧菌多克隆抗体的 最适工作浓度为1:4000,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000,检测总时间为5h，该法具有很 强的特异性，对食品中TDH毒素的检测低限为60|ag/g。
【主权项】
1. 快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的试剂盒，其特征在于：包括： 酶标板：包被捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清； TDH标准稀释液：副溶血性弧菌TDH毒素； 阴性对照：兔抗副溶血弧菌阴性血清； 检测抗体：兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清； 酶标二抗：山羊抗兔IgG-HRP ; 空白对照液：〇. Olmol/L、pH7. 4的磷酸盐缓冲液； 洗涤液：含0. 05%吐温-20的0.0 lmol/L、pH7. 4的磷酸盐缓冲液； 底物溶液：包括A瓶和B瓶，A瓶为含4mg/100mL的邻苯二胺、pH5. 0磷酸盐-柠檬酸 缓冲液；B瓶为质量百分比浓度30%的H2O2; 终止液：2mol/L H2SO402. 根据权利要求1所述的快速检测食品中副溶血性弧菌IDH毒素的试剂盒，其特征在 于：所述鼠抗IDH毒素多克隆抗体血清的制备方法，包括以下步骤：将副溶血性弧菌TDH毒 素分别与等量的弗氏不完全佐剂、等量的弗氏完全佐剂充分结合后，分多次、剂量递增的方 法腹腔分别注射两组小鼠；基础免疫采用结合弗氏完全佐剂的4呢IDH，随后每隔2周进行 1次加强免疫，制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清。3. 根据权利要求1所述的快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的试剂盒，其特征 在于：所述兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清的制备方法，包括以下步骤：在〇. 05%甲醛、 35°C下将产TDH毒素的致病性副溶血性弧菌灭活2 h制得菌体抗原，分多次、剂量递增进耳 静脉注射；免疫，免疫浓度为IOsCFlVmL ;在最后一次免疫结束后一周，耳动脉大量采血，即 得兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清。4. 根据权利要求1所述的快速检测食品中副溶血性弧菌IDH毒素的试剂盒，其特征在 于：兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清的稀释度为1:4000~1:8000 ;所述山羊抗兔IgG-HRP 的稀释度为1:1〇〇〇。5. 根据权利要求1所述的快速检测食品中副溶血性弧菌IDH毒素的试剂盒，其特征在 于：所述副溶血性弧菌IDH毒素的制备方法，包括以下步骤： TDH毒素粗品的制备：将产TDH毒素的副溶血弧菌接种于氯化钠碱性蛋白胨水溶液中 在摇床中扩大培养后，离心去除菌体，上清液中加入（NH4)2S04，静置盐析以充分沉淀TDH毒 素；高速离心，沉淀溶解在PBS溶液中，透析，即得TDH毒素粗品； TDH毒素粗品的纯化： DEAE-纤维素离子交换柱层析：将步骤（1)制得的得TDH毒素粗品缓慢滴加到DEAE-纤 维素离子交换柱中，用IL含0? 2mol/L的NaCl的PBST溶液洗脱，再IL用含0? 2~1. Omol/L NaCl的PBS溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液；加入固体（NH4)2SO 4盐析，沉淀用PBS溶解后， 透析过夜； HAP柱层析：将步骤（2. 1)的透析液滴加到HAP柱上，用0. 5L的含0. lmol/L NaCl的 PBS液（pH7. 0)洗脱，再用0. 8L的0. 1~0. 3mol/L的PBS液（pH7. 0)洗脱，收集洗脱液；加入 固体（NH4)2SO4盐析，沉淀用PBS溶解后，透析过夜； Sephadex G-25 柱层析：将步骤（2. 2)的透析液过 Sephadex G-25 柱，用 0? 01mol/L pH7. 0的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱液用PEG-20000浓缩，即得副溶血性弧菌TDH毒素。6. 根据权利要求5所述的快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的试剂盒，其特征 在于：步骤（1)中，所述氯化钠碱性蛋白胨的水溶液的质量百分比浓度为3%;扩大培养条 件为：37°C、150r/min、24h ;离心转速为 6000r/min ; (NH4)2SO4加入量为优选 35. lg/100mL 上清液；盐析条件为优选4°C，IOh ;高速离心条件为10000r/min、4°C ;PBS溶液的浓度为 0? 01mol/L，pH 为 7. 0〇7. 根据权利要求5所述的快速检测食品中副溶血性弧菌IDH毒素的试剂盒，其特征在 于：步骤（2. 1)中，固体（NH4)2SO4S析的加入量为40g/100mL ;透析温度优选4°C。8. 根据权利要求1所述的快速检测食品中副溶血性弧菌IDH毒素的试剂盒，其特征在 于：所述包被捕获抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：在新酶标板的每孔加入稀释 的鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清100 y L，40°C烘干后加封闭液封闭酶标板，37°C恒温恒湿 孵育80min，弃去多余封闭液，使用洗涤液注满各孔，轻摇2~4min，拍干，重复3次后扣干，即 得；所述稀释的鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清为采用0. 05mol/L、pH为9. 6的碳酸盐缓冲溶 液稀释的血清，稀释度1:2000~1:4000 ;所述封闭液为质量百分比浓度3~5%的牛血清白蛋 白或3~5%脱脂奶粉。9. 权利要求1至8任一项所述的试剂盒在快速检测食品中副溶血性弧菌IDH毒素中的 应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于：包括以下步骤： 样本前处理：以无菌操作称取食品样品，加入0. 01mol/L、pH7. 4的磷酸盐缓冲液，于均 质杯中均质，制成样品均液；将样品均液用絹纱过滤，于8000~10000r/min离心8~10min，取 上清夜即为待检样品提取液；食品样品与磷酸盐缓冲液的用量比为25g:225mL ; 在包被捕获抗体的酶标板的孔中，分别加入：100 y L待检样品提取液、100 y L TDH标 准稀释液、100 y L兔抗副溶血弧菌阴性血清作为阴性对照、100 y L的PBST作为空白对照， 封板膜封板，37°C恒温恒湿孵育60~80min JDH标准稀释液用以绘制标准曲线，每孔加入的 TDH 标准稀释液浓度分别为 2 y g/mL、4 y g/mL、6 y g/mL、8 y g/mL、10 y g/mL、12 y g/mL ; 洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻 摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自 动洗板，扣干； 每孔中加入100 y L兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清，37°C恒温恒湿孵育60-70min ; 洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻 摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：使用洗涤液选择洗涤3次和洗涤时间 2min后，自动洗板，扣干； 每孔中加入100 y L酶标二抗山羊抗兔IgG-HRP，37°C恒温恒湿孵育45~55min ; 洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻 摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自 动洗板，扣干； 每孔中加入100 y L底物溶液，30°C恒温恒湿闭光孵育15~25min ; 每孔中加入50 y L终止液，摇匀，5min内用酶标仪读数，参比波长设置为630nm，测量波 长设置为492nm，以空白孔调零，然后读出各孔OD492值； 结果判断： A、 定性分析：样品OD492值/阴性对照平均OD 492值多2. 1，判断为阳性，否则为阴性；阴 性对照OD值低于0. 05时，以0. 05计算；高于0. 05时，以实际OD492值计算； B、 定量分析：以OD492值为纵坐标，以TDH标准稀释液浓度（y g/mL)为横坐标，绘制标 准曲线；根据样品的OD值可在标准曲线上查出待测样品TDH浓度，以此浓度乘以10即的得 样品中TDH毒素含量，单位yg/g。
【专利摘要】本发明提供快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的试剂盒及其应用，试剂盒包括包被捕获抗体的酶标板、TDH标准稀释液、兔抗副溶血弧菌阴性血清、兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清、山羊抗兔IgG-HRP的磷酸盐缓冲液、含吐温-20的磷酸盐缓冲液、底物溶液、终止液：2mol/L？H2SO4。本发明提供以检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素为研究对象，通过已制备的TDH毒素蛋白免疫BALB/C小鼠制备抗TDH多克隆抗体，同时以致病性副溶血弧菌菌体作为免疫原免疫新西兰大白兔制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体，以抗TDH多克隆抗体作为捕获抗体，抗菌体多克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA检测法，并运用此法检测食品中副溶血弧菌TDH毒素，研制出食品中副溶血弧菌TDH毒素ELISA快速检测试剂盒。
【IPC分类】G01N33/68, G01N33/543
【公开号】CN105004866
【申请号】CN201510441999
【发明人】窦勇, 胡佩红, 顾鹏程, 董静, 姚妙爱, 吴存兵
【申请人】江苏财经职业技术学院
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月25日