专利名称：植物细胞质雄性不育恢复基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因的克隆及其应用，特别是涉及克隆获得的水稻细胞质雄性不育恢复基因的DNA序列及其编码的蛋白质序列。本发明进一步涉及恢复基因在植物育种中的应用。
多种农作物如水稻、小麦、玉米、油菜等关于雄性不育性及其育性恢复性的研究已有许多报道，在生产上已大规模用于杂交种生产。在中国，杂交水稻自1970年代以来已大面积种植，其中大部分是利用“三系法”配制杂交种子。“三系法”中的“三系”是指不育系、恢复系、和保持系。其中不育系具有由细胞质不育基因控制的细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，简称为CMS)特性。恢复系具有正常的细胞质或不育细胞质，花粉正常可育，可自交结实，其特点是核基因组中携带有细胞质雄性不育恢复基因(fertility restorer gene for CMS)，简称为恢复基因或Rf基因。保持系具有正常的细胞质，花粉正常可育，可自交结实，但其核基因组不携带有功能的恢复基因。生产上应用的配套“三系”中，保持系和不育系具有相同的核基因组，其差别是细胞质不同。
水稻细胞质雄性不育被分为多种类型，其中主要有(1)包台(BT)型，其雄性不育细胞质来源于印度籼稻Chisurah Boro II(Shinjyo，1975)，属于配子体不育；(2)野败型(wild abortive，简称WA型)，其雄性不育细胞质来源于中国海南省的野生稻，属于孢子体不育。(3)红蓮(HL)型，其雄性不育细胞质来源于中国海南省的红芒野生稻，属于配子体不育。对不同类型的水稻细胞质雄性不育，已发现有相应的恢复基因。对于包台型雄性不育，其恢复基因Rf1来源于印度籼稻Chisurah Boro II和其它籼稻。对于野败型雄性不育，发现有2对主效恢复基因Rf3和Rf4，主要来源于低纬度地区的晚籼稻。对于红蓮型雄性不育，其恢复基因Rf5主要来源于红芒野生稻和热带籼稻。
现有的水稻恢复系育种方法主要有2种(1)用现有品种与不育系测交，选出有恢复育性能力的品种直接作为恢复系使用；(2)以携带有恢复基因的品种或品系为基因供体亲本与不携带恢复基因的优良亲本杂交和多代回交选育而成。由于水稻的恢复基因主要存在于少数品种，大部分的水稻品种不携带有功能的恢复基因，尤其是粳稻品种基本上不携带有功能的恢复基因，因此水稻恢复系的育种主要用第(2)种方法，需要多年的时间才能完成。
对恢复基因的研究发现，包台型恢复系有1对恢复基因Rf1，位于第10染色体(Shinjyo，1975)。Ichikawa等(1997)进一步用分子标记定位了Rf1在第10染色体的大致位置。而对野败型恢复系，多数研究认为有2对主效恢复基因，被分别定位在第1和第10染色体(Zhang et al.，1997；张群宇等2002)。红莲型恢复系有1对恢复基因，被定位在第10染色体。
关于植物雄性不育恢复基因的克隆，目前已报道的只有玉米(Maize)的T型细胞质雄性不育恢复基因Rf2和矮牵牛(Petunia)的细胞质雄性不育恢复基因Rf-PPR592(Cui et al.，1996；Bentolila et al.，2002)。本发明申请提出之前还没有水稻的雄性不育恢复基因克隆的报道。
本发明目的是从水稻克隆一种新的细胞质雄性不育恢复基因，为植物特别是水稻选育新恢复系以及杂交育种提供有用的基因和分子标记。
(2)编码序列表中序列2所示的氨基酸多肽序列，该序列由506个氨基酸残基组成，具有7个PPR重复单位(pentatricopeptide repeat)组成的功能结构域(图4)，其生物学功能为恢复植物细胞质雄性不育的育性。
PPR是由35个氨基酸残基构成的重复单位，在不同的含PPR基因中以2个以上的同向重复单位形成功能结构域，不同重复单位的氨基酸序列存在不同程度的变异。因此，构成PPR重复的功能结构域所对应的DNA序列的最小长度为210碱基，即对应于2个PPR重复单位的序列。
根据本发明提供的OsRf1基因序列信息(序列1，序列2)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与OsRf1等同的基因(1)通过数据库检索获得；(2)用OsRf1基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库获得；(3)根据OsRf1基因序列信息设计寡核苷酸引物(含简并性引物)，用PCR扩增方法从水稻或其它植物的基因组获取；(4)在OsRf1基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得。
本发明所述的术语OsRf1等同基因，是定义为与OsRf1基因的核苷酸序列或氨基酸残基序列相比有一个或若干个核苷酸或氨基酸残基的差别，包括碱基或氨基酸残基的改变、缺失、或插入，或与OsRf1基因序列中的连续210碱基以上的区段有85％以上的同源性，且其表达产物的功能与OsRf1表达产物的功能相同的基因。
因此，本发明提供的恢复基因还包括OsRf1等同基因，它们为下列核苷酸序列之一，或编码下列氨基酸多肽序列之一的核苷酸序列(1)将序列1的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加，且编码与序列2同等功能蛋白质的衍生核苷酸序列；(2)与序列1的第1460-2980位碱基序列中连续210碱基以上的区段具有85％以上的同源性，且编码与序列2同等功能蛋白质的核苷酸序列。
(2)将序列2的氨基酸多肽序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与序列2同等功能的衍生氨基酸多肽序列，或其保守性变异多肽，或其活性片段。
本发明所述的OsRf1基因或其等同基因，还包括含有这些基因全部序或部分序列的载体。
本发明提供的恢复基因具有重要的应用价值。应用之一是将所述的恢复基因序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将恢复基因导入水稻或其它植物细胞，可获得能表达所述基因的转基因恢复系。用转基因恢复系与细胞质雄性不育系杂交，可产生杂交种子用于生产。用本发明所述的基因构建到植物转化载体中时，可以对所述的基因或其调控序列作适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子。
本发明提供的恢复基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)。用此标记可鉴定水稻或其它植物的雄性不育恢复系或恢复植株和非恢复系或非恢复植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种。所述的非恢复系为不携带有功能的恢复基因基因的品种和品系，可以是不育系或保持系。
本发明具有明显得优点和效果。利用本发明克隆的基因可进行分子水平的育种。与常规的杂交和回交育种方法相比，用转基因方法培育恢复系可缩短育种时间，还可以同时导入其它有用基因，如抗病抗虫基因，培育出抗病虫的恢复系。另外，与常规的育种选择方法相比，分子标记辅助选择育种可提高育种选择效率。
以下结合附图和实施例对本发明提供的雄性不育恢复基因的克隆过程、基因功能分析、以及用途作具体说明。
图1中的Y3-8、01-2.5、01-2、Rf1m、C1361、S10019为DNA分子标记，Rf1为恢复基因位点，A24为可转化人工染色体(Transformation-competent artificial chromosome，TAC)克隆，ORF为预测的基因开放读码框。
图2中泳道1为含有Rf1候选基因的载体质粒PCR产物，泳道2为恢复系DNA的PCR产物，泳道3-7为导入Rf1候选基因的不育系转化体DNA的PCR产物，泳道8为无模板DNA阴性对照，泳道9为不育系非转化体DNA作为阴性对照，泳道M为分子量标记。
图3所示的花粉育性检测方法是将花粉置于培养基上萌发，箭头所指为萌发的花粉管。其中A图为恢复系的花粉，B图为不育系的花粉，C图和D图为转化体的花粉。
图4中斜体字母部分为定位该蛋白到线粒体的信号肽，标下线部分为7个PPR重复单位。
图5中泳道1-7为第2次PCR反应中使用OsRf1特异引物Rf1m-3R和Rf1m-2的扩增产物，其中泳道1是不育系的穗部RNA为模板，泳道2是恢复系的穗部RNA为模板，泳道3-4是导入OsRf1基因的不育系转化体的穗部RNA为模板，泳道5是恢复系的叶部RNA为模板，泳道6-7是导入OsRf1基因的不育系的叶部RNA为模板。泳道8-14为第2次PCR反应中使用Osrf1特异引物Rf1m-3B和Rf1m-2的扩增产物，其中泳道8是不育系的穗部RNA为模板，泳道9是恢复系的穗部RNA为模板，泳道10是导入OsRf1基因的不育系转化体的穗部RNA为模板，泳道11是恢复系的叶部RNA为模板，泳道12是不育系的叶部RNA为模板，泳道13-14是导入OsRf1基因的不育系转化体的叶部RNA为模板。
图6的花粉育性检测方法是用碘化钾染色后用显微镜观察。其中A图为转OsRf1基因恢复系的花粉，B图为不育系的花粉，C图为保持系的花粉，D图为杂种F1代植株的花粉。
图7中泳道1为不育系亲本，基因型为rf1rf1；泳道2为恢复系亲本，基因型为Rf1Rf1；泳道3-9为F2花粉全可育株，基因型为Rf1Rf1；泳道10-16为F2花粉半不育株，基因型为Rf1rf1。
实施例1.水稻恢复基因Rf1的精细定位与克隆本发明用图位克隆法克隆Rf1基因。首先用水稻包台型细胞质雄性不育系731A和恢复系C9083杂交，建立了一个有600株F2个体的分离群体。根据已报道的水稻第10染色体上所定位的Rf1位点的大致位置(Ichikawa，1997)，选择了该区域的分子标记进行了多态性检测和连锁分析。这些标记包括Y3-8(张群宇等，2002)、C1361、S10019(日本RGP研究所http//rgp.dna.affrc.go.jp)、以及根据水稻基因组序列数据库的资料在BAC克隆序列OSJNBa0078O01所在位置设计和合成的引物以PCR扩增获得的多态性探针01-2.5、01-2、和Rf1m。用这些标记进行连锁分析，构建了一个Rf1位点区域的连锁图(
图1)。图中有2个标记即01-2.5和C1361与Rf1位点之间分别只有1个重组事件，相当于0.08cM(厘摩尔根)的遗传距离，而另2个标记01-2和Rf1m与Rf1位点之间是零重组，即完全连锁。01-2是一个RFLP标记，Rf1m是一个SNP标记，两者相距约10kb。因此Rf1位点被精细定位在标记01-2和Rf1m附近区域(
图1)。以可转化人工染色体载体TAC(Liu et al.，2002)构建了一个恢复系C9083的基因组文库。用01-2和Rf1m为探针筛选这个基因组文库，获得了1个TAC克隆，编号为A24，其插入子大小为36kb(
图1)。
将克隆A24进行了DNA测序和用基因预测软件Autopredgeneset进行基因预测分析。在与标记Rf1m重叠的位置上预测到一个基因开放读码框(ORF)。用计算机分析软件PSORT预测的结果显示该ORF编码表达的蛋白质被定位到线粒体。由于植物细胞质雄性不育基因存在于线粒体，恢复基因表达产物需要进入线粒体才能行使恢复育性的功能，因此将此ORF作为Rf1候选基因，通过以下的基因功能互补实验确认其功能。2.水稻候选恢复基因的转化与转化体的育性检测将TAC克隆A24的插入子中包含Rf1候选基因的一个7.3kb片段亚克隆到植物转化载体pCAMBIA1300，导入农杆菌EHA105。将水稻包台型细胞质雄性不育系WYJ8A成熟种子在诱导培养基上诱导愈伤组织。把含有目的基因转化载体的EHA105在YM琼脂培养基28℃培养1天，收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的MB液体培养基。将水稻愈伤组织浸入菌液20分钟，吸干菌液后转移到MB琼脂培养基培养。转移愈伤组织至含有50mg/L潮霉素的培养基培养，每14天继代一次，继代2次。抗性筛选后，转入再生培养基分化出转化苗，获得了50多株转化体。
用SNP标记Rf1m对转化体进行了PCR检测。本实验使用3个引物，其中引物Rf1m-1为GTGGAACCCATCATCTTTAAC-3’，引物Rf1m-2为GCAATAATGGAGCTGTAAA-3’，引物Rf1m-3R为GGAATGACCGAGCTCG-3’。Rf1m-3R为恢复系等位基因OsRf1特异的巢式引物。PCR步骤为(1)第1次PCR用引物Rf1m-1和引物Rf1m-2扩增33个循环，每个循环为94℃30秒，60℃60秒，72℃60秒；(2)取1μl PCR产物为模板，用引物Rf1m-3R和Rf1m-2进行第2次PCR反应(25μl)，扩增10个循环，每个循环为94℃30秒，50℃30秒，72℃60秒。
检测结果证明目的基因片段已导入这些转化体(图2)。转化体抽穗开花时取花粉用碘化钾染色镜检，发现可育花粉率达到约50％-80％，花粉萌发实验可观察到转化体的花粉萌发出花粉管(图3)，转化体自交能结实。而对照的不育系的可育花粉率为零，花粉不能萌发，自交不能结实。本实验即基因功能互补实验的结果说明，转化到不育系的候选恢复基因的表达恢复了不育系的花粉育性，证明了该基因的生物学功能为恢复植物细胞质雄性不育的育性，确认了该基因即为雄性不育恢复基因。本发明将这个从水稻基因组的Rf1位点克隆获得的细胞质雄性不育恢复基因命名为OsRf1(Oriza sativa Rf1)，水稻非恢复系的等位基因为Osrf1。3.OsRf1基因的序列分析通过筛选水稻cDNA文库和反转录PCR(RT-PCR)扩增，获得了OsRf1的cDNA克隆并测序。序列表中序列1所示序列为包含了OsRf1基因的基因组DNA片段，它包括启动子区、开放读码框、以及3’端非翻译区的序列。OsRf1的开放读码框有1521个核苷酸，是一个没有内含子的基因，编码由506个氨基酸组成的蛋白多肽(图4，序列2)。测序比较分析发现OsRf1与多个非恢复系的Osrf1的核苷酸序列只有3个碱基的差别，其中2个碱基的变异导致2个氨基酸残基的改变，即在序列2第156位的Gly(G)变为Ser(S)，第412位的Asn(N)变为Ser(S)。
数据库比较分析没有发现OsRf1与已知生物学功能的基因有明显的同源性。OsRf1与玉米的T型细胞质雄性不育恢复基因Rf2(乙醛脱氢酶基因)在核苷酸序列和氨基酸多肽序列上无同源性。OsRf1与矮牵牛的育性恢复基因Rf-PPR592在核苷酸序列上检测不到同源性，在氨基酸多肽序列上只在部分区域有约29％的同源性。因此OsRf1是一个新的植物细胞质雄性不育恢复基因。
以OsRf1基因为探针筛选水稻cDNA文库和测序分析，结合数据库检索比较分析，发现水稻基因组中至少有另外7个基因与OsRf1高度同源。这些同源基因中，只有OsRf1的功能由本发明所确定，其余同源基因的功能未知。数据库检索发现一种植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因组也有多个功能未知的氨基酸多肽序列与OsRf1编码的氨基酸多肽序列有不同程度的同源性。利用NCBI网站进行分析显示，OsRf1编码的氨基酸序列有7个PPR重复(图4)，因此OsRf1属于含PPR功能结构域的超级基因家族的一个新成员，是该基因家族中已明确功能的少数几个基因之一。4.OsRf1基因的表达特性分析用RT-PCR对该基因表达的组织和时空特异性进行了分析。RT-PCR使用SNP标记Rf1m的4个引物，即除了实施例2所述的3个引物外，还有一个不育系或保持系等位基因Osrf1特异的巢式引物Rf1m-3BGGAATGACCGAGCTCA-3’。PCR步骤为(1)第1次PCR用引物Rf1m-1和引物Rf1m-2扩增33个循环，每个循环为94℃30秒，60℃60秒，72℃60秒；(2)取0.3μl PCR产物为模板，配制2个第2次PCR反应(25μl)，即用引物Rf1m-3R和Rf1m-2为1个反应，用Rf1m-3B和Rf1m-2为另1个反应，扩增10个循环，每个循环为94℃30秒，50℃30秒，72℃60秒。
实验结果表明，从恢复系和不育系及其导入OsRf1基因的不育系转化体的幼穗和叶组织的RNA反转录模板能够扩增出特异片段，说明OsRf1及其等位基因Osrf1在水稻幼穗和叶组织都有表达，即属于组成型表达的基因(图6)。5.转化OsRf1基因产生新恢复系及配制杂种的应用将OsRf1基因亚克隆到植物转化载体pCAMBIA1300，导入农杆菌EHA105，用于转化水稻包台型细胞质雄性不育系WYJ8A，获得了50多株转化体。用转化体的T1代纯合植株与另一个水稻不育系KFA杂交，产生了杂种F1种子。这些F1植株长势良好，且育性正常(图7)，说明可以用转化OsRf1基因产生新的恢复系，用于杂交种子生产。6.OsRf1基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用利用本发明提供恢复基因序列信息可以产生分子标记，用于鉴定Rf1位点上具有各种基因型即Rf1Rf1、Rf1rf1、rf1rf1的植株，可在分子标记辅助选择育种中应用。图8所示为用SNP标记Rf1m对水稻亲本和F2代植株的基因型进行鉴定，PCR反应条件与实施例4的相同。结果表明所有植株的标记基因型与花粉育性表现型完全一致。
序列表<110>华南农业大学<120>植物细胞质雄性不育恢复基因及其应用<160>2<210>1<211>3453<212>DNA<213>稻属水稻(Orisa sativa L.)<220><221>CDS<222>(1460)...(2980)<400>1ggcgagctcg ctggtggccg tgatgatgca ggcgctcgcc caccgcgcca gctacctgtg60ggtgctcgac gaggacgacg actgccgcct cgccgggatc gtcacgttcg ccgacgtgct 120cacggtgttc cgcgagcagc tgcagtgaag gccgctgccg cggcgacgcc aagaaagagt 180tctttttttt ttttctgttg cggcgatcga tcgatggatc gttgtgcatg cctgcatcct 240tgttctgaaa acattttgga gtgtttattt tgaagcgttt tgaactctga actctgaagt 300atttgtctct gccttggcct ggtgttgatg aacaaactga gactttttgg atatgccttc 360caaataaata agcatttgag ttttcatgct gtagtgaaaa attctaaatt gtgattcagt 420ttagaatagt tgaggacatg ttttgtgaga aacaagtgat caaagtggaa tattttaaaa 480agaaactaaa acacgacgga gatgcagtaa tttggattga tgagtaggga taggaagcag 540agagatcgaa gagtgacatt ctcgttggca tcatttttct ctactattat aaaaattgaa 600aatattttta ctaatatttt cgtacgtcat ccgggtacga gacgattttt aaattcgttt 660gcttttagaa atacatatcc gtatttgagt cggtttttaa cattgttcac ttttggcaat 720acagaaagaa tcatataaga aatctgttta aaaaaaactc 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500 50权利要求
1一种分离出的植物细胞质雄性不育恢复基因，其特征在于(1)编码一种具有植物细胞质雄性不育恢复活性的氨基酸多肽序列，该多肽具有序列表中序列2所示的序列；或编码具同等功能的由序列2衍生的多肽序列，或其保守性变异多肽，或其活性片段；(2)具有序列表中序列1的核苷酸序列；或与序列1的第1460-2980位碱基序列中连续210碱基以上的区段有85％以上的同源性，且编码与序列2同等功能蛋白质的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所说的基因，其特征在于所编码的氨基酸多肽序列含有由35氨基酸残基重复单位PPR组成的功能结构域。
3.根据权利要求1所说的基因，其特征在于序列1中的第1-1459位碱基为含有启动子调控元件和5’端非翻译区的序列，第1460-2980位碱基为开放读码框，第2981-3453位碱基为3’端非翻译区的序列。
4.根据权利要求1所说的基因，其特征在于序列1为含有来源于水稻的细胞质雄性不育恢复基因OsRf1的序列，序列2为序列1中的第1460-2980位碱基序列编码的氨基酸多肽序列。
5.含有权利要求1所说基因的全部序列或部分序列的载体。
6.根据权利要求1所说基因的应用，其特征在于将所说的基因或含有所说基因的载体转化水稻或其它植物，培育能表达所说基因的转基因恢复系；用转基因恢复系与细胞质雄性不育系杂交，产生杂交种子。
7.根据权利要求1所说的基因序列的应用，其特征在于根据所说的基因序列产生特异性的分子标记探针，用此标记探针鉴定水稻或其它植物的雄性不育恢复系或恢复植株或非恢复系或非恢复植株，进行分子标记辅助选择育种。
全文摘要
本发明提供了一个来源于水稻的细胞质雄性不育恢复基因OsRfl的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列。该基因属于PPR基因家族的成员，为一个组成型表达的基因。本发明还涉及用该基因转化水稻或其它植物选育恢复系以及根据该基因序列产生的分子标记在育种的应用。
文档编号A01H1/00GK1425770SQ02152010
公开日2003年6月25日 申请日期2002年11月20日 优先权日2002年11月20日
发明者刘耀光, 王中华, 吴豪, 张群宇, 苏弟华, 陈乐天 申请人:华南农业大学