专利名称：获得西葫芦胚珠双单倍体植株的方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用生物工程技术获得单倍体植株的方法及其专用培养基，特别是涉及利用生物工程技术获得西葫芦胚珠双单倍体植株的方法及其专用培养基。
背景技术：
单倍体是指具有配子染色体组成的孢子体，在育种中意义重大。自发单倍体是通过孤雌生殖或孤雄生殖过程产生的，由于自发频率极低(0.001-0.01％)，制约了它在育种中的广泛利用。以往国内外学者通过远缘杂交、延迟授粉、辐射花粉授粉、激素处理或激温处理等方法人工诱导单倍体，尽管这些方法在一定程度上提高了单倍体的诱导率，但往往重复性差。20世纪60年代中期Guha和Maheshwari(1964，1966)首次在南洋金花植物上通过花药培养技术获得了大量的单倍体花粉植株。目前，在至少52个属的153个种，其中包括不少具有重要经济价值的禾谷类作物和蔬菜上通过花药培养技术产生了单倍体，促进了种质创新与新品种选育工作。
与花粉(雄核发育，Androgenesis)离体培养一样，未授粉子房(雌核发育，gynogenesis)离体培养也是人工诱导单倍体植株的重要技术之一。20世纪80年代未授粉子房(或胚珠)离体培养得到了长足的发展，相继在水稻、小麦、大麦、青稞、玉米、烟草、马铃薯、向日葵、甜菜、洋葱、百合、韭菜等植物上取得了成功。长期以来，葫芦科植物花药和未授粉子房离体培养技术研究进展相当缓慢。以往，在甜瓜和黄瓜等葫芦科植物上利用辐射花粉授粉技术和胚拯救辅助技术获得单倍体，即利用γ射线或X射线辐射花粉使精细胞染色体畸变，授粉后诱导卵细胞单性生殖，单倍体胚在母体发育近20天后利用胚拯救辅助技术获得单倍体或双单倍体再生植株。然而，该技术在实际应用时遇到两方面的问题(1)受辐射源的限制；(2)单倍体胚诱导率较低，目前报道的最高频率在3％左右(Sauton A and Dumas de Vaulx R 1987Production of haploid plants in melon(Cumumis melo L.)as a result ofgynogenesis induced by irradiated pollen Agronomie 7141-147；Cuny F，Dumasde Vaulx，R Longhi et al.1992 Analysis of muskmelon plants(Cumumis melo L.)obtained after pollination with gamma-irradiated polleneffected ofdifferent dose.Agronomie，12623-630；Ficcadenti N，Veronese P，SestiliS，et al.1995 Influence of genotype on the induction of haploid in Cumumismelo L.by using irradated pollen.J.Genet.Breed，49359-364；Yashiro K，K Hosoya，M Kuzuya，et al.2002 Efficient production of Doubled haploid melonplants by modified colchicine treatment of parthenogenetic Haploids.Acta hort.335-338；Caglar G，K Abak 1997 In vitro colchicine application of haploidcucumber plants.Cucurbit Genetic Coop.，2022-23)。在西葫芦上，通过愈伤组织途径进行西葫芦未受精胚珠离体培养，获得了单倍体和双单倍体再生植株(Metwally E I，S A Moustafa，B I El-Sway et al 1998 Haploid plantlets derivedby anther culture of Cucurbita pepo.Plant Cell，Tissue and Organ Culture 52171-176；Metwally E I，S A Moustafa，B I El-Sway et al 1998 Production ofhaploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules of Cucurbita pepo.Plant Cell，Tissue and Organ Culture 52117-121；陈学军，邢国明，陈竹军.西葫芦未授粉胚珠离体培养与植株再生.浙江农业学报，2000，12(3)165-167)。然而，通过愈伤组织途径获得单倍体再生植株所需要的时间长达3-4个月，制约了单倍体的进一步应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、快捷、稳定的获得西葫芦胚珠双单倍体植株的方法及实现该方法的专用培养基。
本发明所提供的获得西葫芦胚珠双单倍体植株的方法，包括以下步骤1)取未授粉的西葫芦胚珠；2)诱导胚状体产生及萌发；3)诱导根系产生得到单倍体植株。
未授粉的西葫芦胚珠以开花前一天或开花当天的西葫芦未授粉胚珠为宜。
诱导胚状体产生及萌发包括启动雌核发育的预培养、胚状体的诱导及胚状体的萌发露芽和胚芽伸长。诱导根系产生得到单倍体植株包括根系诱导与壮苗及再生植株的移栽。
为了提高胚状体的诱导率，预培养为在35℃黑暗条件下热激4天，然后在25℃下光照2天。
获得西葫芦胚珠双单倍体植株的专用培养基，包括预培养培养基、胚状体的诱导培养基、胚状体的萌发露芽和胚芽伸长培养基及壮苗培养基；所述预培养采用的预培养培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.01mg/L TDZ及60g/L蔗糖；所述胚状体的诱导培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.1mg/L BA及30g/L蔗糖；所述胚状体的萌发露芽和胚芽伸长培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.01mg/L BA、0.01mg/L IBA及30g/L蔗糖；胚芽和胚根都伸长的再生植株的壮苗培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上60g/L蔗糖；胚芽伸长而胚根没有伸长的再生植株的壮苗培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上60g/L蔗糖及5mg/LIBA。
未授粉胚珠离体培养获得单倍体植株，要解决的首要问题是如何启动雌核发育。本发明不仅明确地提出了适合西葫芦雌核发育的未受精胚珠的发育时期和生理状态，而且创造性地建立了适宜未受精胚珠生长的预培养基，解决了离体条件下未受精胚珠雌核发育的启动问题，使通过胚状体的再生途径得以实现。利用本发明的方法，可以实现“高效”、“稳定”和“快捷”地获得西葫芦胚珠双单倍体植株，降低基因型对胚胎发生的影响，提高胚胎自然加倍率和再生成苗率。利用本发明的方法获得单倍体再生植株所需要的时间一般为25天，诱导率为15％，可显著缩短育种周期、降低育种成本、提高育种效率，大大促进西葫芦种质创新与新品种选育进程，提升育成品种的科技含量和在国际种业市场的竞争力。
图1为预培养黑暗期淡黄色的胚珠。
图2为预培养光照期变绿的胚珠。
图3示胚状体发育的心形期。
图4示胚状体发育的鱼雷期。
图5示胚状体萌发露芽。
图6示胚状体萌发后形成的胚芽开始伸长。
图7示培养基上再生植株。
图8示再生植株。
图9示移栽成活的再生植株。
图10示单倍体植株叶片表皮保卫细胞。
图11示二倍体植株叶片表皮保卫细胞。
图12示四倍体植株叶片表皮保卫细胞。
图13示定植于温室中的再生植株。
具体实施例方式
实施例1、西葫芦胚珠双单倍体植株的获得1.取样开花前一天的未授粉子房，或提前套袋隔离的当天开花的未授粉子房。
2.消毒(在无菌操做台内)
(1)用70％的酒精擦拭子房表面；(2)用手术刀削去果肉，留下着生着胚珠的胎座，将胎座横切成片，厚度与胚珠的直径相当；(3)用8％的NaClO溶液灭菌10分钟；(4)无菌水冲洗3-4次，准备接种。
3.预培养将含胚珠的胎座组织接种于预培养基上进行预培养，以启动雌核发育，预培养采用的预培养培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.01mg/L TDZ及60g/L蔗糖。为了提高胚状体的诱导率，接种后在35℃黑暗条件下热激4天，然后在25℃下光照2天。在预培养基上，胚珠迅速生长膨大，其颜色黑暗期为淡黄色(如图1所示)，光照期逐渐变为鲜绿色(如图2所示)，这标志着胚珠雌核发育已经启动，启动率为87％。
4.胚状体的诱导预培养后，将膨大的胚珠从胎座组织中取出，接种于诱导胚状体的培养基上，胚状体的诱导培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.1mg/L BA及30g/L蔗糖，约5天左右，珠被裂开，露出无色透明的细胞团，表明胚状体已处于发育过程中，珠被裂开率为20％。珠被裂开后解剖观察胚状体发育过程中的形态变化，观察到胚状体发育的2个明显时期心形期(如图3所示)和鱼雷期(如图4所示)。
5.胚状体萌发与胚芽伸长在诱导胚状体的培养基上培养14天左右，将胚珠转移到促进胚状体萌发露芽和胚芽伸长培养基上，胚状体的萌发露芽和胚芽伸长培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.01mg/L BA、0.01mg/L IBA及30g/L蔗糖，胚状体开始萌发露芽(如图5所示)，并且胚芽逐渐伸长(如图6所示)，能够露芽及伸长的胚状体为15％。
6.根系诱导与壮苗在诱导胚状体的培养基上培养14天左右，有的胚状体(大约占70％)萌发后既观察到伸长的胚芽和胚根，有的(大约占30％)只观察到伸长的胚芽，而没有观察到伸长的胚根(如图7所示)。因再生植株长势较弱，故将胚芽和胚根都伸长的再生植株转移到配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上60g/L蔗糖的壮苗培养基上；将胚芽伸长而胚根没有伸长的再生植株转移到配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上60g/L蔗糖及5mg/L IBA的壮苗培养基上。约20天左右，再生植株根系与茎叶生长茁壮(如图8所示)，成活率为100％。
7.再生植株的移栽当再生植株枝叶生长茂盛、根系发育良好时，将瓶口打开，加入少量自来水于室温下炼苗，2天后取出植株，洗净根部培养基，在日光温室小心移植于装有无菌营养土的营养钵里，罩上大点的烧杯或塑料袋，留口透气，以保持较高的相对湿度。开始几天遮阴，待长出新叶时，说明又有新根形成，此时，去掉烧杯或塑料袋，接受阳光照射，即可成活(如图9所示)，成活率为95％。
8.再生植株的倍性鉴定一般情况下，西葫芦单倍体、二倍体、四倍体植株叶片表皮保卫细胞中叶绿体数分别是4、8和16个。以普通二倍体西葫芦为对照，分别取对照植株和再生植株叶片压片镜检，观察叶片表皮保卫细胞的叶绿体数目，根据表皮保卫细胞叶绿体的数目判断其倍性。在鉴定的18株中，2株为单倍体(如图10所示)、12为株二倍体(如图11所示)和4株为四倍体(如图12所示)。
9.温室田间定植如图13所示再生植株定植于日光温室中后，生长情况良好。
权利要求
1.一种获得西葫芦胚珠双单倍体植株的方法，包括以下步骤1)取未授粉的西葫芦胚珠；2)诱导胚状体产生及萌发；3)诱导根系产生得到单倍体植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述未授粉的西葫芦胚珠为开花前一天或开花当天的西葫芦未授粉胚珠。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述诱导胚状体产生及萌发包括启动雌核发育的预培养、胚状体的诱导及胚状体的萌发露芽和胚芽伸长。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述预培养采用的预培养培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.01mg/LTDZ及60g/L蔗糖；所述胚状体的诱导培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.1mg/L BA及30g/L蔗糖；所述胚状体的萌发露芽和胚芽伸长培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.01mg/L BA、0.01mg/L IBA及30g/L蔗糖。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述预培养为在35℃黑暗条件下热激4天，然后在25℃下光照2天。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述诱导根系产生得到单倍体植株包括根系诱导与壮苗及再生植株的移栽。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于胚芽和胚根都伸长的再生植株的壮苗培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上60g/L蔗糖；胚芽伸长而胚根没有伸长的再生植株的壮苗培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上60g/L蔗糖及5mg/L IBA。
8.获得西葫芦胚珠双单倍体植株的专用培养基，包括预培养培养基、胚状体的诱导培养基、胚状体的萌发露芽和胚芽伸长培养基及壮苗培养基；所述预培养采用的预培养培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.01mg/L TDZ及60g/L蔗糖；所述胚状体的诱导培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.1mg/L BA及30g/L蔗糖；所述胚状体的萌发露芽和胚芽伸长培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上0.01mg/L BA、0.01mg/L IBA及30g/L蔗糖；胚芽和胚根都伸长的再生植株的壮苗培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上60g/L蔗糖；胚芽伸长而胚根没有伸长的再生植株的壮苗培养基的配方是MS培养基配方中的无机盐加上B5培养基配方中的有机物再加上60g/L蔗糖及5mg/L IBA。
全文摘要
本发明公开了一种获得西葫芦胚珠双单倍体植株的方法及其专用培养基，该方法包括以下步骤1)取未授粉的西葫芦胚珠；2)诱导胚状体产生及萌发；3)诱导根系产生得到单倍体植株。利用本发明的方法，可以实现“高效”、“稳定”和“快捷”地获得西葫芦胚珠双单倍体植株，降低基因型对胚胎发生的影响，提高胚胎自然加倍率和再生成苗率。利用本发明的方法获得单倍体再生植株所需要的时间一般为25天，诱导率为15％，可显著缩短育种周期、降低育种成本、提高育种效率，大大促进西葫芦种质创新与新品种选育进程，提升育成品种的科技含量和在国际种业市场的竞争力。
文档编号A01H1/06GK1653885SQ20041000431
公开日2005年8月17日 申请日期2004年2月13日 优先权日2004年2月13日
发明者王建设, 刘玲, 张慧玲, 郭永强, 李海真, 王永键, 陈贵林, 韩丽华 申请人:北京市农林科学院蔬菜研究中心