专利名称：克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法
技术领域：
本发明涉及一种豆科牧草的高频体胚再生培养方法，更具体的讲涉及一种 克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，属于植物学领域。
背景技术：
、三叶草(Clover)是一种世界性分布与栽培的优良豆科牧草，是温带地区 人工草地建植的首选草种，也是各类观赏性草坪和绿地的主要组分，它在城镇的 绿化、美化、果园林木的固氮培肥地力、道路堤坝的水土保持等方面均起着不 可替代的重要作用。鉴于三叶草的重要经济价值，许多发达国家纷纷利用生物技 术方法来研究改良三叶草,解决三叶草生产中存在的问题。
三叶草是个异质杂合体，自交不亲和，目前世界各国应用的品种80%以上为 综合品种，品种内基因型差异很大，三叶草一些重要的育种目标很难通过常规 育种方法达到，如三叶草抗旱耐盐、抗病抗虫、提高种子及草产量、固氮能力 等都达不到理想的效果，因此近年来，人们试图通过现代基因工程技术，即通过 转基因获得抗性植株来培育三叶草新品种，提高三叶草对各种生态环境的适应 性，但作为这种技术能成功应用的前提条件是三叶草在其组织培养过程中具有 高频体胚再生能力，这一直是一个难以克服的问题。
三叶草属植物组织培养再生技术的研究始于20世纪70年代，已有的一些 报道表明，大部分三叶草的组织培养再生率都极低，只有1%甚至更小，且再生 过程较长， 一般需4 6个月左右，再生性和再生频率易受基因型影响，这已经 成为限制不同基因型，尤其是优良品种转基因的瓶颈。Nancy和Jerzy 1989年 通过红三叶叶柄愈伤组织的诱导，获得了 70 81%的植株再生率；Quesenberry 和Smithl993年报道了红三叶再生技术的研究，大约有4%的植株再生率比较高， 若在这4%再生率高的植株中再进一步筛选和再生，植株的再生力会提高到70%。 三叶草再生体系的建立多是通过器官发生途径，很少有从体细胞胚胎发生途径 建立的报道，更未见有适宜于三叶草基因转化的高频率体细胞胚再生组织培养 技术体系的报道。由于体细胞胚是克隆起源的，体胚发生途径更能保证转基因植物的遗传一致性(不形成嵌合体)，使外源基因可通过花粉和配子传递给后代。 所以，体胚再生技术是植物组织培养中最有吸引力的方法，被广泛应用于植物 遗传转化、体细胞变异系的筛选等。
先前的研究者大多只选择了 1个种的1 3个品种为材料，由于研究的品种 数量少，不具代表性，这些研究均难以解决三叶草不同品种及基因型障碍的问 题。因此，建立三叶草不受品种及基因型限制的高频体胚再生培养体系是获得 各类品种三叶草转基因成功的重要前提。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可有效提高体 细胞胚发生频率和再生植株频率的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再 生培养方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的
一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括以下步骤
(1) 选材三叶草成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后，在幼苗生长驯化 培养基上培养无菌苗，选取萌发后的无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片 三种外植体；
(2) 胚发生愈伤组织诱导将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱 导培养基上，在白天室温27±2°C、夜晚室温20土rC的条件下暗培养28 30 天；
(3) 胚继代形成培养将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种 于胚继代形成培养基上，首先进行5天的4 6t低温人工气候箱暗培养，然后 在白天室温27 ±2。C 、夜晚室温20± 1°C的条件下暗培养30-35天；
(4) 胚成熟萌发成苗培养将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚 成熟萌发成苗培养基上，在白天室温27土2'C、夜晚20土rC、光照强度为1000 15001x的条件下进行14h/d的光培养20 25天，形成幼苗；
(5) 壮苗生根培养将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生 长驯化培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；
(6) 生根的再生植株移栽、成活；
6所述的幼苗生长驯化培养基为V2改良MS + 20g /L白糖+ 0.7%琼脂;
所述的胚发生愈伤组织诱导培养基为改良SH + 8 12mg/L 2, 4-D + 0. 2 0. 5mg/L 6-BA + 30g /L蔗糖+ 0.3% phytagel;
所述的胚继代形成培养基为改良SH + 2 8mg/L 2， 4-D + 0. 2 0. 5mg /L 6-BA + 50 g /L蔗糖+ 0. 35% phytagel;
所述的胚成熟萌发成苗培养基为'改良MS + 30 g /L白糖+ 0.7%琼脂。
上述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
其中常量营养元素的组分和其对应的浓度如下
硫酸铵
硝酸钾
二水氯化钙
七水硫酸镁
无水磷酸二氢钾
乙二胺四乙酸铁钠盐
463 mg/L; 2830 mg/L; 166mg/U 185 mg/L; 400 mg/L; L4 mg/L。
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下:
一水硫酸锰 硫酸锌
10 mg/L; 1.0 mg/L;
硼酸 5. 0 mg/L;
碘化钾 1. 0 mg/L;
钼酸钠 0. 1 mg/L;
硫酸铜 0. 2 mg/L;
氯化钴 0.1 mg/L。
有机试剂的组分和其对应的浓度如下 盐酸硫胺素'5.0 mg/L; 烟酸 5. 0 mg/L;
盐酸吡哆醇 5. 0 mg/L。
上述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂, 其中常量营养元素的组分和其对应的浓度如下硫酸铵
硝酸钾
七水硫酸镁
无水磷酸二氢钾
二水氯化妈
乙二胺四乙酸二钠
七水硫酸亚铁
1650 mg/L; 簡mg/L; 370 mg/L; 170 mg/L; 440 mg/L; 37. 3 mg/L; 27. 8 mg/L。
钼酸钠 硫酸铜 氯化钴
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下
四水硫酸锰 22. 3 mg/L;
8.6 mg/L; 6.2 mg/L; 0. 83 mg/L; 0. 25 mg/L; 0.025 mg/L; 0. 025 mg/L。 有机试剂的组分和其对应的浓度如下 盐酸硫胺素 1. 0 mg/L;
烟酸 1. 0 mg/L;
盐酸吡眵醇 1. 0 mg/L;
肌醇 100 mg/L。
本发明的有益效果是本发明通过选择适宜外植体、改良基本培养基及成分、 调整培养条件等配套措施，有效地克服了三叶草高频体胚再生培养中不同品种 及基因型障碍问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率。建立三叶 草高频体胚再生技术体系是保证三叶草体细胞诱导变异、高效稳定遗传转化、 获得大量可供筛选的目标植株的前提条件，通过优化简化三叶草体细胞胚胎发 生和植株再生培养基和技术体系，能有效的发挥转基因等生物技术在三叶草现 代育种中的作用，提高育种效率。
8图1为三叶草外植体在胚发生愈伤组织诱导培养基上培养的胚型细胞； 图2为杂三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞胚； 图3为红三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞胚； 图4为白三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞胚； 图5为体细胞胚在胚成熟萌发成苗培养基上发育成的鱼雷胚； 图6为体细胞胚在胚成熟萌发成苗培养基上发育成的子叶胚； 图7为鱼雷胚继代培养萌发成的分化小苗； 图8为子叶胚继代培养萌发成的分化小苗； 图9为鱼雷胚的分化小苗发育成的幼苗； 图10为子叶胚的分化小苗发育成的幼苗。
具体实施例方式
下面将结合附图和具体实施例，详细说明本发明的具体实施方式
-图1为三叶草外植体在胚发生愈伤组织诱导培养基上培养的胚型细胞；图2 为杂三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞胚；图3为红三叶在胚继代形成 培养基上发育的体细胞胚；图4为白三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞 胚；图5为体细胞胚在胚成熟萌发成苗培养基上发育成的鱼雷胚；图6为体细 胞胚在胚成熟萌发成苗培养基上发育成的子叶胚；图7为鱼雷胚继代培养萌发 成的分化小苗；图8为子叶胚继代培养萌发成的分化小苗；图9为鱼雷胚的分 化小苗发育成的幼苗；图10为子叶胚的分化小苗发育成的幼苗。 如图1-图IO所示
一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括以下步骤 (1)选材选择11个品种，g卩白三叶(包括铺地、考拉、拉丁诺、飞 毯、百霸、海发、爱丽思、胡依阿、瑞文德9个品种)、红三叶(瑞得)和杂 三叶；
用流水冲洗上述种子约1 2 h，在无菌室用75%酒精消毒20 30秒，无菌 水洗3 5次，0. 1%升汞消毒6 8分钟，用无菌水冲洗5次，灭菌滤纸吸干水
分，接种于幼苗生长驯化培养基上；
取上述萌发5-6天的无菌苗上、下胚轴剪成3 4iM长的小段，再生叶片在距叶基部2/3处垂直主脉切割，带叶柄部分，再垂直主脉横切2刀，造成伤口， 茎包括茎柄，这些材料作为外植体(共360个)，接种于胚发生愈伤组织诱导培 养基上；
(2) 胚发生愈伤组织诱导将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱 导培养基上，在白天室温27±2°C、夜晚室温20土rC的条件下暗培养28 30 天；
(3) 胚继代形成培养将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种 于胚继代形成培养基上，首先进行5天的4 6'C低温人工气候箱暗培养，然后 在白天室温27 ± 2°C 、夜晚室温20 ± 1°C的条件下暗培养30-35天；
(4) 胚成熟萌发成苗培养将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚 成熟萌发成苗培养基上，在白天室温27±2°C 、夜晚20± 1°C 、光照强度为1000 15001x的条件下进行14h/d的光培养20 25天，形成幼苗；
(5) 壮苗生根培养将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生 长驯化培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；
(6) 将生根的再生植株移栽到温室小花盆中，花盆中的土体的组分及重量 百分比泥炭土园土 = 7 : 3 ，移栽后每天浇水1 2次，待苗成活后逐渐 减少浇水次数；
上述的幼苗生长驯化培养基为1/2改良MS + 20g /L白糖+ 0.7%琼脂； 上述的胚发生愈伤组织诱导培养基为改良SH + 8 12mg/L 2， 4-D + 0. 2
0. 5mg/L 6-BA + 30g /L蔗糖+ 0.3% phytagel;
上述的胚继代形成培养基为改良SH + 2 8mg/L 2， 4-D + 0. 2 0. 5mg /L
6-BA + 50 g /L蔗糖+ 0.35% phytagel;
上述的胚成熟萌发成苗培养基为改良MS + 30 g /L白糖+ 0.7%琼脂。 上述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
其中常量营养元素的组分和其对应的浓度如下-硫酸铵 463 mg/L;
硝酸钾 2830 mg/L;
二水氯化钙 166mg/L;
10七水硫酸镁
无水磷酸二氢钾
乙二胺四乙酸铁钠盐
185 mg/L; 400 mg/L; 1. 4 mg/Lc
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下:
一水硫酸锰 硫酸锌
10 mg/L; 1. 0 mg/L; 5.0 mg/L; 1. 0 mg/L; 钼酸钠 0.1 mg/L;
硫酸铜 0. 2 mg/L;
氯化钴 0. 1 mg/L。
有机试剂的组分和其对应的浓度如下 盐酸硫胺素 5. 0 mg/L;
烟酸 5. 0 mg/L;
盐酸吡哆醇 5. 0 mg/L。
上述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。 其中常量营养元素的组分和其对应的浓度如下-
硫酸铵
硝酸钾
七水硫酸镁
无水磷酸二氢钾
二水氯化韩
乙二胺四乙酸二钠
七水硫酸亚铁
1650 mg/L; 画mg/L; 370 mg/L; 170 mg/L; 440 mg/L; 37. 3 mg/L; 27, 8 mg/L。
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下: 四水硫酸锰 22. 3 mg/L;
8.6 mg/L; 6.2 mg/L;碘化钾 0. 83 mg/L;
钼酸钠 0. 25 mg/L;
硫酸铜 0. 025 mg/L;
氯化钴 0. 025 mg/L。
有机试剂的组分和其对应的浓度如下 盐酸硫胺素 1. 0 mg/L;
烟酸 1. 0 mg/L;
盐酸吡眵醇 1. 0 mg/L;
肌醇 100 mg/L。
在具体的实施例中，植物生长调节剂的组合分别为-实施例1
A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH + 8mg/L 2, 4-D + 0. 2mg/L 6-BA+30g /L蔗糖+ 0.3%phytagel) + B.胚继代形成培养基(改良SH + 8mg/L 2， 4-D + 0. 2mg/L 6-BA+50g/L蔗糖+ 0. 35%phytagel) + C.胚成熟萌发成苗培养基(改 良MS+30g /L白糖+0, 7%琼脂)+ D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g /L 白糖+0.7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
实施例2
A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH + 8mg/L 2， 4-D + 0. 5mg/L 6-BA+30g /L蔗糖+ 0.3%phytagel) + B.胚继代形成培养基(改良SH + 8mg/L 2， 4-D + 0. 5mg/L 6-BA+50g/L蔗糖+ 0. 35%phytagel) + C.胚成熟萌发成苗培养基(改 良MS+30g /L白糖+0.7%琼脂)+ D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g /L 白糖+0.7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
实施例3
A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH + 10mg/L 2， 4-D + 0. 2mg/L 6-BA+30g /L蔗糖+ 0.3%phytagel) + B.胚继代形成培养基(改良SH + 5mg/L 2， 4-D + 0. 2mg/L 6-BA+50g/L蔗糖+ 0. 35%phytagel) + C.胚成熟萌发成苗培养基(改 良MS+30g /L白糖+0.7%琼脂)+ D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g /L 白糖+0.7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
实施例4
12A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH + 10mg/L 2， 4-D + 0. 5mg/L 6-BA+30g /L蔗糖+ O局hytagel) + B.胚继代形成培养基(改良SH + 5mg/L 2， 4-D + 0. 5mg/L 6-BA+50g/L蔗糖+ 0. 35%phytagel) + C.胚成熟萌发成苗培养基(改 良MS+30g /L白糖+0. 7%琼脂)+ D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g /L 白糖+0.7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
实施例5
A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH + 12mg/L 2， 4-D + 0. 2mg/L 6_BA+30g /L蔗糖+ 0.3%phytagel) + B.胚继代形成培养基(改良SH + 2mg/L 2， 4-D + 0. 2mg/L 6-BA+50g/L蔗糖+ 0. 35%phytagel) + C.胚成熟萌发成苗培养基(改 良MS+30g /L白糖+0. 7%琼脂)+ D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g /L 白糖+0. 7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5. 8左右。
实施例6
A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH + 12mg/L 2， 4-D + 0. 5mg/L 6-BA+30g /L蔗糖+ 0.3%phytagel) + B.胚继代形成培养基(改良SH + 2mg/L 2， 4-D + 0. 5mg/L 6-BA+50g/L蔗糖+ 0. 35%phytagel) + C.胚成熟萌发成苗培养基(改 良MS+30g /L白糖+0.7%琼脂)+ D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g /L 白糖+0.7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
将上述360个外植体分别在6个实施例所述的植物生长调节剂组合上进行 胚发生愈伤组织诱导、胚继代形成培养、壮苗生根培养、再生植株移栽。
如图1所示在上述的胚发生愈伤组织诱导步骤，通过显微观察看到外植 体的愈伤组织表面形成一些突起，突起细胞质浓，与周围细胞分开，有明显界限， 说明这些分裂迅速的细胞是胚性细胞，且在上述6种组合的胚发生愈伤组织诱 导基的实施例中都能获得胚发生愈伤组织，但胚愈伤组织最高诱导率均是在含 有合适浓度的植物生长素或合适比率植物生长素/细胞激动素的培养基上发生， 过高的植物生长素或不合适的植物生长素/细胞激动素比率均会降低外植体胚 愈伤组织发生率，胚发生愈伤组织最有效的组合是2，4-D 10mg/L和6-BA 0.2mg/L，此组合易于大多数基因型诱导产生更多的胚发生愈伤组织，上胚轴和 下胚轴胚愈伤组织发生率平均提高21%以上(见表l)，可见只有植物生长素/细胞激动素配比合适，才能促进胚愈伤组织产生和形成。
如图2至图4所示在上述的胚继代形成培养步骤，本实验通过设置低温-常温处理发现，在胚继代形成培养前期经过一定时间的低温处理有利于胚继代
成熟，胚继代形成培养基的特点为降低2， 4-D浓度，提高蔗糖和phytagel浓度。 6个实施例结果表明适当降低2，4-D浓度，有利于体细胞胚形成，降低次生体 细胞胚产生。6个实施例中，最有效的组合是2，4-D 5mg/L和6-BA 0. 2mg/L， 能较大幅度提高体细胞胚成熟率，使上、下胚轴胚状体分化率平均提高了 23% 以上(见表2)，胚愈伤组织也不再增大变浅或出1^褐化，杂三叶胚愈伤组织表 面出现较软浅黄色愈伤，红三叶胚愈伤组织内外镶嵌着许多绿色小硬核，这些 绿色小硬核以后发育成单个小植株，白三叶胚愈伤组织表面发育成较硬的团状 颗粒，即球形胚，这些绿色小硬核或团状颗粒就是正在发育的体细胞胚，当长 得比较大时可将其分割培养进一步发育成单个小植株。
如图5-图IO所示在胚成熟萌发成苗培养步骤，将上述体细胞胚经过50g /L蔗糖和0.35% phytagel的培养基脱水处理后，会促进80%的球形胚发育成 鱼雷胚和子叶胚，转接到改良MS+30g /L白糖+0. 7%琼脂培养基上培养，会观 察到大量分化小苗，每个分化小苗是由体细胞胚萌发而成，体细胞胚的萌发还 包括胚根、胚轴伸长，子叶和真叶形成，最后发育为自由生长的幼苗。
在体细胞胚发育过程中，又以球形胚为最高，子叶分化期胚、成熟胚、香 蕉形胚依次降低，而以梨形胚为最低。
表l外植体在实施例5中的胚愈伤组织发生率比较_
胚愈伤组织发生率％ SW1 IMS ￥11 再生叶~~
445522224 8
999999999 9
487867368 2
556745443 7
6786386666
5577454547
oooooooooo
8888888888
地拉g楼霸发德認5得
铺考釘飞百海i纖歡瑞杂三叶18084.675.698
表2外植体在改良MS上胚状体分化率比较
胚状体分化率％j
口口々T接种数上胚轴下胚轴再生叶 」
铺地18058.251.494 .
考拉18054.452.694
拉丁诺18070.666.295
飞毯18074.472.295
百霸18046. 142.692
海发18052.850.492
爱丽思18046.241.092
胡依阿18052.646.692
瑞文德18041.635.894
瑞得18076.471.298
杂三叶1801 82.474.498
比较11个品种不同基因型不同部位胚愈伤组织发生率和胚状体分化率。结果见表3和表4:
表3 三三叶草不同部位胚愈伤组织发生率比较
胚愈伤组织发生率％i
口口w接种数上胚轴下胚轴再生叶 ，.
铺地36039.633,4犯 J
考拉36036.734,893 .-
拉丁诺36052.846. 794 :
飞毯36056.644.893
百霸36026.324.691
海发36033.832.791 —
爱丽思36027.623.391
胡依阿36033.628.691
瑞文德36022.620.893
瑞得36048.646.2恥 —f
杂三叶36058.652.696 ;
表4三叶草不同部位胚状体分化率比较
o壬4胚状体分化率％
口口不T接种数上胚轴下胚轴再生叶
铺地36035.830.692 —
考拉36030.328.893
拉丁诺36046.643. 594从表1和表2中看出杂三叶上、下胚轴胚愈伤组织发生率和胚状体分化率均最高，飞毯和拉丁诺次之，红三叶瑞得比它们稍差，11个品种上胚轴胚愈伤组织发生率依次为杂三叶〉飞毯>拉丁诺>瑞得>铺地〉考拉>海发>胡依阿>爱丽思>百霸>瑞文德；下胚轴胚愈伤组织发生率依次为杂三叶>拉丁诺>瑞得>飞毯>考拉>铺地>海发〉胡依阿〉百霸>爱丽思>瑞文德；上胚轴胚状体分化率依次为杂三叶>飞毯>拉丁诺>瑞得>铺地>考拉>胡依阿>海发〉爱丽思>百霸〉瑞文德；下胚轴胚状体分化率依次为杂三叶>拉丁诺>飞毯〉瑞得>铺地>考拉>海发〉胡依阿〉百霸>爱丽思〉瑞文德；再生叶不同品种胚愈伤组织发生率和胚状体分化率均很高，均在90%以上，不同品种间差异很小。上述结果说明上、下胚轴不同品种及基因型由于遗传背景的不同，对培养条件反应有一定的差异，但在相对一致的培养条件下均能得到胚愈伤组织和胚状体分化苗。
在三种三叶草11个品种各360粒种子的试验中，上胚轴胚愈伤组织发生率平均达到39.7%;下胚轴平均达到35.3%;再生叶片胚愈伤组织发生率平均达到92. 8%;上胚轴胚状体分化率平均达到34. 9%,下胚轴平均达到31. 7%，再生叶片胚状体分化率平均达到92. 8%。所有参试的品种均能获得再生植株。
通过选择适宜外植体、改良基本培养基及成分、调整培养条件等配套措施，有效地克服了三叶草高频体胚再生培养中不同品种及基因型障碍问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率。
以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
3
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飞百海爱胡瑞瑞杂
1权利要求
1、一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括以下步骤(1)选材三叶草成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后，在幼苗生长驯化培养基上培养无菌苗，选取萌发后的无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片三种外植体；(2)胚发生愈伤组织诱导将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱导培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚室温20±1℃的条件下暗培养28～30天；(3)胚继代形成培养将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种于胚继代形成培养基上，首先进行5天的4～6℃低温人工气候箱暗培养，然后在白天室温27±2℃、夜晚室温20±1℃的条件下暗培养30-35天；(4)胚成熟萌发成苗培养将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌发成苗培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚20±1℃、光照强度为1000～1500lx的条件下进行14h/d的光培养20～25天，形成幼苗；(5)壮苗生根培养将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生长驯化培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；(6)生根的再生植株移栽、成活；所述的幼苗生长驯化培养基为1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂；所述的胚发生愈伤组织诱导培养基为改良SH+8～12mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel；所述的胚继代形成培养基为改良SH+2～8mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L6-BA+50g/L蔗糖+0.35％phytagel；所述的胚成熟萌发成苗培养基为改良MS+30g/L白糖+0.7％琼脂。
2、 根据权利要求1所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
3、 根据权利要求2所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，其特硫酸铵463 mg/L;硝酸钾2830 mg/L;二水氯化钙166mg/U七水硫酸镁185 mg/L;无水磷酸二氢钾400 mg/L;乙二胺四乙酸铁钠盐1. 4 mg/L。
4、根据权利要求2所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下
5、根据权利要求2所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下-盐酸硫胺素 5. 0 mg/L;盐酸吡哆醇 5. 0 mg/L。
6、 根据权利要求1所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
7、 根据权利要求6所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下硫酸铵 1650 mg/L;硝酸钾 1900 mg/L;七水硫酸镁 370 mg/L;一水硫酸锰硫酸锌硼酸 钼酸钠硫酸铜氯化钴5. 0 mg/L;无水磷酸二氢钾 170 mg/L;二水氯化钙 440 mg/L;乙二胺四乙酸二钠 37. 3 mg/L;七水硫酸亚铁 27.8mg/L。
8、 根据权利要求2所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下四水硫酸锰 22. 3 mg/L;硫酸锌 8.6 mg/L;硼酸 6.2 mg/L;碘化钾 0. 83 mg/L;钼酸钠 0. 25 mg/L;硫酸铜 0. 025 mg/L;氯化钴 0. 025 mg/L。
9、 根据权利要求2所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下盐酸硫胺素 1. 0 mg/L;烟酸 1. 0 mg/L;盐酸吡眵醇 1. 0 mg/L;肌醇 100 mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括(1)选材三叶草成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后选取无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片三种外植体；(2)将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱导培养基上培养；(3)将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种于胚继代形成培养基上培养；(4)将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌发成苗培养基上培养形成幼苗；(5)壮苗生根培养；(6)再生植株移栽、成活。本发明可有效地克服三叶草高频体胚再生培养中不同品种及基因型障碍问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率，提高育种效率。
文档编号A01H4/00GK101663997SQ20091003497
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月16日 优先权日2009年9月16日
发明者周道宏, 师尚礼, 梁慧敏, 汤容娣, 王小春, 王永平 申请人:江苏农林职业技术学院