专利名称：枯草芽孢杆菌抗菌肽的用途及制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌抗菌肽抑制黄曲霉生长的用途及制剂。
背景技术：
玉米、稻谷、棉子等在储存期由于本身的含水量高、储存环境问题容易发生霉变。霉菌会产生多种毒素，人或动物因食入霉菌毒素污染的粮食或饲料，就会引起肝中毒、癌症等，严重威胁人类的健康和生命，畜牧业发展也将受到影响。据知全世界每年有25％的粮食作物受到霉菌毒素的污染，直接损失可达数千亿美元。因此，霉菌毒素已成为粮食工业、饲料工业、畜牧业中不可忽视的问题。黄曲霉是一种能产黄曲霉毒素的霉菌。黄曲霉毒素毒性极强，被它污染的粮食等食品食入人体内主要损害肝脏，并有强烈的致癌作用。用霉变玉米棒饲料饲喂畜禽、黄曲霉会在动物体组织中积蓄，通过食物链带给人类，而霉变的花生会污染花生油及花生酱等制品。
枯草芽孢杆菌是一种能分泌对多种农作物有害病原真菌和细菌的具有抑制杀伤作用的抗菌肽的土壤微生物，同时它又是自然界广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境。代谢产物抗菌肽通常以多种结构类似物的形式共同存在于枯草芽孢杆菌的发酵液中，有环状结构和脂类侧链，具有热稳定性高，耐受蛋白酶水解的能力，而且微生物不易对其产生耐药性。
发明内容
本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌抗菌肽制剂及用途，使用枯草芽孢杆菌发酵液中的有效抗菌成分抗菌肽和乳酸混合制成混合制剂，能够抑制多种植物病原真菌和细菌生长，尤其是对黄曲霉有强烈的抑制作用；试验表明该制剂是一种较好的能应用于粮食储存的防霉制剂。
本发明的技术方案为
枯草芽孢杆菌抗菌肽的用途，其特征在于用于抑制黄曲霉等有害病菌。
所述的用途，其特征在于用于抑制玉米、稻谷、棉子或动物饲料上的黄曲霉等有害霉菌。
所述的用途，其特征在于抗菌肽是枯草芽孢杆菌发酵产物的粗提取物或精提物。
抑制黄曲霉的制剂，其特征在于是枯草芽孢杆菌抗菌肽与有机酸的混合物。
所述的有机酸为乳酸，抗菌肽与乳酸的重量配比为5~10∶1。
所述的抗菌肽采用枯草芽孢杆菌发酵产物的粗提取物或精提物，其中抗菌肽的含量＞100μg/mL。
从枯草芽孢杆菌发酵液中提纯抗菌肽，分离提纯工艺包括1、枯草芽孢杆菌发酵液的粗提液的制备是利用超过滤的装置对发酵液进行浓缩和纯化，截留分子量在1000D以上的物质，为抗菌肽的粗提物。
更确切的说是将枯草芽孢杆菌的发酵液经Millipore公司的切向流超滤系统超滤浓缩后(截留分子量为1000D)6000r/min离心取上清液得到。
2、DEAE-Sepharose FF柱层析将粗提液用A缓冲液(20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液)充分透析，8000r/min离心收集上清液，过A缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，用B缓冲液(含1.0mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液)与A缓冲液在线混合进行线性梯度洗脱，收集对黑曲霉、小麦赤霉和水稻纹枯病菌均有抑菌作用的活性峰，并将收集的活性洗脱液经Millipore公司的Stirred Cells 8050超滤杯浓缩(截留分子量为3000D)。
3、SOURCE 15 PHE柱层析将阴离子柱收集的活性组份上B缓冲液预平衡的SOURCE 15 PHE柱，B缓冲液淋洗至基线，再用A缓冲液进行淋洗，最后用蒸馏水洗脱得到活性峰，收集合并后浓缩冷冻干燥即得到抗菌肽的精提物。
所述的枯草芽孢杆菌株发酵液的制备方法，其特征是所述的混合制剂的用途，是用于粮食储存中黄曲霉病菌的抑制。
本发明的产生菌的发酵工艺稳定简单，对环境无污染。
本发明的抗菌肽抗菌活性、物质热稳定性好，对酸碱和蛋白酶有一定的耐受性，在生物防治领域有很好的应用前景。
本发明的抗菌肽混合制剂应用广泛，对粮食储存、饲料加工中的黄曲霉抑制效果明显，有良好的应用前景。
具体实施例方式
枯草芽孢杆菌株发酵液的制备。
是将本发明的高产菌枯草芽孢杆菌株(由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心受理保存，保藏入册编号为1107)进行发酵，发酵工艺包括对斜面保存的枯草芽孢杆菌的高产菌株斜面活化；种瓶培养；发酵罐发酵培养；发酵液高速离心除菌体并进行热处理。斜面培养基为PDA培养基，种子培养基鱼蛋白胨2％，甘油1％，K2HPO40.15％，MgSO40.15％，pH7.2，最佳种龄时间为12小时，再按接种量1∶10接种于发酵培养基；发酵培养基葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，K2HPO40.15％，MgSO40.15％，最适pH值6.7～7.5，最适发酵周期为40hr～48hr，最适温度28℃～30℃，发酵罐转速为333r/min，发酵罐转速为333r/min；发酵液高速离心及热处理离心转速为8000r/min，热处理温度为108℃，10min，得到发酵液。
枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯步骤如下1、枯草芽孢杆菌发酵液的粗提液的制备，是将枯草芽孢杆菌JA的发酵液经Millipore公司的切向流超滤系统超滤浓缩后(截留分子量为1000D)6000r/min离心取上清液得到抗菌肽的粗提物。
2、DEAE-Sepharose.FF柱层析将粗提液用A缓冲液(20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液)充分透析，8000r/min离心收集上清液，过A缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，用B缓冲液(含1.0mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液)与A缓冲液在线混合进行线性梯度洗脱，收集对黑曲霉、小麦赤霉和水稻纹枯病菌均有抑菌作用的活性峰，并将收集的活性洗脱液经Millipore公司的Stirred Cells 8050超滤杯浓缩(截留分子量为3000D)。
3、SOURCE 15 PHE柱层析将阴离子柱收集的活性组份上B缓冲液预平衡的SOURCE 15 PHE柱，B缓冲液淋洗至基线，再用A缓冲液进行淋洗，最后用蒸馏水洗脱得到活性峰，收集合并后浓缩得到抗菌肽的精提物。
抑制黄曲霉的制剂，是将精提物或粗提物(抗菌肽溶液)与乳酸以10∶1体积比混合，制成混合溶液。
制剂对黄曲霉有强烈的抑制作用，另外对其他多种病原菌有明显的抑制作用，如小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜菌核、灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、番茄青枯病菌、烟草青枯病菌等。
权利要求
1.枯草芽孢杆菌抗菌肽的用途，其特征在于用于抑制黄曲霉。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于用于抑制玉米、稻谷、棉子或动物饲料上的黄曲霉。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于抗菌肽是枯草芽孢杆菌发酵产物的粗提取物或精提物。
4.抑制黄曲霉的制剂，其特征在于是枯草芽孢杆菌抗菌肽与有机酸的混合物。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于所述的有机酸为乳酸，抗菌肽与乳酸的重量配比为5~10∶1。
6.根据权利要求4或5所述的制剂，其特征在于所述的抗菌肽采用枯草芽孢杆菌发酵产物的粗提取物或精提物，其中抗菌肽的含量＞100μg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的用途及制剂，枯草芽孢杆菌的抗菌肽能有效抑制黄曲霉等有害病菌生长，抗菌肽溶液与有机酸如乳酸酸混合，抑制有害病菌生长时有协同作用。抗菌肽具有环状结构，稳定性好，在粮食储藏安全和饲料加工方面有很好的应用前景。
文档编号A01N63/02GK1695458SQ200510038629
公开日2005年11月16日 申请日期2005年3月28日 优先权日2005年3月28日
发明者刘静, 王军, 王萍, 姚建铭, 余增亮 申请人:中国科学院等离子体物理研究所