专利名称：雷公藤再生植株及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种雷公藤再生植株及其制备工艺。
背景技术：
雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook f.)为卫矛科雷公藤属植物。药理实验表明，雷公藤具有明显的抗肿瘤、抗炎、免疫抑制以及抗生育作用。目前的研究结果表明，雷公藤二萜内酯类化合物是其主要的有效成分。雷公藤化学成分复杂，药理作用广泛，有重要的临床应用价值。
但由于雷公藤为多年生木质藤本，生长缓慢，临床上大量应用，造成野生资源严重贫乏。因此，雷公藤的人工培育对缓减资源紧张局面、保护生物的多态性、满足人民医疗需要及出口创汇等起着责无旁贷的作用。
目前，对于雷公藤人工培育技术的研究主要集中在利用野生雷公藤的幼茎、叶作外植体进行愈伤组织诱导和细胞悬浮培养。然而，这些技术还存在不足之处1.愈伤组织或悬浮细胞属未分化型培养物，而野生雷公藤均用植株作药材，其属于分化型产物，二者存在本质上的差异。
2.愈伤组织或悬浮细胞的培养得率较低，难以大规模培养用于产业化。
3.愈伤组织或悬浮细胞在长期继代培养中易发生遗传变异，导致培养物的有效成分不稳定。
所以，如何开发一种既能大规模生产、又能保持有效成分相对稳定的人工培养技术，一直是研究人员所追求的目标。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种雷公藤再生植株，它繁殖系数高，其有效成分的含量比野生雷公藤的高，而且能够保持有效成分含量相对稳定。
本发明的另一个目的，在于提供一种繁殖系数和有效成分含量高的雷公藤再生植株的制备工艺，主要是利用细胞变异和细胞全能性的科学原理，改变其生长缓慢和有效成分含量低的特性，并在再生植株中稳定表达。
本发明提供的制备雷公藤再生植株的方法，是根据细胞全能性的原理，植株的每一个离体细胞可以在适宜的培养条件下生长发育成与母体完全一样的植株，以及细胞变异原理，即细胞或愈伤组织在离体培养过程中会发生无性系变异，对离体培养细胞或愈伤组织给予诱变或染色体加倍处理，可以增加变异范围和提高变异频率。因此，我们首先对雷公藤细胞或愈伤组织进行诱变或染色体加倍处理引发大量变异。
取野生雷公藤或种子苗，用其幼嫩组织作为外植体，经表面灭菌15～20分钟，切成薄片，置于无菌诱导培养基内，经35～45天左右的培养，培养温度22～25℃，获得愈伤组织。然后进行2～3次继代培养，每代培养25～30天，培养温度22～25℃，得到大量愈伤组织。大量愈伤组织置入液体培养基，在摇床上培养25～30天，培养温度22～25℃，转速为110～125转/分，形成悬浮培养细胞或细胞团。
无菌条件下将安全低毒诱变剂或染色体加倍剂与悬浮培养细胞或细胞团共培养12～24小时。然后用无菌水洗去诱变剂或加倍剂，将悬浮细胞或细胞团置入修复培养基中浅层培养9～12天左右，培养温度22～25℃。此步骤可以由3～4代的继代培养代替。
然后将上述的悬浮培养细胞或细胞团置于分化培养基上培养，每天光照10～12小时，培养温度22～25℃。25～30天后从各种再生物中选择正常型再生苗。再生苗置于增殖培养基上形成再生植株。
选择繁殖系数高且粗壮的再生植株，取其一部分植株进行总二萜内酯含量的测定，然后再对总二萜内酯含量高的进行雷公藤内酯醇含量的测定。总二萜内酯含量测定采用间二硝基苯比色法，雷公藤内酯醇含量的测定采用高效液相色谱法。经含量测定后从中选择有效成分含量比野生雷公藤高的再生植株。上述有益变异可以通过无性繁殖途径保留和稳定的遗传下去。
由于变异细胞或变异体在发生主要变异时还会发生相连或不相连的其他变异，以及再生植株易对驯化条件产生适应性反应的特性，因此将再生植株茎尖依次置于激素(如6-苄基氨基嘌呤)浓度从高到低再到零的驯化培养基上，22～25℃每天10～12小时光照，每次培养25～30天。最后从无激素简单培养基上选择生长速度快、有效成分含量高的植株。或者也可以将再生植株直接置于无激素培养基上进行驯服培养。
将驯化型再生植株置于简单培养基上，22～25℃培养，每天10～12小时光照(如用日光灯)，每代可增殖5～6倍。按照上述方法，对每代植株进行总二萜内酯含量和雷公藤内酯醇含量的测定检测其有效成分及其含量的稳定性，其中雷公藤内脂醇的含量基本保持在0.009-0.015％之间。
经规模化生产获得的再生植株繁殖系数高、长相粗壮、有效成分含量与原始再生植株相近，表明经多代(目前已达16代)培养后，再生植株的原有特性基本不变。
图1为雷公藤再生植株的制备流程图具体实施方式
以下结合具体实施例，以进一步说明本发明的技术特征。应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
本发明下述实施例中所用的培养基中，MS为一种培养基，其配方为(单位mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2·2H2O 440 MgSO4·7H2O 370KH2PO4170 H3BO36.2
MnSO4·4H2O 22.3 CoCl2·6H2O 0.025CuSO4·5H2O 0.025 ZnSO4·7H2O 8.6NaMoO4·2H2O 0.25 KI0.88FeSO4·7H2O 27.8 Na2EDTA 2H2O37.3维生素B1 0.1维生素B6 0.5菸酸 0.5肌醇 100甘氨酸 2.0N6为一种培养基，其配方为(单位mg/L)KNO32830 (NH4)2SO4463KH2PO4400MgSO4·7H2O 185CaCl2·2H2O 166FeSO4·7H2O 27.8Na2EDTA·2H2O 37.3 MnSO4·4H2O 4.4ZnSO4·7H2O 1.5H3BO31.6KI 0.8甘氨酸 2.0维生素B1 1.0维生素B6 0.5菸酸 0.5实施例1 雷公藤细胞或愈伤组织的无性系变异及诱变取野生雷公藤或种子苗的幼嫩组织作外植体，经75％乙醇灭菌30秒，灭菌灵或漂白粉灭菌15分钟，无菌水洗净，切成薄片进行诱导培养，诱导培养基为2/3MS、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.0mg/L、萘乙酸(NAA)0.1mg/L、激动素(KT)0.1mg/L、5％蔗糖、0.6％琼脂，培养35天以诱导形成愈伤组织。然后进行2～3代的继代培养，继代培养基为2/3N6、水解酪蛋白(CH)500mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L、激动素(KT)0.1mg/L、4％蔗糖、0.6％琼脂，每代培养30天，获得大量愈伤组织。将大量愈伤组织置入液体培养基(2/3N6、500mg/L水解酪蛋白(CH)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.0mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.5mg/L、激动素(KT)0.1mg/L、4％山梨糖)中，在摇床上培养，转速为120rpm，每隔15天转接一次，培养30天，收集黄色胚性悬浮培养细胞或细胞团。
此时可以在继代培养基上继续培养3～4代以诱发无性系变异，也可以与经灭菌的80mg/L平阳霉素或100mg/L的秋水仙碱共培养15小时，无菌水洗净后取出置入修复培养基(2/3MS、15％椰汁、3％山梨糖)中浅层培养10天。
以上各类培养的温度均为22～25℃。
实施例2 雷公藤悬浮培养细胞或细胞团的植株再生将经继代培养或修复培养的鲜黄色悬浮培养细胞或细胞团进行分化培养，分化培养基为1/2MS、吲哚乙酸(IAA)0.1mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L、3％蔗糖、0.6％琼脂，培养温度为22～25℃，每日光照12小时，30天后从再生苗中选择粗壮的正常苗。
实施例3 繁殖系数和有效成分含量高的雷公藤株系的筛选对再生植株进行增殖培养，增殖培养基为2/3MS、水解酪蛋白(CH)500mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.1mg/L、3％蔗糖、0.6％琼脂，选择粗壮、生长快的株系，取其部分植株进行总二萜内酯含量的测定(林启寿等，《中草药成分化学》1977，390页，北京，科学出版社)，以雷氏药业上海中药制药二厂的雷公藤浸膏片(批号为20000505)为标准品，从中筛选含量较高的再生植株。
选择总二萜内酯含量高的再生植株再进行雷公藤内酯醇含量的测定(叶晓川，《药物分析杂志》，1997，17卷第5期319页)，雷公藤内酯醇的标准样品由中国科学院上海药物研究所李援朝教授提供，从中筛选含量高的再生植株。
实施例4 雷公藤再生植株无激素培养的驯化取优质再生植株的茎尖置于激素6-BA含量较高的培养基(2/3MS、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.5mg/L、3％蔗糖、0.6％琼脂)上培养28天，每天光照11小时，从中选择生长快的植株；再置于激素含量较低的培养基(2/3MS、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.1mg/L、3％蔗糖、0.6％琼脂)上培养28天，每天光照10小时，从中选取生长快的植株；最后置于无激素培养基(2/3MS、3％蔗糖、0.6％琼脂)上培养30天，每天光照12小时，从中选取生长快且健壮的植株。或直接置于无激素培养基上培养，选择生长快的再生植株。以上培养温度均为22～25℃。
实施例5 雷公藤再生植株的稳定性试验做三次上述实施例1～4的诱导再生步骤，每次均筛选出生长快且粗壮的雷公藤再生植株。将经过3代、6代、9代、12代、15代繁殖得到的再生植株进行有效成分含量的测定，结果如表1所示
经检测，野生雷公藤的内酯醇含量小于0.003％。可见，本发明的雷供藤再生植株的再生技术重复性较好，有效成分含量高且遗传稳定性较好。
权利要求
1.一种雷公藤再生植株的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤(1)雷公藤细胞或愈伤组织的无性系变异及诱变切取野生雷公藤或种子苗的幼嫩组织作外植体，灭菌15～20分钟后，切成薄片，置于诱导培养基上，培养温度为22～25℃，经35～40天培养，诱导形成愈伤组织；将愈伤组织置于继代培养基中，继代培养2～3代，每代培养25～30天，培养温度为22～25℃，形成大量愈伤组织；大量愈伤组织置于液体培养基中，培养温度为22～25℃，在摇床上培养25～30天，转速为110～130转/分，形成悬浮培养细胞或细胞团；然后在无菌条件下与诱变剂或染色体加倍剂共同培养12～24小时，培养物以无菌水洗净诱变剂或染色体加倍剂，置入修复培养基中浅层培养9～12天，培养温度为22～25℃；(2)雷公藤悬浮培养细胞或细胞团的植株再生然后将悬浮培养细胞或细胞团置入分化培养基中培养，每天光照10～12小时，培养温度为22～25℃，25～30天后从再生植株中选取正常型再生植株，置于增殖培养基中培养，然后选取生长粗壮的植株；(3)雷公藤再生植株的筛选再生植株通过切割增殖手段形成株系，从中选择粗壮、繁殖系数高的株系，每一株系取一定量的植株进行总二萜内酯含量测定，从中选择含量高的株系，所选总二萜内酯含量高的株系再进行雷公藤内酯醇测定，从中选择内酯醇含量高的株系；(4)雷公藤再生植株的无激素培养驯化所选的有效成分含量高且增殖速度快的雷公藤再生植株依次置于激素浓度从高到低再到零的驯化培养基上，在22～25℃，培养25～30天，每天光照10～12小时，最后，从无激素培养基上选取生长快且有效成分含量高的株系。
2.如权利要求1所述的雷公藤再生植株的制备工艺，其特征在于，所述的步骤(1)中的用诱变剂或染色体加倍剂诱变也可以采用在继代培养基继续进行3～4代的继代培养达到无性系变异。
3.如权利要求1所述的雷公藤再生植株的制备工艺，其特征在于，所述的步骤(4)中无激素培养驯化可以直接在无激素培养基上进行，在22～25℃，每天光照10～12小时。
4.如权利要求1所述的雷公藤再生植株的制备工艺，其特征在于，所述的诱导培养基为2/3MS、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、萘乙酸0.1mg/L、激动素0.1mg/L、5％蔗糖、0.6％琼脂。
5.如权利要求1所述的雷公藤再生植株的制备工艺，其特征在于，所述的液体培养基为2/3N6、500mg/L水解酪蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、吲哚乙酸0.5mg/L、激动素0.1mg/L、4％山梨糖。
6.如权利要求1所述的雷公藤再生植株的制备工艺，其特征在于，所述的继代培养基为2/3N6、500mg/L水解酪蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L、吲哚丁酸0.5mg/L、激动素0.1mg/L、4％蔗糖、0.6％琼脂。
7.如权利要求1所述的雷公藤再生植株的制备工艺，其特征在于，所述的诱变剂为80mg/L平阳霉素，所述的染色体加倍剂为100mg/L的秋水仙碱，所述的修复培养基为2/3MS、15％椰汁、3％山梨糖。
8.如权利要求1所述的雷公藤再生植株的制备工艺，其特征在于，所述的分化培养基为1/2MS、吲哚乙酸0.1mg/L、激动素0.5mg/L、6-苄基氨基嘌呤1.5mg/L、3％蔗糖、0.6％琼脂。
9.如权利要求1所述的雷公藤再生植株的制备工艺，其特征在于，所述的增殖培养基为2/3MS、500mg/L水解酪蛋白、激动素0.5mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.1mg/L、3％蔗糖、0.6％琼脂。
10.一种如权利要求1所述的方法制备的雷公藤再生植株，其特征在于，所述雷公藤再生植株的繁殖系数为6～7倍，雷公藤内酯醇含量0.009～0.015％。
全文摘要
本发明公开了一种雷公藤再生植株的制备工艺,该工艺主要利用无性系变异、诱变、染色体加倍、再生和无激素繁殖等技术。该工艺制备的雷公藤再生植株不仅能在可控的标准化条件下大量繁殖,每代的繁殖系数可达5～6倍,且雷公藤内酯醇的含量为0.009～0.015%,总二萜内酯含量也比市售的雷公藤浸膏高,且他们能够保持稳定。
文档编号A01H4/00GK1366810SQ0211093
公开日2002年9月4日 申请日期2002年3月1日 优先权日2002年3月1日
发明者黄剑华, 陆瑞菊, 孙月芳, 王亦菲, 周润梅, 俞庆全 申请人:上海延农生物工程有限公司, 上海市农业科学院生物技术研究中心, 黄剑华