专利名称：克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种豆科牧草的高频体胚再生培养方法，更具体的讲涉及一种克服三 叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，属于植物学领域。
背景技术：
三叶草(Clover)是一种世界性分布与栽培的优良豆科牧草，是温带地区人工草 地建植的首选草种，也是各类观赏性草坪和绿地的主要组分，它在城镇的绿化、美化、果园 林木的固氮培肥地力、道路提坝的水土保持等方面均起着不可替代的重要作用。鉴于三叶 草的重要经济价值，许多发达国家纷纷利用生物技术方法来研究改良三叶草，解决三叶草 生产中存在的问题。三叶草是个异质杂合体，自交不亲和，目前世界各国应用的品种80%以上为综合 品种，品种内基因型差异很大，三叶草一些重要的育种目标很难通过常规育种方法达到，如 三叶草抗旱耐盐、抗病抗虫、提高种子及草产量、固氮能力等都达不到理想的效果，因此近 年来，人们试图通过现代基因工程技术，即通过转基因获得抗性植株来培育三叶草新品种， 提高三叶草对各种生态环境的适应性，但作为这种技术能成功应用的前提条件是三叶草在 其组织培养过程中具有高频体胚再生能力，这一直是一个难以克服的问题。三叶草属植物组织培养再生技术的研究始于20世纪70年代，已有的一些报道表 明，大部分三叶草的组织培养再生率都极低，只有1 %甚至更小，且再生过程较长，一般需 4 6个月左右，再生性和再生频率易受基因型影响，这已经成为限制不同基因型，尤其是 优良品种转基因的瓶颈。Nancy和Jerzy 1989年通过红三叶叶柄愈伤组织的诱导，获得了 70 81%的植株再生率；Quesenberry和Smithl993年报道了红三叶再生技术的研究，大 约有4%的植株再生率比较高，若在这4%再生率高的植株中再进一步筛选和再生，植株的 再生力会提高到70%。三叶草再生体系的建立多是通过器官发生途径，很少有从体细胞胚 胎发生途径建立的报道，更未见有适宜于三叶草基因转化的高频率体细胞胚再生组织培养 技术体系的报道。由于体细胞胚是克隆起源的，体胚发生途径更能保证转基因植物的遗传 一致性(不形成嵌合体)，使外源基因可通过花粉和配子传递给后代。所以，体胚再生技术 是植物组织培养中最有吸引力的方法，被广泛应用于植物遗传转化、体细胞变异系的筛选寸。先前的研究者大多只选择了 1个种的1 3个品种为材料，由于研究的品种数量 少，不具代表性，这些研究均难以解决三叶草不同品种及基因型障碍的问题。因此，建立三 叶草不受品种及基因型限制的高频体胚再生培养体系是获得各类品种三叶草转基因成功 的重要前提。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可有效提高体细胞胚发生 频率和再生植株频率的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括以下步骤(1)选材三叶草成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后，在幼苗生长驯化培养基上 培养无菌苗，选取萌发后的无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片三种外植体；(2)胚发生愈伤组织诱导将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱导培养 基上，在白天室温27 士 2 °C、夜晚室温20 士 1 °C的条件下暗培养28 30天；(3)胚继代形成培养将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种于胚 继代形成培养基上，首先进行5天的4 6°C低温人工气候箱暗培养，然后在白天室温 27 士 2°C、夜晚室温20 士 1 °C的条件下暗培养30-35天；(4)胚成熟萌发成苗培养将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌 发成苗培养基上，在白天室温27士2°C、夜晚20士 1°C、光照强度为1000 15001x的条件下 进行14h/d的光培养20 25天，形成幼苗；(5)壮苗生根培养将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生长驯化 培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；(6)生根的再生植株移栽、成活；所述的幼苗生长驯化培养基为1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%琼脂；所述的胚发生愈伤组织诱导培养基为改良SH+8 12mg/L 2,4-D+O. 2 0. 5mg/ L 6-BA+30g/L 蔗糖+0. 3% phytagel ；所述的胚继代形成培养基为改良SH+2 8mg/L 2,4-D+O. 2 0. 5mg/ L6-BA+50g/L 蔗糖 +0. 35% phytagel ；所述的胚成熟萌发成苗培养基为改良MS+30g/L白糖+0. 7%琼脂。上述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。其中常量营养元素的组分和其对应的浓度如下硫酸铵463mg/L;硝酸钾2830mg/L ；二水氯化钙166mg/L七水硫酸镁185mg/L无水磷酸二氢钾400mg/L乙二胺四乙酸铁钠盐1.4mg/L。微量营养元素的组分和其对应的浓度如下一水硫酸锰10mg/L ；硫酸锌1. Omg/L硼酸5. Omg/L碘化钾1. Omg/L钼酸钠0. lmg/L硫酸铜0. 2mg/L氯化钴0. lmg/L。有机试剂的组分和其对应的浓度如下盐酸硫胺素5. Omg/L ；
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烟酸5. Omg/L ；盐酸吡哆醇5. Omg/L。上述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。其中常量营养元素的组分和其对应的浓度如下硫酸铵1650mg/L;硝酸钾1900mg/L ；七水硫酸镁370mg/L ；无水磷酸二氢钾170mg/L ；二水氯化钙440mg/L ；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L;七水硫酸亚铁27. 8mg/L。微量营养元素的组分和其对应的浓度如下四水硫酸锰22. 3mg/L ；硫酸锌8. 6mg/L ；硼酸6.2mg/L;碘化钾0. 83mg/L ；钼酸钠0. 25mg/L ；硫酸铜0. 025mg/L ；氯化钴0. 025mg/L。有机试剂的组分和其对应的浓度如下盐酸硫胺素1. Omg/L ；烟酸1. Omg/L ；盐酸吡哆醇1. Omg/L ；肌醇100mg/L。本发明的有益效果是本发明通过选择适宜外植体、改良基本培养基及成分、调整 培养条件等配套措施，有效地克服了三叶草高频体胚再生培养中不同品种及基因型障碍问 题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率。建立三叶草高频体胚再生技术体系是 保证三叶草体细胞诱导变异、高效稳定遗传转化、获得大量可供筛选的目标植株的前提条 件，通过优化简化三叶草体细胞胚胎发生和植株再生培养基和技术体系，能有效的发挥转 基因等生物技术在三叶草现代育种中的作用，提高育种效率。
图1为三叶草外植体在胚发生愈伤组织诱导培养基上培养的胚型细胞；图2为杂三叶在 胚继代形成培养基上发育的体细胞胚；图3为红三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞胚；图4为白三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞胚；图5为体细胞胚在胚成熟萌发成苗培养基上发育成的鱼雷胚；图6为体细胞胚在胚成熟萌发成苗培养基上发育成的子叶胚；图7为鱼雷胚继代培养萌发成的分化小苗；
图8为子叶胚继代培养萌发成的分化小苗；图9为鱼雷胚的分化小苗发育成的幼苗；图10为子叶胚的分化小苗发育成的幼苗。
具体实施例方式下面将结合附图和具体实施例，详细说明本发明的
具体实施例方式图1为三叶草外植体在胚发生愈伤组织诱导培养基上培养的胚型细胞；图2为杂 三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞胚；图3为红三叶在胚继代形成培养基上发育的 体细胞胚；图4为白三叶在胚继代形成培养基上发育的体细胞胚；图5为体细胞胚在胚成 熟萌发成苗培养基上发育成的鱼雷胚；图6为体细胞胚在胚成熟萌发成苗培养基上发育成 的子叶胚；图7为鱼雷胚继代培养萌发成的分化小苗；图8为子叶胚继代培养萌发成的分 化小苗；图9为鱼雷胚的分化小苗发育成的幼苗；图10为子叶胚的分化小苗发育成的幼田ο如图1-图10所示—种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括以下步骤(1)选材选择11个品种，即白三叶(包括铺地、考拉、拉丁诺、飞毯、百霸、海发、 爱丽思、胡依阿、瑞文德9个品种)、红三叶(瑞得)和杂三叶；用流水冲洗上述种子约1 2h，在无菌室用75%酒精消毒20 30秒，无菌水洗 3 5次，0. 1 %升汞消毒6 8分钟，用无菌水冲洗5次，灭菌滤纸吸干水分，接种于幼苗生 长驯化培养基上；取上述萌发5-6天的无菌苗上、下胚轴剪成3 4mm长的小段，再生叶片在距叶基 部2/3处垂直主脉切割，带叶柄部分，再垂直主脉横切2刀，造成伤口，茎包括茎柄，这些材 料作为外植体(共360个)，接种于胚发生愈伤组织诱导培养基上；(2)胚发生愈伤组织诱导将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱导培养 基上，在白天室温27 士 2 °C、夜晚室温20 士 1 °C的条件下暗培养28 30天；(3)胚继代形成培养将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种于胚 继代形成培养基上，首先进行5天的4 6°C低温人工气候箱暗培养，然后在白天室温 27 士 2°C、夜晚室温20 士 1 °C的条件下暗培养30-35天；(4)胚成熟萌发成苗培养将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌 发成苗培养基上，在白天室温27士2°C、夜晚20士 1°C、光照强度为1000 15001x的条件下 进行14h/d的光培养20 25天，形成幼苗；(5)壮苗生根培养将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生长驯化 培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；(6)将生根的再生植株移栽到温室小花盆中，花盆中的土体的组分及重量百分比 泥炭土 园土 = 7 3，移栽后每天浇水1 2次，待苗成活后逐渐减少浇水次数；上述的幼苗生长驯化培养基为=IA改良MS+20g/L白糖+0. 7%琼脂；上述的胚发生愈伤组织诱导培养基为改良SH+8 12mg/L 2，4-D+0. 2 0. 5mg/ L 6-BA+30g/L 蔗糖 +0. 3% phytagel ；上述的胚继代形成培养基为改良SH+2 8mg/L 2，4-D+0. 2 0. 5mg/L6-BA+50g/L 蔗糖 +0. 35% phytagel ；
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上述的胚成熟萌发成苗培养基为改良MS+30g/L白糖+0. 7%琼脂, 上述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。 其中常量营养元素的组分和其对应的浓度如下
硫酸铵 硝酸钾 二水氯化钙 七水硫酸镁 无水磷酸二氢钾 乙二胺四乙酸铁钠盐
463mg/L ； 2830mg/L ； 166mg/L 185mg/L 400mg/L 1. 4mg/L。
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下 一水硫酸锰10mg/L ；
硫酸锌1. Omg/L
硼酸5. Omg/L
碘化钾1. Omg/L
钼酸钠0. lmg/L
硫酸铜0. 2mg/L
氯化钴0. lmg/L。
有机试剂的组分和其对应的浓度如下 盐酸硫胺素5. Omg/L ；
烟酸5. 0mg/L ；
盐酸吡哆醇5. 0mg/L。
上述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。 其中常量营养元素的组分和其对应的浓度如下
硫酸铵 硝酸钾 七水硫酸镁 无水磷酸二氢钾 二水氯化钙 乙二胺四乙酸二钠 七水硫酸亚铁
1650mg/L ； 1900mg/L ； 370mg/L 170mg/L 440mg/L 37. 3mg/L ； 27. 8mg/L。
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下
四水硫酸锰
硫酸锌
硼酸
碘化钾
钼酸钠
硫酸铜
氯化钴
22. 3mg/L ； 8. 6mg/L ； 6. 2mg/L ； 0. 83mg/L ； 0. 25mg/L ； 0. 025mg/L ； 0. 025mg/Lo
有机试剂的组分和其对应的浓度如下盐酸硫胺素l.Omg/L;烟酸l.Omg/L; 盐酸吡哆醇l.Omg/L;肌醇100mg/L。在具体的实施例中，植物生长调节剂的组合分别为实施例1A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH+8mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+30g/L蔗糖 +0. 3% phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良 SH+8mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+50g/L 蔗 糖+0.35% phytageD+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+30g/L白糖+0. 7 %琼脂)+D. 幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后 pH在5. 8左右。实施例2A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH+8mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+30g/L蔗糖 +0. 3% phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良 SH+8mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+50g/L 蔗 糖+0.35% phytageD+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+30g/L白糖+0. 7 %琼脂)+D. 幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后 pH在5. 8左右。实施例3A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH+10mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+30g/L蔗 糖 +0. 3% phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良 SH+5mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+50g/L 蔗糖+0. 35%phytagel)+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+30g/L白糖+0. 7%琼脂)+D. 幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后 pH在5. 8左右。实施例4A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH+10mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+30g/L蔗 糖 +0. 3% phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良 SH+5mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+50g/L 蔗糖+0. 35%phytagel)+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+30g/L白糖+0. 7%琼脂)+D. 幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后 pH在5. 8左右。实施例5A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH+12mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+30g/L蔗 糖 +0. 3% phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良 SH+2mg/L 2,4-D+O. 2mg/L 6_BA+50g/L 蔗糖+0. 35%phytagel)+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+30g/L白糖+0. 7%琼脂)+D. 幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后 pH在5. 8左右。实施例6A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH+12mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+30g/L蔗 糖 +0. 3% phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良 SH+2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6_BA+50g/L蔗糖+0. 35%phytagel)+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+30g/L白糖+0. 7%琼脂)+D. 幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0. 7%琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后 pH在5. 8左右。 将上述360个外植体分别在6个实施例所述的植物生长调节剂组合上进行胚发生 愈伤组织诱导、胚继代形成培养、壮苗生根培养、再生植株移栽。如图1所示在上述的胚发生愈伤组织诱导步骤，通过显微观察看到外植体的愈 伤组织表面形成一些突起，突起细胞质浓，与周围细胞分开，有明显界限，说明这些分裂迅 速的细胞是胚性细胞，且在上述6种组合的胚发生愈伤组织诱导基的实施例中都能获得胚 发生愈伤组织，但胚愈伤组织最高诱导率均是在含有合适浓度的植物生长素或合适比率植 物生长素/细胞激动素的培养基上发生，过高的植物生长素或不合适的植物生长素/细 胞激动素比率均会降低外植体胚愈伤组织发生率，胚发生愈伤组织最有效的组合是2，4-D 10mg/L和6-BAO. 2mg/L，此组合易于大多数基因型诱导产生更多的胚发生愈伤组织，上胚 轴和下胚轴胚愈伤组织发生率平均提高21 %以上(见表1)，可见只有植物生长素/细胞激 动素配比合适，才能促进胚愈伤组织产生和形成。如图2至图4所示在上述的胚继代形成培养步骤，本实验通过设置低温-常温处 理发现，在胚继代形成培养前期经过一定时间的低温处理有利于胚继代成熟，胚继代形成 培养基的特点为降低2，4_D浓度，提高蔗糖和phytagel浓度。6个实施例结果表明适当 降低2，4-D浓度，有利于体细胞胚形成，降低次生体细胞胚产生。6个实施例中，最有效的组 合是2，4-D 5mg/L和6-BA 0. 2mg/L，能较大幅度提高体细胞胚成熟率，使上、下胚轴胚状体 分化率平均提高了 23%以上(见表2)，胚愈伤组织也不再增大变浅或出现褐化，杂三叶胚 愈伤组织表面出现较软浅黄色愈伤，红三叶胚愈伤组织内外镶嵌着许多绿色小硬核，这些 绿色小硬核以后发育成单个小植株，白三叶胚愈伤组织表面发育成较硬的团状颗粒，即球 形胚，这些绿色小硬核或团状颗粒就是正在发育的体细胞胚，当长得比较大时可将其分割 培养进一步发育成单个小植株。如图5-图10所示在胚成熟萌发成苗培养步骤，将上述体细胞胚经过50g/L蔗糖 和0. 35 % phytagel的培养基脱水处理后，会促进80 %的球形胚发育成鱼雷胚和子叶胚，转 接到改良MS+30g/L白糖+0.7%琼脂培养基上培养，会观察到大量分化小苗，每个分化小苗 是由体细胞胚萌发而成，体细胞胚的萌发还包括胚根、胚轴伸长，子叶和真叶形成，最后发 育为自由生长的幼苗。在体细胞胚发育过程中，又以球形胚为最高，子叶分化期胚、成熟胚、香蕉形胚依 次降低，而以梨形胚为最低。表1外植体在实施例5中的胚愈伤组织发生率比较 表2外植体在改良MS上胚状体分化率比较 比较11个品种不同基因型不同部位胚愈伤组织发生率和胚状体分化率。结果见表3和表4:表3三叶草不同部位胚愈伤组织发生率比较 表4三叶草不同部位胚状体分化率比较 从表1和表2中看出杂三叶上、下胚轴胚愈伤组织发生率和胚状体分化率均最 高，飞毯和拉丁诺次之，红三叶瑞得比它们稍差，11个品种上胚轴胚愈伤组织发生率依次为 杂三叶>飞毯>拉丁诺>瑞得>铺地>考拉>海发>胡依阿>爱丽思>百霸>瑞文德；下 胚轴胚愈伤组织发生率依次为杂三叶>拉丁诺>瑞得>飞毯>考拉>铺地>海发>胡依 阿> 百霸 > 爱丽思 > 瑞文德；上胚轴胚状体分化率依次为杂三叶> 飞毯 > 拉丁诺 > 瑞得> 铺地 > 考拉 > 胡依阿 > 海发 > 爱丽思 > 百霸 >瑞文德；下胚轴胚状体分化率依次为杂三叶 >拉丁诺>飞毯>瑞得>铺地>考拉>海发>胡依阿>百霸>爱丽思>瑞文德；再生叶不 同品种胚愈伤组织发生率和胚状体分化率均很高，均在90%以上，不同品种间差异很小。上 述结果说明上、下胚轴不同品种及基因型由于遗传背景的不同，对培养条件反应有一定的 差异，但在相对一致的培养条件下均能得到胚愈伤组织和胚状体分化苗。 在三种三叶草11个品种各360粒种子的试验中，上胚轴胚愈伤组织发生率平均达 到39. 7% ；下胚轴平均达到35. 3% ；再生叶片胚愈伤组织发生率平均达到92. 8% ；上胚轴胚状体分化率平均达到34. 9%，下胚轴平均达到31.7%，再生叶片胚状体分化率平均达到 92.8%。所有参试的品种均能获得再生植株。通过选择适宜外植体、改良基本培养基及成分、调整培养条件等配套措施，有效地 克服了三叶草高频体胚再生培养中不同品种及基因型障碍问题，大幅度提高体细胞胚发生 频率和再生植株频率。以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换 或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基，包括幼苗生长驯化培养基、胚发生愈伤组织诱导培养基、胚继代形成培养基和胚成熟萌发成苗培养基，其特征在于所述的幼苗生长驯化培养基为1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂；所述的胚发生愈伤组织诱导培养基为改良SH+8～12mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％ phytagel；所述的胚继代形成培养基为改良SH+2～8mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L6-BA+50g/L蔗糖+0.35％ phytagel；所述的胚成熟萌发成苗培养基为改良MS+30g/L白糖+0.7％琼脂。
2.根据权利要求1所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基，其特征在 于所述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
3.根据权利要求2所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基，其特征在 于所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下硫酸铵463mg/L ；硝酸钾2830mg/L ；二水氯化钙166mg/L ；七水硫酸镁185mg/L ；无水磷酸二氢钾400mg/L ；乙二胺四乙酸铁钠盐1.4mg/L。
4.根据权利要求2所述的克服三叶革品种基因型障碍高频体胚再生培养方基，其特征 在于所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下一水硫酸锰10mg/L ；硫酸锌1. Omg/L ；硼酸5. Omg/L ；碘化钾1. Omg/L ；钼酸钠0. lmg/L ；硫酸铜0. 2mg/L ；氯化钴0. lmg/L。
5.根据权利要求2所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基，其特征在 于所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下盐酸硫胺素5. Omg/L ；烟酸5. 0mg/L ；盐酸吡哆醇5. 0mg/L。
6.根据权利要求1所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基，其特征在 于所述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
7.根据权利要求6所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基，其特征在 于所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下硫酸铵1650mg/L ；硝酸钾1900mg/L ；七水硫酸镁370mg/L ；无水磷酸二氢钾 170mg/L ； 二水氯化钙440mg/L ；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L; 七水硫酸亚铁 27. 8mg/L。
8.根据权利要求2所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基，其特征在 于所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下四水硫酸锰22. 3mg/L ；硫酸锌8. 6mg/L ；硼酸6. 2mg/L ；碘化钾0. 83mg/L ；钼酸钠0. 25mg/L ；硫酸铜0. 025mg/L ；氯化钴0.025mg/L。
9.根据权利要求2所述的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方基，其特征 在于所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下盐酸硫胺素1. Omg/L ；烟酸1. Omg/L ；盐酸吡哆醇1. Omg/L ；肌醇100mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养基，包括幼苗生长驯化培养基、胚发生愈伤组织诱导培养基、胚继代形成培养基和胚成熟萌发成苗培养基，幼苗生长驯化培养基为1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂；胚发生愈伤组织诱导培养基为改良SH+8～12mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel；胚继代形成培养基为改良SH+2～8mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+50g/L蔗糖+0.35％phytagel；胚成熟萌发成苗培养基为改良MS+30g/L白糖+0.7％琼脂。本发明可有效地克服三叶草高频体胚再生培养中不同品种及基因型障碍问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率，提高育种效率。
文档编号A01H4/00GK101861831SQ20091003497
公开日2010年10月20日 申请日期2009年9月16日 优先权日2009年9月16日
发明者师尚礼, 梁慧敏, 汤容娣, 王小春, 王永平, 鲍容静 申请人:江苏农林职业技术学院