专利名称：增加商业化转基因植物产生的dna构建体和方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域。采用植物基因工程方法创建新的DNA构建体，其包含异源遗传元件，当它在转基因植物中表达时提供了有用的表型。更具体地讲，本发明包含DNA构建体和它的使用方法，从而让更多从植物细胞培养物再生的转基因植物能成功作为商业化植物的候选。
背景技术：
土壤杆菌(Agrobacterium)介导的植物细胞转化方法涉及将植物细胞和组织暴露于含特定DNA质粒的土壤杆菌细胞悬浮液。具体构建这些DNA质粒以包含将在植物细胞中表达的转基因(美国专利第5,034,322号)。最通常地，一个或多个转基因为正向选择标记基因，允许植物细胞在正向选择化合物存在时生长，例如抗生素或除草剂。进一步操作这些细胞，再生为完整的能育植物。
通过土壤杆菌介导的转化将转基因导入植物的方法利用整合了转基因遗传元件的T-DNA(转移DNA)，将那些遗传元件转移到植物的基因组中。将转基因构建在DNA质粒载体中，并通常界定在土壤杆菌Ti质粒右边缘DNA区域(RB)和左边缘DNA区域(LB)之间。在土壤杆菌介导的转化过程中，DNA质粒的左右边缘区域被VirD2核酸内切酶切开，接着T-DNA区域插入到植物基因组中。T-DNA整合到植物基因组通常始于RB，并延伸到T-DNA的末端LB处。但是，有时候核酸内切酶不能同等切割两端。当发生这种情况时，插入植物基因组的T-DNA常常含有部分或全部的质粒载体DNA。这种现象被称为边界通读。通常优选的是只让位于左缘和右缘区(T-DNA)之间的转基因转移到植物基因组当中而不携带任何相邻的质粒载体DNA(载体骨架)。载体骨架DNA包含有各种质粒维持遗传元件，例如复制起点、细菌选择标记基因和其它由于规定不希望出现在商业化农作物产品中的DNA片断。
大量的资源被用于筛查转基因农作物的基因组中是否存在载体骨架DNA。方法如聚合酶链反应(PCR)和DNA印迹分析最常用于鉴定外源载体骨架DNA。这些方法耗时且大规模的筛查昂贵。载体骨架DNA可通过左边界通读整合，或者可不依赖T-DNA整合到植物基因组中(Kononov等，Plant J.11，945-957，1997)。被发现含有载体骨架DNA的转基因植物不能商业化。从没有商业潜力的植物细胞培养物再生转基因植物浪费了大量努力。能大大降低载体骨架DNA在转基因植物基因组中出现的DNA构建体和方法将是非常有用的。如果更少的转基因植物不含载体骨架DNA，就可以生产更少。因此，只需要较少的实验以确证是否含有骨架DNA。
Hanson等人(美国专利第6,521,458号)描述了在载体骨架中含有致死基因的DNA构建体，表达时杀死植物细胞。不过，控制在细菌和植物细胞中致死基因产物的表达是棘手的。致死基因的表达必须受各种遗传元件控制，以防在细菌和非靶向植物细胞和组织中表达。在骨架中将非致死负性选择标记基因用于植物细胞较使用致死基因是实质性的改善。非致死负性选择标记基因可提供可视的方式以辨别正在表达非致死负性选择标记基因产物的植物细胞和组织，植物细胞和植物的选择更为可控，而且含有非致死负性选择标记基因的植物细胞是可被救活的。为此目的所使用的基因可以是任何影响植物细胞分裂、茎干伸长或是产生多效性茎干或是叶片表型的基因。
可记分标记基因例如β-葡萄糖苷酶(GUS)(Kononov等，Plant J.11，945-957，1997)可提供检测骨架DNA存在的方式，但是不能提供选出含有载体骨架DNA的细胞的方式，并且测定方法具有组织破坏性。条件致死的负性选择标记基因也可用于骨架DNA中。其它条件致死基因产物的代表性实例包括将硫黄嘌呤转变成毒性硫黄嘌呤单磷酸的大肠杆菌(E.coli)鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Besnard等，Mol.Cell.Biol.74139-4141，1987)；将磷酸化无活性化合物如丝裂霉素磷酸酯和阿霉素磷酸酯转变成毒性去磷酸化化合物的碱性磷酸酶；将5-氟胞嘧啶转变成毒性化合物5-氟尿嘧啶的真菌(如尖镰孢(Fusariumoxysporum))或细菌的胞嘧啶脱氨酶(codA)(Mullen，PNAS 8933，1992)；从对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸上切下谷氨酸，从而生成毒性苯甲酸氮芥的羧肽酶G2；将阿霉素和美法仑的苯氧基乙酰胺衍生物转化成毒性化合物的青霉素-V酰胺酶(一般参见Vrudhula等，J.of Med.Chem.36(7)919-923，1993；Kern等，Canc.Immun.Immunother.31(4)202-206，1990)；以及膦酸单酯水解酶，pehA(美国专利第5,254,801号)。然而，为了生成对含有骨架DNA的细胞能产生致死效应的毒性产物，必须添加外源性底物。本发明不需要向培养基中添加额外的底物，也不需要用条件致死基因产物所需的底物外源处理植物培养细胞。
植物激素信号转导基因和激素生物合成途径基因可以作为植物转化的选择标记基因，并用于生产不含标记的转基因植物的方法(美国专利第6,326,192号)。可是，如果此植物要进一步发展为所述的商业化植物，就必须除去这些基因。本文阐述的基因以及组合物在本发明中用作载体骨架DNA的非致死负性选择标记基因。
代谢内源性植物细胞底物的基因产物可用作本发明的代谢干扰基因。例如，sacB基因编码蔗糖6-果糖基转移酶，负责用蔗糖作底物合成中性多聚果糖(果聚糖)，经证实存在于多种细菌中例如芽孢杆菌(Bacillus spp.)、欧文氏菌(Erwinia spp.)等。旨在增加抗旱性或渗土强度(sink strength)而表达sacB基因的转基因植物曾报道于烟草、马铃薯、甜菜、玉米和黑麦草(Ebskamp等，Bio/Technol.12，272-275，1994；van der Meer等，Plant Cell，6，561-570，1994；Caimi等，PlantPhysiol.110，355-363，1996；Rober等，Planta.199，528-536，1996；Ye等，Plant Cell Rep，20205-212，2001)。然而，当液泡靶向的受CaMV35S启动子驱动的sacB基因重复转化进入烟草和黑麦草的时候，只恢复了有发育障碍的植物(Ye等，2001)。在玉米中，表达sacB的玉米粒干扰了颗粒充填并造成种子萎缩，其发芽率非常低(Caimi等，1996)。在马铃薯中，sacB基因在块茎中的表达致使块茎变小(Rober等，1996)。这些结果揭示，sacB的表达严重抑制了植物细胞和组织的发育。
其它编码代谢干扰酶的基因，例如编码酵母转化酶、酵母海藻糖-6-磷酸合酶的基因也可以以相同方式使用。据报道，在烟草和拟南芥(Arabidopsis)中表达酵母转化酶(Suc2，Carlson等，Nucleic AcidsRes.11(6)，1943-1954，1983)严重抑制茎干伸长和根发育(Sonnewald等，Plant J.195-106，1991)，而在烟草中组成型表达酵母海藻糖-6-磷酸合酶(TPS1，Bell等，Eur.J.Biochem.209(3)，951-959(1992))出现生长障碍和披针状叶(Romero等，Planta 201293-297，1997)。代谢干扰基因，例如编码蔗糖6-果糖基转移酶、转化酶或海藻糖-6-磷酸合酶的多核苷酸作为非致死负性选择标记转基因用于本发明。
本发明将非致死负性选择标记转基因整合到DNA质粒的载体骨架DNA上，用于转化植物细胞。设计转基因以在含有DNA质粒载体骨架DNA的植物细胞中表达非致死基因产物。这些非致死负性选择标记转基因的产物涉及到植物激素生物合成途径、植物激素底物的转变、植物激素降解或者是代谢干扰。利用这样的DNA质粒来转化植物细胞可以提高商业化植物的产量。
发明概述本发明包括包含了土壤杆菌Ti质粒第一边缘区的DNA质粒，该边缘区和至少一种转基因相连接，转基因可以是选择性标记基因和其它农艺学目的基因，它们连接到土壤杆菌Ti质粒的第二边缘区，再连接到载体骨架DNA，后者包含有非致死负性选择标记基因。非致死负性选择标记基因包括植物激素生物合成途径基因或代谢干扰基因。植物激素生物合成途径基因的过度表达提供植物激素的表达增加，或者将植物激素底物转化成无功能的激素类似物，或者将植物激素的底物导向另一种生物合成途径。非致死负性选择标记基因还可以包括减少内源性激素量的植物激素降解基因。非致死负性选择标记转基因还可以包括按反义方向排列的植物激素生物合成基因或其部分，通过转录后基因抑制减少内源性植物激素的量。非致死负性选择标记基因还可以包括代谢干扰基因，当它在植物细胞中过度表达时提供了异常表型。这种异常表型优选为生长减缓表型或者是茎干或叶的畸型。
DNA质粒还包括植物表达盒，其包含在植物细胞中有功能的启动子。这些植物表达盒提供了植物正向选择标记基因、农艺学目的基因和非致死负性选择标记基因。
非致死负性选择标记基因包括在DNA质粒上的植物激素生物合成途径基因，选自以下基因赤霉酸(GA)途径基因、细胞分裂素途径基因、植物生长素途径基因、乙烯途径基因和脱落酸途径基因。
本发明的DNA质粒包含非致死负性选择标记基因，该基因可以将GA途径的底物转化为无GA活性的化合物。例如，这类转基因编码的酶包括八氢番茄红素合酶、GA20氧化酶或GA2β，3β-羟化酶。DNA质粒可以含有GA降解酶，如GA 2-氧化酶。
本发明的DNA质粒包含非致死负性选择标记基因，该基因编码细胞分裂素生物合成途径中的酶，例如异戊烯基转移酶(IPT)。
本发明的DNA质粒包含非致死负性选择标记基因，该基因编码植物生长素生物合成途径中的酶，例如植物IAA合酶基因或土壤杆菌肿瘤基因iaaM、iaaH、rolABC或者其它从各种土壤杆菌种中分离的肿瘤或根毛基因。
本发明的DNA质粒包含非致死负性选择标记基因，该基因编码乙烯生物合成途径中的酶。例如编码ACC合酶的基因。DNA质粒也可以包含编码乙烯降解酶的基因，例如ACC脱氨酶。本发明的DNA质粒也可以含有编码乙烯受体的基因。本发明的DNA质粒也可以含有编码植物激素信号蛋白的转基因。
本发明的DNA质粒包含非致死负性选择标记基因，该基因是代谢干扰基因。例如，代谢干扰基因包括但不限于编码蔗糖6-果糖基转移酶的sacB基因、编码酵母转化酶的Suc2基因或编码酵母海藻糖-6-磷酸合酶的TPS1基因。代谢干扰基因还包括构建为按转录后基因抑制机制发挥功能的基因。
将本发明DNA质粒转化入土壤杆菌细胞中，用于转移包含在质粒中的植物转基因的方法。土壤杆菌细胞包含DNA质粒，其包含土壤杆菌Ti质粒第一边缘区，连接到至少一种农艺学目的转基因，再连接到土壤杆菌Ti质粒的第二边缘区，再连接到非致死负性选择标记基因，再连接到载体骨架DNA。
本发明提供了增强选择商业化转基因植物的方法，包括步骤a)使用在T-DNA中包含正向选择标记基因且在质粒骨架中包含非致死负性选择标记基因的DNA质粒转化多个植物细胞；b)在正向选择化合物上选择所述的植物细胞；c)将所述选择的植物细胞再生为完整的植物；其中该植物减少了质粒骨架DNA的出现，并且具有较低拷贝数的农艺学目的转基因。通过此方生产的植物为本发明的一个方面。
附图简述
图1.本发明DNA质粒图解图2.pMON80101的质粒图谱图3.pMON77406的质粒图谱图4.pLAGILBO1.0033的质粒图谱图5.pLAGILBO1.0037的质粒图谱图6.pMON69869的质粒图谱图7.pMON75157的质粒图谱图8.pMON75182的质粒图谱图9.pLAGILBO1.0035的质粒图谱
图10.pLAGILBO1.0038的质粒图谱
图11.pMON75183的质粒图谱
图12.pMON75181的质粒图谱
图13.pMON42066的质粒图谱
图14.非致死负性选择标记基因对用pMON75181(crtB)和pMON75182(ipt)转化的玉米植物的骨架频率的效果
图15.非致死负性选择标记基因对用pMON75181(crtB)和pMON75182(ipt)转化的玉米植物的插入拷贝数的效果
图16.pMON73564的质粒图谱
图17.pMON73565的质粒图谱
图18.非致死负性选择标记基因对用pMON73565(crtB+)转化的玉米植物的骨架频率的效果
图19.非致死负性选择标记基因对用pMON73565(crtB+)转化的玉米植物的插入拷贝数的效果图20.pMON67935的质粒图谱图21.pMON67936的质粒图谱图22.非致死负性选择标记基因对用pMON67936(crtB+)转化的玉米植物的骨架频率的效果图23.非致死负性选择标记基因对用pMON67936(crtB+)转化的玉米植物的插入拷贝数的效果图24.pMON83912的质粒图谱图25.pMON83908的质粒图谱图26.pMON83907的质粒图谱发明详述本发明部分基于含有非致死负性选择标记基因盒的DNA质粒，所述基因盒位于T-DNA外的质粒区域中，并与质粒维持DNA(载体骨架DNA)相连。当在转基因植物细胞中表达时，非致死负性选择标记基因含有的基因产物是非致死性的，但是干扰了正常转基因植物细胞再生为完整的转基因，植物包括茎干、叶和根。本发明提供了使用该DNA质粒来增强选择商业用途植物细胞的方法。再生为完整的能育转基因植物的植物细胞增强了商业可行性，部分因为不存在载体骨架DNA，部分因为在植物基因组中减少了T-DNA的拷贝数。
本发明的多核酸分子编码非致死负性选择标记基因产物的DNA分子，在本发明中鉴定为包含多核酸分子，当其在植物中表达时对植物细胞是非致死的，但是干扰了植物细胞以正常速度再生为完整植物的能力，或与不含该多核酸分子的植物细胞或再生植物部分相比产生了异常表型。
本文使用的多核酸分子是指脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。DNA和RNA分子都是从核苷酸头尾连接构建而来，其中每一个核苷酸含有一个磷酸基、一个糖部分、一个嘌呤或嘧啶碱基。多核酸分子可以是单链或双链的核苷酸聚合物，从5′端读到3′端。多核酸也可以任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基，能够允许被聚合酶正确连读，并且不会改变该多核酸分子编码的多肽的表达。
本发明的多核苷酸由核苷酸序列定义，本文使用的核苷酸序列是指线性排列的核苷酸形成多核酸分子的有义链和互补链的多核苷酸，无论是作为单链还是在双链体中。本文使用的术语“编码序列”和“结构多核苷酸分子”是指当置于合适的调节分子的控制之下时，通常通过mRNA，能翻译成多肽的多核苷酸分子。编码序列的边界由5′-末端的翻译起始密码子和3′-末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括，但不限于染色体DNA、cDNA和重组多核苷酸分子。在本发明中所使用的编码非致死负性选择标记基因产物的多核苷酸的同系物、直向同源物(orthologs)或种内同源物(paralogs)，可以在DNA数据库中得到鉴定，并从源生物中分离得到。或者，使用本领域技术人员已知的方法通过化学合成可以设计并创造出编码非致死负性选择标记基因产物的人工DNA分子。DNA引物和探针通常是合成的DNA分子。此外，使用本领域技术人员已知的方法合成DNA引物分子，使用DNA引物可以制造全长编码序列或其片段。
本发明的多核酸分子可以和其它非天然的或“异源”序列以各种方式组合。“异源”序列是指任何未被发现天然地与提供本发明基因产物的核苷酸序列连接的序列，例如包括来源于相同植物的核苷酸序列非天然连接在一起的组合，或来源于不同物种的两种序列的组合。本文使用的术语“有效连接”或“连接”，涉及调控和结构多核苷酸分子的物理和功能排列，这种排列导致有效连接的结构多核苷酸分子的调控表达。
DNA构建体或转基因的表达是指从本发明多核苷酸分子或其翻译物得来的有义RNA、反义RNA或蛋白的转录和稳定积聚。“有义”RNA是指包括mRNA的RNA转录物，因此能被细胞翻译为多肽或蛋白。“反义RNA”是指与靶原始转录物或mRNA全部或部分互补的RNA转录物，当它在转基因细胞中表达时干扰了靶基因的表达(美国专利第5,107,065号)。反义RNA的互补性可以针对具体基因转录物的任何部分，例如在5′非编码序列、3′非翻译序列、内含子或编码序列。“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录得到的产物。当RNA转录物与DNA序列的拷贝完全互补时，可以被认为是原始转录物或原始转录物转录后加工得来的RNA序列，被称为成熟RNA。本发明的多核苷酸分子可包含与宿主靶多核苷酸互补的反义序列。本发明的多核苷酸分子也可能包含一个双链RNA产物，当在宿主细胞中表达时提供了对靶宿主基因的转录后基因抑制。
在植物细胞中通过反向RNA调控基因表达的转录后基因抑制公开于美国专利5,107,065和美国专利5,759,829。在植物细胞中通过正向RNA调控基因表达的转录后基因抑制公开于美国专利5,283,184和美国专利5,231,020。在植物中由双链RNA通过RNA干扰(RNAi)抑制基因的转录后基因抑制公开于国际公开WO 99/53050，在分开的转录单位或单个转录单位中使用包含靶基因正向和反向元件的重组DNA构建体。也参见国际公开WO 99/49029、美国专利申请公开2003/0175965 A1(Lowe等)、美国专利申请10/465,800和美国专利6,506,559。另一个用于RNA干扰基因抑制的DNA构建体包含以反向启动子为边界的单向基因元件，公开于美国专利申请公开2003/0061626 A1和美国专利6,326,193。也参见美国专利申请系列号10/393,347，公开了在转基因植物中同时表达一个或多个重组基因而同时抑制一个或多个天然基因的构建体和方法。也参见美国专利6,448,473，公开了在植物中使用的多基因表达载体。所有上述的专利、申请和国际公开公开了在植物中用于转录后基因抑制的材料和方法，其通过引用结合到本文中。
在植物中转录后基因抑制的优选方法是使用稳定的(如具有末端发夹结构)正向或反向转录RNA。影响转录后基因抑制的优选DNA构建体被转录为反向RNA片段，所述RNA片段与要抑制的靶基因具有同源性，其中反义RNA片段在3′端后连接有一段连续、互补的更短的正向RNA片段。在植物中自我稳定的反义RNA寡核苷酸的用途公开于国际公开94/01550。也参见国际公开98/05770，其中反义RNA被聚(CG)核苷酸的发夹形成重复所稳定。也参见美国专利申请公开2002/00488l4 A1，其中有义或反义RNA被poly(T)-poly(A)尾所稳定。也参见美国专利申请公开2003/0018993 A1，其中有义或反义RNA被NOS基因后的反向重复序列所稳定。也参见美国专利申请公开2003/0036197 A1(Classman等)，其中与靶基因具有同源性的RNA被两个互补RNA区域稳定。
本发明的植物细胞非致死负性选择标记转基因包含了编码多肽和酶的多核苷酸，所述多肽和酶涉及植物激素。可以操纵植物激素，包括赤霉素、细胞分裂素、植物生长素、乙烯和脱落酸，用来影响植物细胞再生为完整的植物。
使用赤霉酸(GA)生物合成途径底物但不会导致产生生物活性GA的酶，其过度表达用于在植物细胞中减少可用于GA生物合成的底物数量。在美国专利公开2002005309和WO0009722中阐述了GA途径以及酶和底物的描述，包括GA 20-氧化酶(美国专利6,455,675)、GA2β，3β-羟化酶和八氢番茄红素合酶。八氢番茄红素合酶是与生产维生素A有关的酶(美国专利5,656,472、US20020051998、US20020092039、美国专利6,429,356，通过引用结合到本文中)。已经从细菌和植物来源中分离到编码八氢番茄红素合酶的DNA(美国专利5,429,939，通过引用结合到本文中)。草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)八氢番茄红素合酶基因(crtB，美国专利6,429,356)对于生产类胡萝卜素色素和在本发明中减少植物细胞再生特别有用。Fray等(植物杂志8693-701，1995)展示了在转基因番茄中果实八氢番茄红素合酶基因的组成型表达，通过使来源于赤霉素途径的代谢产物改向，导致了植株矮小。在含有载体骨架DNA的植物中，本发明中所使用的八氢番茄红素合酶可以将来源于赤霉酸生物合成途径的底物焦磷酸 牛儿基 牛儿酯(GGPP)转移到类胡萝卜素生物合成途径。这个转换结果导致可用于GA生产的底物数量减少。从植物细胞组织培养再生植物期间植物细胞中GA的减少延迟了茎干形成。此外，因为类胡萝卜素色素的过量产生，培养基中植物愈伤组织是橙色的。本发明提供了在载体骨架中含有八氢番茄红素合酶基因的DNA构建体，当在植物中过度表达时，降低了植物细胞再生为完整植物的速度，因此提供了相对不含有载体骨架的转基因植物细胞的可选择优势。包括GGPP合酶的其它GA生物合成途径酶(美国专利6,410,356)也可用于本发明。例如从菜豆、拟南芥、大豆、玉米和棉花(美国专利6,670,527和美国专利申请公开US20020053095，通过引用结合到本文中)中分离到的GA 2-氧化酶基因序列可以用来降低GA的水平，并在植物组织培养物中延迟茎干伸长。通过降低生物活性的赤霉素的水平，实现GA 2-氧化酶基因产物的功能。2-氧化酶对生物活性的GA如GA1和GA4的羟基化作用使其失活，而生物合成前体如GA9和GA20的羟基化作用，对于GA生物合成酶而言产生了非优选的底物。2-氧化酶蛋白的过度表达因此能够用来直接失活GA或通过影响底物水平间接下调内源性生物活性GA的水平，由此延迟了茎干的再生。本发明提供了含有本文描述的GA相关酶的DNA构建体，其中植物表达盒含有编码这些GA相关酶的多核酸，出现在载体骨架DNA上。
细胞分裂素生物合成途径中转基因酶的过度表达显示出影响植物细胞和转基因植物中的细胞分裂素水平。例如异戊烯基转移酶(IPT)是用于细胞分裂素合成的酶，此基因(ipt)已从根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒中分离到(Barry等，Proc.Natl.Acad.Sci.814776-4780，1984)。异戊烯基转移酶使用5′-AMP和异戊烯二磷酸催化形成异戊烯基-腺苷-5′-单磷酸，为细胞分裂素生物合成的第一个中间体。IPT的过度表达使得在转基因植物中细胞分裂素的水平提高(Medfor等，Plant Cell 1403-413，1989)。植物细胞中IPT的表达可以诱导从转化的原生质体或叶片平板再生生理学异常的茎干。这种表型可以作为标记使用(Ebinuma等，Proc.Natl.Acad.Sci.942117-2121，1997)。CKI1(cytokinin-independent 1，不依赖细胞分裂素-1)基因的表达提供了相似的表型(Kakimoto，Science 274982-985，1996)。已描述了增加的细胞分裂素水平用作植物转化的选择标记，例如IPT的可诱导控制(美国专利6,452,068和美国专利6,326,192，两者通过引用结合到本文中)、ESR-2(美国专利6,441,276，通过引用结合到本文中)和ESR1-A(美国专利6,407,312，通过引用结合到本文中)的可诱导控制。在本发明中，细胞分裂素生物合成相关的蛋白优选为组成型表达。当这些基因在本发明DNA质粒构建体中作为载体骨架元件使用时，在含有载体骨架的单子叶植物细胞中诱导异常非胚胎产生的愈伤组织形成。本发明的DNA质粒尤其适用于单子叶植物细胞转化，尽管很少产生含有骨架DNA的胚芽。当用来转化双子叶植物细胞时，含有嵌合体细胞分裂素生物合成基因的细胞产生异常芽，其不能产生丰富的根。此外，降解细胞分裂素的酶如细胞分裂素氧化酶(美国专利6,229,066，通过引用结合到本文中)，在本发明中可以用作含有载体骨架的植物细胞的非致死负性选择标记转基因。
植物生长素如吲哚-3-乙酸(IAA)影响植物细胞的生长和发育，尤其是与其它植物激素联合使用时。细胞分裂素/植物生长素浓度比例的改变导致增强了植物的生长，优选发生在特定组织。例如，高细胞分裂素/植物生长素比例促进了茎的生长，相反低细胞分裂素/植物生长素比例促进了根的生长((Depicker等，(1983)Genetic Engineeringof Plants中，T.Kosunge，C.P.Meredith和A.Hollaender，eds.，PlenumPress，New York，154页)。尝试增加内源性IAA的合成，包括利用植物遗传工程使其含有细菌IAA生物合成基因。这些基因包括土壤杆菌IAA生物合成途径基因iaaM、iaaH、rolABC或其它从土壤杆菌种中分离到的具有提供植物生长素分子功能的根瘤或毛根基因。
通常而言，经由细菌酶表达高水平IAA的转基因植物显示出表型异常(Klee等，Genes Devel.186-96，1987；Schmulling等，EMBO J.72621-2629，1988)。这种转基因植物展现出比正常植物更高的结合IAA和游离IAA水平，特别是当细菌iaaM(色氨酸单加氧酶)和/或iaaH(吲哚乙酰胺水解酶)基因与强效异源启动子连接时(Sitbon，F.(1992)Transgenic Plants Overproducing IAA--A Model System To StudyRegulation of IAA Metabolism，Swedish University of Agricultural，Umea，Sweden)。玉米(Zea mays)中结合IAA的生物合成由UDP-葡萄糖吲哚-3-基乙酰基葡萄糖基转移酶所催化(EC 2.4.1.121；也称为IAA-葡萄糖合成酶，IAGlu合成酶，IAGlu转移酶；美国专利第5,919,998号和第6,489,541号，通过引用结合到本文中)。此酶的过度表达导致在组织培养物中细胞的异常生长。本发明考虑了植物生长素生物合成基因在载体骨架中的用途，为含有DNA质粒载体骨架DNA的植物细胞提供了可鉴别的表型。
现已经确立了乙烯的生物合成，使用S-腺嘌呤甲硫氨酸(SAM)和1-氨基环丙烷-1-甲酸(ACC)作为中间体将甲硫氨酸转化为乙烯。从SAM产生ACC由ACC合酶催化。ACC合酶在成熟时的果实和逆境植物(stressed plant)中产生，由高分歧基因家族编码(美国专利第5,723,766号，通过引用结合到本文中)。ACC向乙烯的转化是由乙烯形成酶(EFE)所催化(Spanu等，EMBO J 1991，10，2007)。例如，如美国专利第5,886,164号(通过引用结合到本文中)所描述，分离了1-氨基环丙烷-1-甲酸合酶(ACS)和乙烯形成酶(EFE)基因。将ACC转化为乙烯的ACC氧化酶在大多数组织中都是组成型表达(Yang等，Ann.Rev.Plant Physiol.1984，35，155)，但在果实成熟期间被诱导(Gray等，Cell 199 372，427)，ACC氧化酶或其同系物的DNA和蛋白组合物是有用的，如美国专利第6,043,409号中公开的，其通过引用结合到本文中。本发明的DNA构建体考虑了载体骨架中植物表达盒的存在，其在含有载体骨架DNA的植物细胞中提供乙烯生物合成酶的过度表达。ACC脱氨基酶通过将ACC转化为α-丁酮酸和氨，代谢ACC(美国专利第5,702,933号，通过引用结合到本文中)。表达ACC脱氨基酶的转化植物在它们的组织内降低了乙烯的水平。与不含有不敏感受体的植物相比，用乙烯不敏感受体ETR-1修饰的转化植物具有乙烯敏感度减弱的特征(美国专利第5,689,055号，通过引用结合到本文中)。本发明的DNA构建体考虑了载体骨架中植物表达盒的存在，其在含有载体骨架DNA的植物细胞中提供了乙烯降解酶或乙烯不敏感受体蛋白的过度表达。
植物激素脱落酸(ABA)被认为在胚胎发生后期起作用，主要是在胚胎发生的成熟期抑制萌发(Abscisic AcidPhysiology andBiochemistry，W.J.Davies和H.G.Jones，eds.(OxfordBios ScientificPublishers Ltd.)，99-124页，1991)。在拟南芥和玉米中鉴定了影响种子发育和ABA不敏感的突变。检测到拟南芥ABA不敏感(abi3)突变和玉米胎萌(vp1)突变主要在胚胎发生后期(McCarty等，Plant Cell 1，523-532，1989，和Parcy等，Plant Cell 6，1567-1582，1994)。VP1基因和ABI3基因都被分离到，并且发现共享了保守区域(Giraudat，J.Current Opinion in Cell Biology 7232-238，1995，和McCarty，D.R.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Bio.4671-93，1995)。VP1基因显示出具有转录激活因子的功能(McCarty等，Cell 66895-906，1991)。这就暗示ABI3具有相似的功能。美国专利第6,320,102号(通过引用结合到本文中)中描述了LEC1基因和相关的突变分子，即在胚胎发生后期导致与lec1或lec2相似缺陷的lec2、fus3-3和abi3-3。这些突变体对干燥不耐受，有时在母体萌发，具有活化的茎干顶端分生组织。Lec2和fus3-3突变体对ABA敏感，在它们的子叶上具有香毛簇(trichomes)，因此可以被归类为多叶子叶型突变体。abi3-3突变体属于不同类型的后期胚芽缺陷突变，对ABA不敏感，在子叶上不具有香毛簇。本发明的DNA构建体考虑载体骨架中植物表达盒的存在，其在含有载体骨架DNA的植物细胞中提供了ABA相关蛋白的过度表达，从而提供了辨别组织培养植物细胞中是否具有载体骨架的方法。
拟南芥中的Bas1基因编码了细胞色素P450(CYP 72B1)，在油菜素类固醇的信号转导或合成中起作用。Bas1基因在植物中的过度表达，形成了墨绿色、矮小的表型，模拟了具有低水平植物激素-油菜素内酯的植物(美国专利公开US20020073446，通过引用结合到本文中)。此基因和其它相关的植物激素信号转导基因的产物可以用于本发明以提供含有载体骨架DNA片段的植物异常表型，该DNA片段中包含这些基因作为非致死负性选择标记转基因。
代谢干扰基因包括编码蛋白的编码序列，所述蛋白对内源性植物细胞底物具有催化活性，而对细胞是非致死性的。所述底物包括但不限于单糖、脂肪酸、氨基酸或核苷酸。因此，代谢干扰基因编码了例如生物合成途径酶、从途径中转移底物的酶、降解或失活途径底物的酶或影响途径酶表达的基因产物，这些基因包括反义RNA分子或转录增强子和阻遏物。更具体而言，代谢干扰蛋白的实例包括但不限于蔗糖6-果糖基转移酶、转化酶和海藻糖合酶。代谢干扰基因的表达改变了植物细胞内底物的正常产生和分布。结果是减少了细胞的分裂、细胞的延伸或植物再生。代谢干扰基因可以包括与内源植物细胞基因互补的反义序列或当在植物细胞中表达时减少植物细胞分裂、细胞延伸或植物再生的转录物。本发明的DNA构建体考虑载体骨架中植物表达盒的存在，其在含有载体骨架DNA的植物细胞中提供了代谢干扰酶或反义RNA的过度表达，所述干扰酶或反义RNA的功能是作为代谢过程的阻遏分子。可以制备DNA构建体以提供反义RNA，当在植物细胞中表达时可以形成双链RNA分子，并且此反义RNA提供了对宿主靶基因的转录后基因抑制。
基因通常是指涉及产生多肽的DNA片段。这种DNA片段包括独立编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)以及编码区域前面的(5＇非编码DNA分子)和后面的(3′非编码DNA分子)调控分子。“天然基因”是指在自然中发现的基因，本身就具有调控DNA序列。“嵌合基因”是指任何非天然的基因，包括在自然中未被发现在一起的异源调控和编码序列。相应地，嵌合基因可以包含不同来源的调控序列和编码序列，或同一来源但排列方式不同于在自然中所发现的调控序列和编码序列。“转基因”为通过转化方法引入基因组从而产生转基因生物的基因。转基因也可以被构建为产生不编码多肽的基因产物，例如反义RNA。
遗传调控序列为基因的元件，当作为转基因连接时包括位于结构多核苷酸序列上游(5′非编码序列)、当中或下游(3′非编码序列)的多核苷酸分子，影响关联的结构多核苷酸序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列(如美国专利第5,659,122号)、内含子(如美国专利第5,424,412号)和多腺苷酸化识别序列。
在一个实施方案中，本发明的DNA构建体可含有启动子，能够引起本发明的转基因产物的过度表达，其中“过度表达”是指表达通常不存在于宿主细胞中的产物，或者存在于所述宿主细胞中的产物表达水平比编码所述多肽的内源性基因正常表达水平更高。能引起本发明转基因产物过度表达的启动子通常为本领域所已知，如病毒启动子(P-CaMV35S，美国专利第5,352,605号；P-FMV35S，美国专利第5,378,619号和第5,018,100号)、各种植物来源的启动子如植物肌动蛋白启动子(P-Os.Actl，美国专利第5,641,876号和第6,429,357号)。这些启动子是通常在大多数植物组织中表达的组成型启动子的实例。其它的组成型启动子为植物分子生物学领域所知，并且用于本发明。
可以修改本发明DNA构建体启动子的表达水平或模式以增强它的表达。可以使用本领域技术人员已知的方法将增强元件(例如CaMV35S启动子的子域，Benfey等，EMBO J.91677-1684，1990)插入到基因的5′序列。在一个实施方案中，可以加入增强元件用来产生启动子，此启动子包含了本发明基因天然启动子的时间和空间表达方式，但具有更高水平的表达量。相似地，通过使用特异活化或抑制基因表达的元件(例如，花粉特异性元件，Eyal等，1995 Plant Cell 7373-384)修饰启动子的5′区域，可以实现启动子的组织特异性表达。术语“启动子序列”或“启动子”是指一个多核苷酸分子，当以顺式与编码多肽的结构多核苷酸序列相连时，以指导一种或多种编码多肽的mRNA分子表达的方式发挥功能。这种启动子区域典型地被发现于三核苷酸ATG上游，位于多肽编码区域起始位点。启动子分子也可以包括DNA序列，从此序列开始转录转移RNA(tRNA)或核糖体RNA(rRNA)序列。转录包括合成代表DNA双链中一条链的RNA链。转录终止反应要求的DNA序列称为3′转录终止区域。
优选所选择的具体启动子应该能够引起足够的表达，从而导致产生有效量的产物以引起所需的表型。除了已知的引起植物细胞中DNA转录的启动子外，通过在植物cDNA库中筛选能够在靶组织中选择性或优先表达的基因，然后确定启动子区域，可以鉴定用于本发明的其它启动子。在植物组织培养以将植物细胞再生为植物的过程期间，表达相连的非致死负性选择标记基因产物的启动子在本发明中尤其有用。
能够在植物中用来表达转基因的启动子可以来源于编码胚胎贮藏蛋白的基因，可以用于嵌合转基因，所述编码胚胎贮藏蛋白的基因包括来源于欧洲油菜(Brassica napus)的编码2S贮藏蛋白的基因(Dasgupta等，Gene 133301-302，1993)；来源于拟南芥的2S种子贮藏蛋白基因家族；来源于欧洲油菜的编码油质蛋白20kD(千道尔顿)的基因(GenBank M63985)；来源于大豆的编码油质蛋白A(GenBankU09118)和油质蛋白B(GenBank U09119)的基因；来源于拟南芥的编码油质蛋白的基因(GenBank Z17657)；来源于玉米的编码油质蛋白18kD的基因(GenBank J05212，Lee，Plant Mol.Biol.261981-1987，1994)和来源于大豆的编码低分子量富硫蛋白的基因(Choi等，Mol.Gen.Genet.246266-268，1995)。来源于玉米醇溶蛋白编码基因的启动子(包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD和γ基因，Pedersen等，Cell 291015-1026，1982)可以用于嵌合转基因。玉米醇溶蛋白是一类发现于玉米胚乳的贮藏蛋白。在种子组织中表达的启动子本文中被称为P-种子，除非另有定义。
公认的是，已经描述了另外的可利用启动子，例如在美国专利第5,378,619号、第5,391,725号、第5,428,147号、第5,447,858号、第5,608,144号、第5,608,144号、第5,614,399号、第5,633,441号、第5,633,435号和第4,633,436号，所有这些专利整体结合到本文中。进一步公认的是，不能完全确定调节序列的确切边界，并且不同长度的DNA片断可以具有相同的启动子活性。本领域的技术人员可以鉴定除本文所述之外的启动子，所述启动子在本发明中功能为提供植物细胞非致死负性选择标记转基因多核苷酸分子的表达。
翻译前导序列为位于基因启动子序列和编码序列之间的DNA遗传元件。翻译前导序列在完全加工mRNA中存在于翻译起始序列上游。翻译前导序列可以影响初级转录物加工为mRNA、mRNA的稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例包括玉米和牵牛花热休克蛋白前导序列(美国专利第5,362,865号，通引用结合到本文中)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因前导序列和其它(Turner和Foster，molecular biotechnology 3225，1995)。
转运多肽通常是指多肽分子，当与相关蛋白连接时，指导蛋白进入特定的组织、细胞、亚细胞部位或细胞器。实例包括但不限于叶绿体转运肽、核导向信号和液泡信号。叶绿体转运肽在本发明中尤其有用，用于指导八氢番茄红素合酶表达到叶绿体。叶绿体转运肽(CTP)被改造为与N端蛋白融合，定向入植物叶绿体。许多叶绿体定位蛋白都从核基因表达为前体，并通过叶绿体转运肽(CTP)定向到叶绿体，并在输入步骤期间除去叶绿体转运肽。叶绿体蛋白的实例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS2，rubisco)的小亚基、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合体蛋白I和蛋白II以及硫氧还蛋白F。体内和体外试验证明，通过使蛋白与CTP融合，也可以将非叶绿体蛋白定向到叶绿体，而且CTP序列足够将蛋白定向到叶绿体。合适叶绿体转运肽，例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPSCTP(Kle等，Mol.Gen.Genet.210437-442，1987)和碧冬茄(Petuniahybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836873-6877，1986)的掺入，显示出在转基因植物中将异源蛋白定向到叶绿体。通过加入CTP(WO 9714807，美国专利第6,429,356号，通过引用结合到本文中)，可以将转基因植物中的八氢番茄红素合酶的表达定向到叶绿体。本领域技术人员公认，假如需要，可以制造各种嵌合构建体，利用特殊CTP的功能将八氢番茄红素合酶或其它非致死负性选择标记基因产物输入植物叶绿体。
3′非翻译序列或3′终止区是指位于结构核苷酸序列下游的DNA序列，包括编码多腺苷酸化和其它影响转录、mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。多腺苷酸化信号在植物中的功能为致使多聚腺苷酸添加到mRNA前体的3′末端。多聚腺苷酸化序列可以来源于天然基因、各种植物基因或T-DNA。多聚腺苷酸化序列的一个实例为胭脂氨酸合酶3′序列(nos 3′；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804803-4807，1983)。Ingelbrecht等例证了不同3′非翻译序列的用途(PlantCell 1671-680，1989)。
本文所使用的重组DNA技术中的实验室操作为本领域中熟知的和常用的操作。使用标准技术进行克隆、DNA和RNA分离、扩增和纯化。包括DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶反应通常按照生产厂商的说明进行。这些技术和其它各种技术通常依据Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆一实验室操作指南)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York(1989)进行，本文称为Sambrook等。
植物重组DNA构建体和转化植物本发明的分离多核酸分子可以具体用于创造转基因农作物，其中过度表达了本发明的多肽。植物细胞中这些多肽的过度表达可以降低植物细胞再生为完整植物的速度，或产生不需要添加外源性底物即可容易通过眼睛辨别的表型。本发明的DNA质粒可被转化入转基因农作物植物细胞。
转基因农作物植物含有外源多核苷酸分子，插入农作物植物细胞的基因组。农作物植物细胞，包括但不限于进一步组成以下部分的植物细胞悬浮培养物、胚芽、分生组织部位、愈伤组织、叶、根、枝、配子体、孢子体、胚珠、花粉和小孢子、种子和果实。“外源”是指来源于植物外的被引入到植物中的多核苷酸分子。外源性多核苷酸分子可以具有天然出现的或非天然出现的核苷酸序列。本领域的技术人员了解，外源性多核苷酸分子可以是来源于不同物种的异源分子，所述物种不同于待引入多核苷酸分子的植物，或者多核苷酸可以来源于与待引入多核苷酸分子的植物相同的植物物种。当外源性多核苷酸(转基因)在转基因植物中表达时，可提供农艺学重要的性状。有农艺学意义(GOI)的转基因为农作物提供了有益的农艺学性状，例如包括但不限于包括以下的遗传元件除草剂抗性(美国专利第5,633,435号；美国专利第5,463,175号)、增加产量(美国专利第5,716,837号)、害虫防治(美国专利第6,063,597号；美国专利第6,063,756号；美国专利第6,093,695号；美国专利第5,942,664号；美国专利第6,110,464号)、真菌病抗性(美国专利第5,516,671号；美国专利第5,773,696号；美国专利第6,121,436号；美国专利第6,316,407号和美国专利第6,506,962号)、病毒抗性(美国专利第5,304,730号和美国专利第6,013,864号)、线虫抗性(美国专利第6,228,992号)、细菌病抗性(美国专利第5,516,671号)、淀粉生产(美国专利第5,750,876号和美国专利第6,476,295号、修饰油脂生产(美国专利第6,444,876号)、高油产量(美国专利第5,608,149号和美国专利第6,476,295号)、修饰脂肪酸内含物(美国专利第6,537,750号)、高蛋白产量(美国专利第6,380,466号)、果实催熟(美国专利第5,512,466号)、增强的动物和人体营养(美国专利第5,985,605号和美国专利第6,171,640号)、生物多聚物(美国专利第5,958,745号和美国专利公开US20030028917)、环境应激抗性(美国专利第6,072,103号)、药用肽(美国专利第6,080,560号)、改进的加工性状(美国专利第6,476,295号)、改进的可消化性(美国专利第6,531,648号)、低棉子糖(美国专利第6,166,292号)、工业酶生产(美国专利第5,543,576号)、改进风味(美国专利第6,011,199号)、固氮作用(美国专利第5,229,114号)、杂种生产(美国专利第5,689,041号)和生物燃料生产(美国专利第5,998,700号)，以上列举的专利中描述的遗传元件和转基因通过引用结合到本文中。
本发明也提供植物重组DNA构建体，用于生产转基因农作物。可以使用本领域技术人员熟知的方法制备本发明的农作物重组DNA构建体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。这类技术描述于Sambrook等(1989)。通过土壤杆菌介导的转化或其它植物转化领域中技术人员已知的方法，可以将通过上述方法创造的外源性多核苷酸分子转入农作物植物细胞。
DNA构建体通常为双Ti质粒边缘DNA构建体，具有Ti质粒的右缘(RB或AGRtu.RB)和左缘(LB或AGRtu.LB)，Ti质粒从根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分离到，包含T-DNA(转化DNA)，该T-DNA与土壤杆菌细胞提供的转移分子一起允许T-DNA整合到植物细胞的基因组。DNA构建体也含有载体骨架DNA片段，在细菌细胞中提供了复制功能和抗生素选择性，例如大肠杆菌复制起始区如ori322，广谱宿主性复制起始区如Ec.oriV或oriRi，和选择标记的编码区如编码Tn7氨基糖苷腺苷转移酶(aadA)(赋予大观霉素或链霉素抗性)的Spec/Strp，或庆大霉素(Gm，Gent)选择标记基因。对于植物转化，宿主细菌菌株通常为根瘤土壤杆菌ABI、C58或LBA4404，不过其它植物转化领域技术人员已知的菌株在本发明中也可发挥功能。本发明提供的DNA构建体在载体骨架内含有植物表达盒，当在植物细胞中表达是，产生了非致死产物，优选降低植物细胞再生为完整植物的效率，或产生具有异常表型的植物或植物部分。
本发明DNA构建体的T-DNA典型地包含一个或多个有农艺学意义的转基因，以及赋予植物细胞选择表型的正向选择标记。此标记可以提供抗正向选择化合物的抗性，例如抗生素抗性(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素等)或除草剂抗性(例如包括但不限于草甘磷、草铵磷、磺酰脲类、咪唑啉酮类、溴苯腈、delapon、cyclohezanedione、原卟啉原氧化酶抑制剂和isoxasfiutole除草剂)。编码有关除草剂耐受性蛋白的多核苷酸分子为本领域所已知，包括但不限于编码以下酶的多核苷酸分子5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS，描述于美国专利号第5,627,061号，第5,633,435号，第6,040,497号；Padgette等，Herbicide Resistant Crops，Lewis Publishers，53-85，1996；和Penaloza-Vazquez等，Plant Cell Reports 14482-487，1995)；草甘磷抗性的aroA(美国专利第5,094,945号)；耐受溴草腈的溴草腈腈水解酶(Bxn)(美国专利第4,810,648号)；八氢番茄红素去饱和酶(crtI，Misawa等，(1993)Plant J.4833-840，和(1994)Plant J.6481-489)；耐受氟草敏的乙酰羟酸合酶(AHAS，aka ALS，Sathasiivan等，Nucl.Acids Res.182188-2193，1990)；耐受草铵磷和双丙氨磷的bar基因(DeBlock等，EMBO J.62513-2519，1987)。
除了选择标记，也可以希望使用报道基因。在一些情况中，报道基因可以单独或与选择标记一起使用。报道基因为典型地不存在于受体生物或组织中的基因，典型地编码导致某些表型变化或酶特性的蛋白。Wising等，Ann.Rev.Genetics，22，421(1988)中提供了这种基因的实例，其通过引用结合到本文中。优选的报道基因包括大肠杆菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、来源于大肠杆菌Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来源于生物发光水母维多利亚水母(Aequorea Victoria)的绿色荧光蛋白、来源于北美萤火虫(Photinuspyralis)的荧光素酶基因。然后在将所述基因引入受体细胞后的合适时间，进行检测报告基因表达的测定。优选这种测定需要使用编码大肠杆菌uidA基因座β-葡萄糖苷酸酶的基因以鉴定转化细胞，如Jefferson等(Biochem.Soc.Trans.15，17-19，1987)所描述，本文称为GUS。
通过合适的土壤杆菌介导的植物转化方法，可以将本发明的DNA构建体引入所需的植物宿主基因组。对于土壤杆菌介导的转化，合适的植物转化质粒构建体包括来源于根瘤土壤杆菌Ti质粒的构建体，和例如由Herrera-Estrella等，(Nature 303209，1983)；Bevan，(Nucleic Acids Res.128711-8721，1984)；Klee等，(Bio-Technology 3637-642，1985)所公开的构建体。通过根瘤土壤杆菌介导的转化来转化植物的方法包括Fraley等，(Bio/Technology 3629-635，1985)和Rogers等，(Methods Enzymol.153253-277，1987)。通过使用经过遗传工程改造的属于土壤杆菌属的土壤细菌，可以完成根瘤土壤杆菌介导的转化。某些土壤杆菌菌种介导称为“T-DNA”的特殊DNA的转移，其可以经过遗传工程改造将任何需要的DNA片段携带入许多植物物种。构成T-DNA介导发病机理的主要事件是诱导致病基因和T-DNA的加工和转移。这种过程为许多综述的题目(Ream.Ann.Rev.Phytopathol.27583-618，1989；Howard and Citovsky，Bioassays，12103-108，1990；Kado，Crit.Rev.Plant Sci.101-32，1991；Winnans，Microbiol.Rev.5612-31，1992；Zambryski，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，43465-490，1992；Gelvin，In Transgenic Plants，S.D.Kung and R.Wu eds.，Academic Press，San Diego，49-87页，1993；Binns和Howitz，In Bacterial Pathogenesis of Plants and Arimals(Dang，J.IL.，ed.).BerlinStringer Verlag，119-138页，1994；Hooykaas和Beijersbergen，Ann.Rev.Pliytopathol.32157-179，1994；Lessl和Lanka，Cell 77321-324，1994；Zupan和Zambryski，Ann.Rev.Phytopathol.27，583-618，1995)。
植物细胞再生技术依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的操作，也典型地依赖于杀虫剂和/或除草剂标记，这些标记与所需的核苷酸序列一起被引入。选择具有合适方案的方法用于来源于以下的宿主豆科(Leguminoseae)(苜蓿、大豆、三叶草等)，伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜、芹菜、欧洲防风)，十字花科(Cruciferae)(卷心菜、萝卜、canolal/油菜等)，葫芦科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黄瓜)，禾本科(Gramineae)(小麦、大麦、稻、玉米等)，茄科(Solanaceae)(马铃薯、烟草、番茄、胡椒)，各类花卉作物如向日葵，坚果树如扁桃、腰果、核桃和美洲山核桃。例如参见Ammirato等，Handbook of PlantCell Culture-Crop Species；Macmillan Publ.Co.(1984)；Shimamoto等，Nature 338274-276(1989)；Fromm，UCLA Symposium on MolecularStrategies for Crop Improvement，April 16-22，1990；Keystone，CO(1990)；Vasil等，Bio/Technology 8429-434(1990)；Vasil等，Bio/Technology 10667-674(1992)；Hayashimoto，Plant Physiol.93857-863(1990)和Data等，Bio-technology 8736-740(1990)。这种再生技术通常描述于Klee等，Ann.Rev.Plant Phys.38467-486(1987)。在本发明实施过程中，通过将转基因DNA构建体引入植物基因组转化植物的方法和组合物可以包括任何熟知和已证明的方法。例如，在美国专利第5,824,877号、第5,591,616号和第6,384,301号中阐述了土壤杆菌介导的转化，以上所有专利通过引用结合到本文中。
通过实施本发明可以制备的植物包括但不限于洋槐、苜蓿、莳萝(aneth)、苹果、杏、朝鲜蓟、芝麻菜(arugula)、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、黑莓、蓝莓、花茎甘蓝、抱子甘蓝、卷心菜、芸苔、美国香瓜(cantaloupe)、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、芫荽、柑桔、金钱橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松(Douglas fir)、茄子、菊苣、茅菜(escarole)、桉树、茴香、无花果、森林树、葫芦、葡萄、葡萄柚、蜜露(honey dew)、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭葱(leeks)、柠檬、酸柚(lime)、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、燕麦、秋葵、洋葱、橙、观赏植物(ornamental plant)、木瓜、欧芹(parsley)、豌豆、桃树、花生、梨、胡椒、柿、松树、菠萝、车前草、李子、石榴、白杨、马铃薯、西葫芦、温柏、辐射松木、苣莴(radicchio)、萝卜、悬钩子、稻、黑麦、高梁、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、香枫(sweetgum)、橘子、茶、烟草、番茄、草皮(turf)、葡萄树、西瓜、小麦、山药和翠玉瓜(zucchini)。
提供下面的实施例以更好的说明本发明的实施，并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。本领域的技术人员应认识到，可对本文所述的方法和基因进行各种修饰、加入、置换、截短等，而不背离本发明的精神和范围。
实施例实施例1DNA质粒本发明的DNA质粒为含有T-DNA片段和载体骨架片段的DNA构建体。T-DNA侧面为土壤杆菌Ti质粒边缘区[右缘(RB)和左缘(LB)区]，且含有正向选择标记基因和有农艺学意义的基因(GOI)。载体骨架片段含有非致死负性选择标记基因和质粒维持元件。作为对照用于比较目的的DNA质粒含有相同或相似T-DNA表达盒，但在载体骨架中不含有非致死负性选择标记基因。
图1中图解了本发明质粒的基本设计。在此图解中，RB和LB元件侧面为T-DNA，这些边缘元件可以用其它相似元件或有关DNA分子的片断取代，这些片断的功能是作为土壤杆菌致病基因所提供的核酸内切酶的酶切位点。这些选择标记基因可以选自许多已知的提供植物抗正向选择化合物的基因，正向选择化合物例如抗生素如卡那霉素、潮霉素、庆大霉素，或除草剂如草甘磷、草铵磷、磺酰脲类、咪唑啉酮类、溴草腈、delapon、cyclohezanedione、原卟啉原氧化酶抑制剂和isoxasflutole除草剂。可以选择有农艺学意义的基因以提供任何数量的对植物有用的性状。本发明在DNA构建体中提供了有农艺学意义的基因实例，包括但不限于除草剂耐受性基因、昆虫抗性基因和增产基因。
尤其用于在单子叶植物细胞中表达的DNA构建体含有crtB DNA编码序列，所述编码序列具有相连的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶亚单位叶绿体转运肽前导序列(SSU，TS-Ps.RbcS2，美国专利第6,429,356号的SEQ ID NO1，通过引用结合到本文中)，有效连接到强力组成型启动子(P-CaMV.35Sen，美国专利第5,359,142号，具有重复增强子的CaMV 35S启动子)、玉米Hsp70内含子(I-Zm.DnaK，美国专利第5,593,874号)和从根瘤土壤杆菌胭脂氨酸合酶基因(T-AGRtu.nos 3′)分离到的3′终止区，如pMON80101(图2)中所图解，此表达盒位于载体骨架DNA片段中。pMON80101中，T-DNA含有的植物表达盒既为选择标记又为有农艺学意义的基因(草甘磷耐受性)。这种表达盒包含了来源于水稻actin1(P-Os.Actl，美国专利第5,641,876号)的启动子、前导序列和内含子，与从拟南芥ShkF基因分离到的叶绿体转运肽(CTP2)相连，再连接到来源于根瘤土壤杆菌的aroA-CP4编码序列(美国专利第5,633,435号)，再连接到从根瘤土壤杆菌胭脂氨酸合酶基因分离到的3′终止区。
crtB编码序列编码了八氢番茄红素合酶(本发明的SEQ ID NO1，或其它编码八氢番茄红素合酶的DNA分子如美国专利第6,429,356号的SEQ ID NO1)，含有此crtB编码序列的DNA构建体被构建为尤其用于在双子叶植物细胞中表达，在pMON77406中有图解(图3)。P-CaMV.35Sen启动子为强效组成型启动子，指导crtB基因产物在植物细胞中表达。这种构建体含有选择标记基因(P-FMV35S/L-Ph-Hsp70/CTP2-aroA-CP4/T-RbcS2-E9)表达盒，提供了草甘磷抗性EPSPS酶(aroA-CP4)的强效组成型表达。P-FMV启动子(美国专利第5,378,619号)、从碧冬茄(Petunta hybrida)Hsp70基因(美国专利第5,362,865号)分离到的翻译前导序列、从拟南芥EPSPS分离到的叶绿体转运肽(CTP2)与aroA-CP4草甘磷抗性EPSPS编码序列有效连接，并与豌豆核酮糖二磷酸加氧酶-羧化酶小亚基3′终止区连接，也被称为E9。此外，也可以在T-DNA内添加表达盒(有农艺学意义的转基因)，以为含有T-DNA的转基因植物提供增强的农艺学表型。
图4中(pLAGILB01.0033)图解的DNA构建体含有提高产量的转基因(P-Seed/I-Zm.DnaK-Hsp70/Cglut.CordapA/T-AGlttu.Tr7)和草甘磷选择标记基因。P-种子启动子的功能是在种子组织中表达，其与玉米Hsp70内含子连接。CordapA基因(棒杆菌(Corynebacterium)dapA，Bonnassie等，Nucleic Acids Res.186421，1990)编码了DHDPS酶，此酶对赖氨酸的抑制作用不敏感。转录终止区来源于根瘤土壤杆菌Tr7基因。crtB非致死负性选择标记转基因位于载体骨架DNA。
图5中(pLAGILB01.0037)图解的DNA构建体含有两个昆虫抗性转基因，此转基因的多核苷酸编码Bt.EG11768蛋白(美国专利第6,242,241号)和Bt.cryIIAb蛋白(美国专利第6,489,542号)。crtB基因位于骨架DNA，由P-CaMV.35Sen启动子驱动表达。
图6中(pMON69869)图解的DNA构建体含有用于表达选择标记aroA:CP4的遗传元件，此选择标记提供了草甘磷抗性，并且在载体骨架DNA中含有非致死负性选择标记转基因和来源于根瘤土壤杆菌的编码IPT酶多核苷酸(ipt或AGRtu.Ipt，SEQ ID NO2)。图7中(pMON75157)图解的DNA构建体显示了含有另外的遗传元件的质粒，所述遗传元件用于表达AGRtu.ipt编码序列。这种表达盒可以用在DNA质粒载体骨架中，用于土壤杆菌介导的植物细胞的转化。
图8中(pMON75182)图解的DNA构建体在T-DNA中含有可计分标记基因(GUS)和正向选择标记基因(AGRtu.nptII的转基因。在载体骨架DNA上含有AGRtu.ipt编码序列。所述可计分标记基因可用有农艺学意义的转基因(GOI)代替，以为农作物提供有价值的农艺学性状。
图9中(pLAGILB01.0035)图解的DNA构建体在T-DNA中含有提高产量转基因(P-Seed/I-Zm.Dnak-Hsp70/Cglut.CordapA/T-AGRtu.Tr7)和草甘磷选择标记转基因的转基因。在载体骨架DNA中含有ipt表达盒(P-CaW.35Sen/I-Zm.DNAK/ipt/T-AGRtu.nos3′)。
图10中(pLAGILB01.0038)图解的DNA构建物体含有2个昆虫抗性转基因，此转基因的多核苷酸编码了Bt.EG11768蛋白和Bt.cryIIAb蛋白。AGRtu.ipt基因位于骨架DNA，由P-CaMV.35Sen启动子驱动表达。
图11中(pMON75183)图解的DNA构建体在T-DNA中含有可计分标记基因(GUS)的转基因和正向选择标记基因(AGRtu.nptII)的转基因。载体骨架DNA上含有codA编码序列。codA提供了条件致死型选择标记。在植物再生期间，将愈伤组织转入含有5-氟胞嘧啶的培养基中，表达胞嘧啶脱氨酶的植物细胞将被杀死，只留下不含有载体骨架DNA的植物细胞。可计分标记基因可以用有农艺学意义的转基因代替，以为农作物提供有价值的农艺学性状。
图12中(pMON75181)图解的DNA构建体在T-DNA中含有可计分标记基因(GUS)的转基因和正向选择标记基因(AGRtu.nptII)的转基因。该T-DNA含有同pMON75183一样的表达盒。crtB非致死负性选择标记基因位于载体骨架DNA中。
图13中(pMON42066)图解的DNA构建体在T-DNA中含有可计分标记基因(GUS)转基因和正向选择标记基因(AGRtu.nptII)的转基因。该T-DNA中含有同pMON75183和pMON75181一样的表达盒。在载体骨架DNA中没有任何植物细胞非致死负性选择标记(没有基因)。
图16中(pMON73564)图解的DNA构建体在T-DNA中含有正向选择标记基因(AGRtu.aroA-CP4)的转基因，并且含有包含启动子和有关基因的表达盒。在载体骨架DNA中没有任何植物细胞非致死负性选择标记(没有基因)。
图17中(pMON73565)图解的DNA构建体在T-DNA中含有正向选择标记基因(AGRtu.aroA-CP4)的转基因，并且含有包含启动子和有关基因的表达盒。crtB非致死负性选择标记基因位于载体骨架DNA。
图20中(pMON67935)图解的DNA构建体在T-DNA中含有正向选择标记基因(AGRtu.aroA-CP4)的转基因，并且含有包含启动子和有关基因的表达盒。在载体骨架DNA中没有任何植物细胞非致死负性选择标记(没有基因)。
图21中(pMON67936)图解的DNA构建体在T-DNA中含有正向选择标记基因(AGRtu.aroA-CP4)的转基因，并且含有包含启动子和有关基因的表达盒。crtB非致死负性选择标记转基因位于载体骨架DNA。
图24中(pMON83912)图解的DNA构建体在T-DNA中含有正向选择标记基因(AGRtu.aroA-CP4)的转基因，并且含有包含GUS报道基因的表达盒。植物细胞表达盒位于载体骨架DNA，含有非致死负性选择标记基因，该基因编码多花菜豆(Phaseolus coccmeus)赤霉素2-氧化酶(SEQ ID NO3)。
图25中(pMON83908)图解的DNA构建体在T-DNA中含有正向选择标记基因(AGRtu.aroA-CP4)的转基因，并且含有包含GUS报道基因的表达盒。植物细胞表达盒位于载体骨架DNA，含有非致死负性选择标记基因(CKX1，SEQ ID NO4)，该基因编码细胞分裂素氧化酶(SEQ ID NO3)。
图25中(pMON83907)图解的DNA构建体在T-DNA中含有正向选择标记基因(AGRtu.aroA-CP4)的转基因，并且含有包含GUS报道基因的表达盒。植物细胞表达盒位于载体骨架DNA，含有非致死负性选择标记基因(sacB，SEQ ID NO5)，该基因编码蔗糖6-果糖基转移酶。
可以以类似如上所述的方式构建DNA构建体，使在载体骨架上包含其它代谢干扰基因。这些干扰基因的实例包括但不限于编码酵母转化酶(SEQ ID NO6)和编码酵母海藻糖-6-磷酸合酶(SEQ IDNO7)的多核苷酸。
实施例2农作物转化将本发明所描述的DNA构建体(如pMON42066、pMON75181、pMON75182和pMON75183)转化入无害的土壤杆菌菌株中。例如通过三亲交配法(Ditta等，Proc.Natl.Acad.Sci.777347-7351，1980)，或通过电穿孔法，将DNA构建体转入土壤杆菌。土壤杆菌的液体培养物从甘油保藏物或新鲜划线平板开始，并在pH7.0、含有适当抗生素的LB液体培养中，26℃-28℃振荡(大约150rpm)培养过夜至对数生长中期。将土壤杆菌细胞重悬浮于接种培养基，并调整OD660至约为1。
使用本领域已知的各种方法，通过土壤杆菌介导的转化，进行玉米细胞的转化和细胞再生为完整的能育植物。例如，使表面已灭菌的玉米种子发芽，并将幼苗切成碎片。将每一个具有伤口表面的苗碎片向下置于半固体愈伤组织诱导MSW57培养基，每个平皿中放置10-16个碎片，置于28℃光Percival培养箱中培养(16小时光周期)。2-4星期后，将有胚胎产生的愈伤组织转入新鲜MSW57培养基中，28℃黑暗下培养2-3星期。
在培养皿(100mm×25mm)中选择先前再次培养了6-8天的愈伤组织碎片。每一个平皿含有300-500个愈伤组织碎片。每1ml土壤杆菌悬浮液(该土壤杆菌含有本发明的DNA质粒)中加入1μl F-68(Pluronic F-68溶液10％ Sigma-Aldrich，St Louis，MO)，然后将足够的此悬浮液覆盖所述组织。室温下培养5-20分钟。用顶端精密的移液管除去土壤杆菌悬浮液。倾倒愈伤组织碎片于培养皿，在培养皿底部有3片无菌滤纸(Whatman#1，直径为8.5或9cm)，在顶部有2片滤纸。倒置几次，对它们进行简单印迹。将愈伤组织碎片(每60-100个)转入无水或无培养基的培养皿中，此平皿带有1片滤纸，用石蜡膜密封平皿。在黑暗中23℃培养平皿2-3天。
通过将2片毡(2cm×2cm平方)置于各个培养皿中，制备培养平板，每个培养平板中含有23-25ml MSW57/C500/P100(羧苄青霉素500mg/L，巴龙霉素100mg/L)培养基，培养基组成参见表1。将愈伤组织转移入培养平板。在转移的时候，将愈伤组织分成小碎片(2-3mm)，每个培养平板可以含有16-25个愈伤组织碎片。黑暗中27℃下培养平板大约2星期。去除选择培养基，然后加入18-20ml新鲜培养基。黑暗中27℃下培养平板大约2星期。去除选择培养基，用18-20ml MS/6BA/C250/P100培养基代替(将转化的组织转入含有25mg/L-1000mg/L 5-氟胞嘧啶的培养基中，所述组织用包含codA基因的DNA质粒转化)。将平板移至光培养箱(16小时光周期，27℃)培养5-7天，然后将生长组织移至MSOD/C250/P100固体培养基。在此培养基中培养大约2星期。愈伤组织将再生为有根或无根的绿色茎干。这些茎干应当看起来健康，并且容易与一些小茎干区别。将健康的茎干转入用3g/l Phytagar固化的MSOD/C250/P100培养基中。转移时，除去附着在茎干的根区域的愈伤组织。培养扩大茎干和根，然后转入土壤。
表1.培养基组成MSW57
通过植物转化和组织培养领域已知的方法，可以转化双子叶植物细胞并再生为完整的植物。使用土壤杆菌介导的方法转移本发明质粒的T-DNA为本领域所熟知。例如棉花(美国专利第5,004,863号；美国专利第5,159,135号；美国专利第5,518,908号，通过引用结合到本文中)、大豆(美国专利第5,569,834号；美国专利第5,416,011号，通过引用结合到本文中)。
上述转化和再生方法提供了载体骨架DNA出现大大减少的植物。此外，该植物还具有插入T-DNA的拷贝数降低的优点。通过该方法生产的植物是本发明的一个方面。
实施例3骨架DNA和拷贝数的分子分析从用本发明DNA质粒转化的并由植物细胞组织培养物再生的植物中分离组织样品，从该组织样品中抽提DNA。使用基于PCR的方法测定DNA，确定Ec.oriV DNA片断是否存在，该Ec.oriV DNA片断为载体骨架的指示。这种DNA靠近LB，其存在于从再生植物抽提的DNA中表明发生了超过了LB的载体序列转移。可通过许多方法从植物组织中分离DNA，例如CTAB方法(Rogers等，Plant Mol.Biol.569-76，1985)或按照厂家说明书使用DEAeasyTM 96植物试剂盒(Cat.#69181，Qiagen Inc.，Valencia，CA)。Taqman(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)被描述为检测和定量DNA序列存在的方法，按照厂家提供的说明书完全可以理解。表2中列举的DNA引物分子用于所描述的方法中，以鉴定来源于植物提取物的Ec.oriVDNA。本领域技术人员可以改变条件和装置而提供相同的结果。
使用以下质粒转化玉米植物细胞对照DNA质粒(pMON42066)、在载体中具有条件致死基因的DNA质粒(pMON75183)、具有非致死选择标记基因的DNA质粒(ipt，pMON75182)和具有非致死选择标记基因的DNA质粒(crtB，pMON75181)，然后再生为完整的植物。分析完整植物是否存在Ec.oriV。
图14显示了此分析结果。35株使用对照质粒(没有基因，pMON42066)转化后再生的植物中，大约有一半为Ec.oriV DNA阳性，且77株用条件致死基因质粒(codA，pMON75183)转化的植物中约35％为阳性。令人惊讶的是，非致死选择标记基因，ipt和crtB，按预期减少了具有Ec.oriV DNA的转基因植物的出现。83株用pMON75182转化的植物中只有5％含有Ec.oriV DNA，61株用pMON75181转化的植物中只有8％含有Ec.oriV DNA。
这些结果证明，通过减少载体骨架的出现，本发明DNA质粒带来了实质性益处。用常规DNA质粒结构(pMON42066)转化的植物中接近一半将被清除。使用本发明DNA质粒(pMON75182，pMON75181)转化的植物中，被清除的少于10％。
表2Ec.OriV Endpoint Taqman测定-10uL反应
条件MJ引擎
另一个商业化转基因植物的重要因素是低插入复杂性的出现。这通常指的是低拷贝数。假如插入的拷贝数太高，很难选择子代并成功繁殖转基因性状。理想的是，只有单拷贝的转基因能存在于转基因植物中。若干分子生物学领域已知的方法可以检测拷贝数。DNA印迹分析是最常用的方法。使用Taqmant技术的方法也可以精确且可靠的检测插入转基因植物的T-DNA的拷贝数。表3中列举的方法和DNA引物分子表明怎样测定植物是否存在nptII编码序列。含有nptII选择标记基因的表达盒存在于pMON42066、pMON75183和pMON75182中。通过Taqman方法对用这些DNA质粒转化的植物进行拷贝数测定，结果显示在
图15中。骨架中没有基因的质粒(pMON42066)显示，所测定的34株植物的平均拷贝数约为2，只有47％为单拷贝。条件致死选择标记(codA，pMON75183)质粒显示，测定的50株植物的平均拷贝数约为2，只有36％的植物为单拷贝。非致死选择标记基因(ipt，pMON75182)质粒显示，测定的27株植物的平均拷贝数为1.2，令人惊讶的是，85％的转基因植物为单拷贝。结果表明本发明质粒降低转基因拷贝数的价值。
表3.NPTII Taqman测定ABI 7900(384孔板)
条件MJ引擎
例如，使用前述的方法将DNA构建体pMON73564和pMON73565转化入玉米细胞。使用前述测定Ec.oriV DNA的条件测定所得的转基因玉米植物是否存在骨架DNA。
图18中显示的结果表明，几乎所有用pMON73565(crtB+，骨架中的非致死选择标记基因)转化后再生的植物(N＝104)都没有Ec.oriV。用对照构建体pMON73564(crtB-，骨架中没有标记基因)转化的植物(N＝115)中40％在它们的基因组中含有Ec.oriV DNA。测定相同组的植物的拷贝数，结果显示在
图19中。这些结果表明，与用pMON73564构建体转化的植物相比，实质上更多的用pMON73565(crtB+构建体)转化的植物具有低拷贝数，且无骨架，该pMON73564在骨架中不含有非致死选择标记基因。这些结果证明，DNA构建体中非致死选择标记基因的应用提供了实质上更多具有商业品质的植物。
例如通过前述的转化方法，使用DNA构建体pMON67935和pMON67936转化玉米细胞，从中收集的数据为载体骨架中含有的非致死选择标记基因的效用提供了另外的证据。使用前述检测Ec.oriVDNA的条件测定所得的转基因玉米植物是否存在骨架DNA。结果在图22中显示，表明用pMON67936(crtB+，在骨架中的非致死选择标记基因)转化后再生的植物(N＝54)中超过90％不含有Ec.oriV。用对照构建体pMON67935(crtB-，骨架中没有标记基因)转化的植物(N＝84)中约40％在它们的基因组中有Ec.oriV DNA。测定相同组的植物的拷贝数，结果在图23中显示。这些结果表明，与用pMON67935构建体转化的植物相比，实质上更多的用pMON67936(crtB+构建体)转化的植物具有低拷贝数，且无骨架，该pMON67935在骨架中不含有非致死选择标记基因。这些结果证明，DNA构建体中非致死选择标记基因的应用实质上提供了更多具有商业品质的植物。
已经阐明和描述了本发明的原则，对于本领域的技术人员显而易见的是，可以在排列和细节上改变本发明而不背离这种原则。我们要求保护后附权利要求书的精神和范围之内的所有修改。
本说明书中引用的所有出版物和出版的专利文件都通过引用结合到本文中，其程度等同于具体和单独地指出各出版物和专利申请通过引用结合到本文中。
序列表<110>Gilbertson，Larry AKrieger，Elysia KYe.XudongZhang，Wanggen<120>增加商业化转基因植物产生的DNA构建体和方法<130>38-21(52967)B<150>60/461,459<151>2003-04-09<160>16<210>1<211>930<212>DNA<213>草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)<400>1atgagccaac cgccgctgct tgaccacgcc acgcagacca tggccaacgg ctcgaaaagt 60tttgccaccg ctgcgaagct gttcgacccg gccacccgcc gtagcgtgct gatgctctac 120acctggtgcc gccactgcga tgacgtcatt gacgaccaga cccacggctt cgccagcgag 180gccgcggcgg aggaggaggc cacccagcgc ctggcccggc tgcgcacgct gaccctggcg 240gcgtttgaag gggccgagat gcaggacccg gccttcgctg cctttcagga ggtggcgctg 300acccacggta ttacgccccg catggcgctc gatcacctcg acggctttgc gatggacgtg 360gctcagaccc gctatgtcac ctttgaggat acgctgcgct actgctatca cgtggcgggc 420
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物分子<400>8aacgcctgat tttacgcgag 20<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物分子<400>9caataccgca gggcacttat c21<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>标记DNA引物分子<400>13tccagtacgt gcagtccctc ctccc25
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<223>DNA引物分子<400>15ggtggtcgaa tgggcaggta gc 22<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>标记DNA引物分子<400>16actgaagcgg gaagggactg gct 2权利要求
1.一种DNA质粒，所述质粒包含T-DNA，所述T-DNA包含土壤杆菌(Agrobacterium)Ti质粒第一边界区，所述第一边界区与至少一个转基因相连，再与土壤杆菌Ti质粒第二边界区相连，并且植物表达盒位于所述DNA质粒中T-DNA外，包含与载体骨架DNA相连的植物细胞非致死负性选择标记基因。
2.权利要求1的DNA质粒，其中所述植物表达盒包含在植物细胞中发挥功能的启动子，所述启动子有效连接到植物细胞非致死负性选择标记基因。
3.权利要求2的DNA质粒，其中所述启动子为组成型启动子。
4.权利要求2的DNA质粒，其中所述启动子在植物再生期间在组织培养物中表达所述连接的非致死负性选择标记基因产物。
5.权利要求1的DNA质粒，其中所述植物细胞非致死负性选择标记基因包括植物激素生物合成途径基因。
6.权利要求1的DNA质粒，其中所述植物细胞非致死负性选择标记基因包括植物激素降解基因。
7.权利要求1的DNA质粒，其中所述植物细胞非致死负性选择标记基因包括植物激素生物合成途径底物转移基因。
8.权利要求1的DNA质粒，其中所述植物细胞非致死负性选择标记基因包括植物激素信号转导基因。
9.权利要求1的DNA质粒，其中所述植物细胞非致死负性选择标记基因包括代谢干扰基因。
10.权利要求1的DNA质粒，其中所述转基因为选自抗生素抗性和除草剂抗性的植物正向选择标记基因。
11.权利要求1的DNA质粒，其中所述转基因包括有农艺学意义的转基因。
12.权利要求5的DNA质粒，其中所述植物激素生物合成途径基因选自赤霉酸途径基因、细胞分裂素途径基因、植物生长素途径基因、乙烯途径基因和脱落酸途径基因。
13.权利要求5的DNA质粒，其中所述植物激素生物合成途径基因或其部分表达与内源植物细胞RNA互补的反义RNA，其中所述反义RNA被设计用于转录后基因抑制。
14.权利要求6的DNA质粒，其中所述植物激素降解基因选自赤霉酸降解基因、细胞分裂素降解基因、植物生长素降解基因、乙烯降解基因和脱落酸降解基因。
15.权利要求7的DNA质粒，其中所述植物激素生物合成途径底物转移基因选自赤霉酸途径底物转移基因、细胞分裂素途径底物转移基因、植物生长素途径底物转移基因、乙烯途径底物转移基因和脱落酸途径底物转移基团。
16.权利要求8的DNA质粒，其中所述植物激素信号转导基因选自赤霉酸途径信号转导基因、细胞分裂素途径信号转导基因、植物生长素途径信号转导基因、乙烯途径信号转导基因和脱落酸途径信号转导基因。
17.权利要求9的DNA质粒，其中所述代谢干扰基因编码选自以下的酶生物合成途径酶、从生物合成途径中转移底物的酶、降解或灭活生物合成途径底物的酶。
18.权利要求17的DNA质粒，其中所述酶选自蔗糖6-果糖基转移酶、转化酶和海藻糖合酶。
19.权利要求9的DNA质粒，其中所述代谢干扰基因表达与内源植物细胞RNA互补的反义RNA，其中所述反义RNA被设计用于转录后基因抑制。
20.一种增强选择不含有载体骨架DNA的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤a)用权利要求1的DNA质粒转化多个植物细胞；b)在正向选择化合物上选择所述植物细胞；c)将所选植物细胞再生为植物。
21.一种通过权利要求20的方法产生的植物。
22.一种减少植物细胞中转基因拷贝数的方法，所述方法包括以下步骤a)用权利要求1的DNA质粒转化多个植物细胞；b)在正向选择化合物上选择所述转化的植物细胞；c)将所选植物细胞再生为植物。
23.一种通过权利要求22的方法产生的转基因植物。
全文摘要
本发明将非致死负性选择标记基因整合到DNA质粒的载体骨架DNA中，用于转化植物细胞。这些转基因被设计为在含有DNA质粒载体骨架DNA的植物细胞中表达非致死基因产物。这些非致死负性选择标记基因的基因产物涉及植物激素生物合成途径、植物激素底物转移、植物激素降解、植物激素信号转导或代谢干扰。用这些DNA质粒转化植物细胞增加了商业化植物的产生。
文档编号A01H5/00GK1809639SQ200480015511
公开日2006年7月26日 申请日期2004年4月9日 优先权日2003年4月9日
发明者L·吉尔伯特森, E·克里格尔, W·张, X·叶 申请人:孟山都技术有限公司