通过体细胞胚胎发生再生和大量繁殖麻风树的制作方法

专利名称：通过体细胞胚胎发生再生和大量繁殖麻风树的制作方法
通过体细胞胚胎发生再生和大量繁殖麻风树相关申请的交叉参考本申请要求2008年2月1日提交的美国临时专利申请系列号No. 61/025，430的 权益和优先权，所述专利全文援引加入本文。
背景技术：
本发明涉及体细胞胚胎产生领域，特别涉及通过体细胞胚胎发生再生麻风树属 (Jatropha)的方法。本发明更特别涉及再生麻风树(Jatrophacurcas)植物的方法和培养 基组合物。所述方法非常适于麻风树转化和产生克隆种植原种用于大规模麻风树种植。本文中使用的举例说明本发明背景或者提供额外关于实施的详细描述的出版物 及其它材料援引加入本文，为方便起见分别附于参考文献中。世界正面临化石燃料供应短缺和温室效应加剧。目前急需增加可再生能源的生产 和消耗。许多国家在发现替代能源以满足其能源安全需求中，生物燃料已被认为是国家优 先级，同时帮助降低导致温室效应的CO2排放。对生物燃料的需求已对食品生产施加了日益 增加的压力。例如，为满足由德国政府颁布的德国2017年的生物燃料需求，该国全部耕地 需要用于生长生物能源作物，没有土地被留下用于食品生产。为减轻这种土地竞争及满足 我们对可再生燃料的需求，强烈需要利用边际土地(marginal land)进行生物能量产生。麻风树是小的木本植物，属于大戟科(Euphorbiaceae)。麻风树的一些独特特征特 征使得其成为生物柴油生产的理想植物。这些包括在边际土地生长的能力；对水的需求低； 非食品作物状态，在种植后1-2年的快速油料生产，相比之下油棕榈要3年以上。因此，印 度尼西亚政府已声明他们在接下来5年内投入大约3百万公顷土地种植麻风树属。在各国中，印度在建立麻风树属种植方面是最先进的。但是，印度麻风树属种植的 种子产量低，在0. 4-12MT/Ha范围(相比之下棕榈为大约19Mt/Ha)。这种差异至少部分由 于缺乏麻风树育种研究和农场管理所致。对来自麻风树的油料的强烈兴趣对供应足够种植用的均质及高产种子已产生巨 大压力。因此，目前急需大量繁殖精选树。同等急需的是改良麻风树的各种农学性质的方 法。基因工程被认为是作物改良的快速方法。植物转化基本上是两步方法，即输送基因进入 宿主细胞，随后再生转化细胞为植物。体细胞胚胎发生愈伤组织或者体细胞胚胎发生悬浮 培养物通常被认为是最有效的再生方法，因为大多数转化细胞已获得胚胎发生潜力，能非 常自发地驱动它们发展为体细胞胚，这是类似于合子胚中的受精卵细胞的过程(Dodeman， et al.，1997)。体细胞胚适于经根癌农杆菌(Agrobacterium tuniefaciens)转化(Mathewset al.，1992)、显微注射(Neuhaus et al.，1987)和颗粒轰击(Wilde et al.，1992)。另外，体 细胞胚或体细胞胚胎发生愈伤组织可以用液氮冷冻保存而不丧失生存力。它们是保持种质 及细胞胚胎发生的理想材料。体细胞胚在来源上是克隆的，因此用体细胞胚繁殖可以具有非常高的无性增加速 率的潜力，并因此有显著商业价值。经体细胞胚胎发生的再生是植物组织培养的有吸引力 的选择。体细胞胚据报道提供比枝(Shoot)更稳定的再生体(regenerant)。使用体细胞胚的再生系统的另一个优势是它们表观单细胞来源。这意味着再生体不可能是嵌合来源的， 因为如果再生体源自一簇细胞而非单细胞，则植物组织可能是嵌合的或者不稳定的并且产 生非正常型。体细胞胚胎发生还被成功用于许多植物物种如香蕉和松树的大量繁殖(C0te et al. ,2000 ；Merkle and Dean，2000)。体细胞胚可以制成合成种子，以降低运输成本和油 料种子竞争(Conrad，1996)。迄今为止，已经揭示了大量体细胞胚胎发生方案。一些实例如下=Eudeset al. (2006) (Pooidaea)、Kasha and Simion (2001，2004)(谷物)、Xie and Hong (2004) (Acacia mangium)、Guiltinan et al. (2001)(可可)、Trolinder et al. (1999)(棉花)、 Rutter et al. (1998a，1998b)(针叶树)、Handley and Levis (1998)(针叶树)、Chee (1991， 1997)(南瓜)、Becwar et al. (1995，1996)(针叶树)、Genovesiand Yingling(1995)(玉 米)、Collins et al. (1991) (Glycine species)、Cooley andWilcox (1987)(向日葵)、 Schoofs et al. (1998)(香蕉)、Jouenne et al. (1995)(葡萄)、Garay et al. (2003) (agave tequilana weber) >Sondahl et al. (1993)(可可)、Armstrong and Deboer (2000) (棉花)、TuIi and Mithilesh (2005)(棉花)、Seabrook and Douglas (1999)(马铃薯)、 Buffard-Morel et al. (1994)(椰子树)以及Cai and Ji (2005)(棉花)。如本文例证，可以 使用各种外植体。然而，无可通用的培养基、培养条件和再生程序。例如，Fki，et al. (2003) 描述了用未成熟开花期的用于枣椰树(Phoenix dactylifera)的方案，其中体细胞胚胎发 生(易碎愈伤组织)在补加高浓度2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)(10mg/l)、30mg/l腺嘌呤、 100mg/l 谷氨酰胺、2mg/l 甘氨酸、30mg/l Fe-EDTA、100mg/lKH2P04、100mg/l 肌醇的 MS 培养 基上起始，并且通过将固体或者液体培养基中2，4-D降低至lmg/1而实现进一步的胚进展。 相反，Cai and Ji (2005)揭示了棉花愈伤组织的体细胞胚胎发生的起始，这是在具有极低 浓度2，4-D和激动素(0. 05mg/l 2,4-D和0. lmg/1激动素)的更简单的培养基中从根外植 体中诱导的，在愈伤组织起始后通过将其暴露于无激素的高硝酸盐培养基中进行。此外，甚 至在相同物种的栽培品种之间也可发现显著改变。对于麻风树的体细胞胚胎发生的研究非常有限。近年来，报道了使用叶组织对麻 风树的体细胞胚胎发生的初步研究结果(Jha et al.，2007)。尽管作者使用激动素和吲哚 丁酸(IBA)组合成功地诱导了体细胞胚胎发生，但是仅2%以下的体细胞胚能转化为可存 活植物。此外，使用该方法的完整有性生命循环有待证实。显然，尽管尝试使用三种种质集 合、包括一种来自印度的种质，我们仍未能用相同方案和外植体在麻风树中诱导体细胞胚 胎发生。因此，需要体细胞胚胎发生方法及制备胚胎发生液体悬浮培养物的方法，从中可 以实现有性可育麻风树植物的高效植物再生和生产。发明概述本发明涉及体外再生麻风树属属植物、更特别是麻风树及其人工杂种的方法。本 发明更特别涉及体细胞胚胎发生和制备胚胎发生液体悬浮培养物的方法，从中可以实现有 性可育麻风树植物的高效植物再生和生产。这些方法也使得可以高效转化这种植物。一方面，本发明提供了从外植体中生产体细胞胚的方法，所述外植体得自麻风树 的合子胚。根据这个方面，将所述外植体置于含有生长素的固体培养基上。可任选补加低 浓度的细胞因子。许多已知的培养基如MS盐、B5盐和FNL盐与MS维生素或者B5维生素的组合对于这种方法是有效的。由此诱导的体细胞胚通常以相似大小的1-2个单独胚存 在，在此被称作I型体细胞胚(TISE)。在高浓度生长素条件下，可以从TISE中产生次生体 细胞胚。如果最初的培养基含有低浓度生长素，则TISE可以直接萌发。或者，它们可以在 另一个不含激素及任选补加氨基酸的培养基上成熟。体细胞胚的萌发可以用赤霉酸(GA3) 在1/2或者1/4强度MS或者B5培养基中改良。萌发的胚可以在培养基中进一步发育2-6 周，之后移植至盆栽土壤中。第二方面，本发明提供了产生体细胞胚和胚胎发生愈伤组织的方法。根据这个方 面，使用两步诱导方法，其中从合子胚切下外植体并且在包含生长素的第一固体培养基中 培养。可任选加入细胞因子。在2-6周、优选2-4周后将如此诱导的外植体移至第二固体 培养基中。第二固体培养基不含激素，任选补加氨基酸。许多已知培养基如MS盐、B5盐和 FNL盐组合MS维生素或者B5维生素在诱导体细胞胚中是有效的，所述胚通常以不同大小 的5个以上的胚群簇存在，在此称作II型体细胞胚(TIISE)。TIISE可以繁殖为胚胎发生 愈伤组织。这些材料是植物繁殖和转化的理想材料。优选将成熟的体细胞胚在具有GA3的 1/2或者1/4强度培养基如MS盐与MS维生素的培养基中萌发。萌发小植物可以在培养基 中进一步发育，之后移植至盆栽土壤中。第三方面，本发明提供了制备胚胎发生液体悬浮培养物的方法。根据这个方面，将 如上述制备的胚胎发生愈伤组织或者TIISE移至液体培养基中，每2-3周定期传代培养。所 述液体培养基可以是MS盐、B5盐和FNL盐与MS维生素或者B5维生素的组合之一。在所 述液体培养基中优选补加氨基酸。所述培养基中优选包含生长素。长度超过0.5cm的体细 胞胚优选在传代培养期间通过筛选除去。培养物保持在摇动平台上，光照16小时。这个液 体培养系统非常适于制备大批量同步体细胞胚，其可以用于植物繁殖以及用作遗传转化的 外植体。第四方面，本发明提供了培养某时期的体细胞胚以再起始胚胎发生发育途径的方 法。根据这个方面，将在液体培养基中继续成熟至不适于起始新的胚胎发生愈伤组织的体 细胞胚的部分在具有高浓度生长素的固体培养基上进一步培养，随后移至进一步补加游离 氨基酸的无激素固体培养基中。本发明的这个方面是液体悬浮培养系统的实际补充，提供 了进行遗传转化的大量外植体。第五方面，本发明提供了维持液体悬浮培养物的方法，由此愈伤组织的量增加以 及胚的萌发被抑制。根据这个方面，将体细胞胚胎发生愈伤组织维持在液体维持培养基中 悬浮培养及通常每2-3周定期传代培养。所述液体维持培养基优选是含有MS盐和B5维生 素的无NH4NO3培养基。也可以使用其它培养基如B5盐与B5维生素、或者FNL盐与B5维生 素，但是效果不佳。在所述液体培养基中优选补加氨基酸。所述培养基中优选包含生长素。 所述液体培养基进一步补加聚乙二醇(PEG)。在所述液体维持培养基中培养使得愈伤组织 的量增加。将这种愈伤组织更均一地维持在球状期或者鱼雷(torpedo)期。所述培养基抑 制胚的萌发。本发明的方法包括完整有效的系统，其可用于再生麻风树属植物、特别是麻风树 种及其人工杂种。通过这个系统已经产生许多体细胞胚，且已经证实再生体在植物性生长 发育和有性预生产(sexual preproduction)中完全正常。附图简述


图1A-1D示出I型体细胞胚(TISE)形成。所有外植体均在具有MS盐、B5培养基、 2. 2g/l phytagel、pH5. 8的培养基中培养。激素水平变化。比例尺表示1mm。图IA 在具 有5mg/l 2，4-D和0. lmg/1激动素的培养基中培养40天后从长度为0. 6cm的子叶中起始 的体细胞胚。图IB 源自胚乳-下胚轴交界处的体细胞胚和次生体细胞胚。外植体在具有 0. 2g/l 2，4-D和0. lmg/1激动素的培养基中培养70天。图IC 源自长度为1. 5cm的合子 胚的胚乳外植体的TISE，所述合子胚已经在具有0. 2g/l 2，4-D和0. lg/1激动素的培养基 中培养40天。图ID 源自胚乳-下胚轴交界处的TISE。外植体在具有0.2g/l 2，4_D和 0. lg/1激动素的培养基中培养21天。图2示出II型体细胞胚(TIISE)的形成。诱导下胚轴外植体形成TIISE，其在DGA 培养基中分化，在G13培养基中萌发。比例尺表示1mm。图3A-3E示出植物再生阶段。图3A 在G13培养基中萌发一个月的体细胞胚。图 3B:小植物在1/2强度MS培养基(具有15g/l蔗糖)中进一步发育一个月。图3C:从TIISE 中再生的麻风树植物。图3D:图3C的特写，示出花。图3E:图3C的特写，示出成熟果实。图4A-4D示出谷氨酰胺、天冬酰胺和KNO3的作用。将体细胞胚暴露于修饰DGA培 养基，4周后照相。图4A:无谷氨酰胺，0.25g/l天冬酰胺。图4B:无谷氨酰胺，0.25g/l天 冬酰胺，KNO3增加至2. 85g/l。图4C 0. 5g/l谷氨酰胺，0. 25g/l天冬酰胺。图4D 图4C的 放大图(方框区)，示出次生胚的大量产生和胚胎发生愈伤组织的形成。D中的比例尺代表 Icm0图5A-5D示出胚胎发生液体悬浮培养物。将在固体DGA培养基中产生的大约50mg 胚胎发生愈伤组织接种于20ml修饰的DGA液体培养基中。在接种之前除去大于2mm的胚。 每两周进行传代培养。2次传代培养后照相。图5A:20g/l蔗糖，lg/Ι谷氨酰胺，0.5g/l天 冬酰胺，无2，4-D。图5B :20g/l蔗糖，lg/Ι谷氨酰胺，0. 5g/l天冬酰胺，0. 2g/l 2，4-D。图 5C :30g/l 蔗糖，lg/Ι 谷氨酰胺，0. 5g/l 天冬酰胺，0. 2g/l 2，4-D。图 5D :20g/l 蔗糖，lg/1 谷氨酰胺，0.5g/l天冬酰胺，lg/1 2，4-D。箭头表示非胚胎发生球形愈伤组织。比例尺表示 Icm0图6示出PEG对于维持液体悬浮培养物的作用。将体细胞胚发生愈伤组织维持 在无NH4NO3的MS培养基、B5维生素、20g/l蔗糖、1. 9g/l KNO3 (全部)、0. 5g/l谷氨酰胺、 0. 25g/l天冬酰胺、0. 3mg/l 2，4_D中。取大约200mg愈伤组织，在样品培养基或者在分别 补加5%、10%和20%PEG8000的培养基中培养。每两周传代培养该培养物。在第8周，确 定全部愈伤组织量。图中示出愈伤组织量的净增加。图中示出三个独立实验的平均值。发明详述本发明涉及体细胞胚产生领域，特别涉及通过体细胞胚胎发生再生麻风树属的方 法。本发明更特别涉及再生麻风树植物的方法和培养基组合物。所述方法非常适于麻风树 转化及产生克隆种植原种用于麻风树大规模种植。通过体细胞胚胎发生繁殖是指在体外从小部分植物组织或者个体细胞中产生胚 的方法。所述胚被称作体细胞胚，因为其衍生自体细胞(营养性)组织，而不是衍生自有性 生殖过程。通过体细胞胚胎发生的无性繁殖具有捕获极其希望的基因型的所有遗传获得量 的能力。此外，这些方法易于顺应自动化和机械化。最后，植物的高效转化可以使用体细胞 胚胎发生再生转化的细胞实现。
在本发明的一方面，体细胞胚通过在外植体组织上诱导体细胞胚形成而产生。在 一个实施方案中，从得自麻风树属植物的合子胚的外植体中诱导体细胞胚。根据这个实施 方案，将外植体置于含有生长素的固体培养基上。优选所述外植体是从合子胚中分离的胚 乳组织。所述合子胚的长度为大约0. 3cm到大约1. 5cm，优选大约0. 5cm到大约1. 5cm，更 优选大约0.5cm到大约1.0cm。在一个实施方案中，在这种组织中有效诱导体细胞胚的生 长素是2，4-D，其浓度在广泛的范围内，例如大约0. lmg/1至大约20mg/l，优选大约1. Omg/ 1至大约5mg/l。所述培养基可任选补加低浓度细胞因子。在一个实施方案中，可包含的 细胞因子是激动素，其浓度为例如大约0. 05mg/l至大约lmg/1。许多已知的培养基可以用 作固体培养基，对于本发明的这个方面是有效的。合适的培养基例子包括MS盐、B5盐或者 FNL盐与MS维生素或者B5维生素的组合。在一个实施方案中，所述含有生长素的培养基不 含NH4NO315在一个实施方案中，所述外植体在黑暗中培养。在另一个实施方案中，所述外植 体在光照和黑暗条件下分段培养。由此诱导的体细胞胚通常以相似大小的1-2个单独胚存 在，在此被称作I型体细胞胚(TISE)。在高浓度生长素条件下，例如在大约1. Omg/1至大 约5mg/l，可以从TISE中产生次生体细胞胚。如果最初的培养基含有低浓度的生长素如2， 4-D如大约0. lmg/1至大约1. Omg/1的2，4-D，则根据本发明的这个方面产生的TISE可以 直接萌发。或者，TISE可以在不含有激素但补加一或多种氨基酸的另一种培养基上成熟。在 一个实施方案中，所述氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺或者谷氨酰胺与天冬酰胺的组合。在 一个实施方案中，这个成熟培养基中的谷氨酰胺的浓度可例如是大约0. 25g/l至大约2g/ 1，优选大约0. 5g/l至大约1. Og/Ι，更优选大约0. 5g/l至大约0. 75g/l。在一个实施方案 中，这个成熟培养基中天冬酰胺的浓度可例如是大约0. lg/Ι至大约lg/Ι，优选大约0. Ig/ 1至大约0. 75g/l，更优选大约0. 25g/l至大约0. 5g/l。在另一个实施方案中，所述氨基 酸是酪蛋白水解物。这个成熟培养基中酪蛋白水解物的浓度可例如是大约50mg/l至大约 1，000mg/l，优选大约100mg/l至大约500mg/ml，更优选大约100mg/l至大约200mg/l。然后将体细胞胚移至萌发培养基中。体细胞胚的萌发可以通过使用1/2或者1/4 强度MS或者B5培养基的培养基用赤霉酸(GA3)改善。在一个实施方案中，GA3是例如大约 0. 5mg/l至大约10mg/l，优选大约lmg/1至大约5mg/l，更优选大约2mg/l至大约3mg/l。萌 发的胚可以在这个培养基中进一步发育2-6周，之后移植至盆栽土壤中。胶凝剂如琼脂和 phytagen在制备固体培养基的应用为本领域技术人员熟知。在一个实施方案中，优选的胶 凝剂是Phytagel。在这个实施方案中，phytagel的量在例如大约2. 2g/l至大约2. 8g/l之 间。在本发明的第二方面，体细胞胚通过两步诱导方法从麻风树属外植体组织中诱导 体细胞胚形成而产生。根据这个方面，外植体在含有生长素的第一培养基中培养。在一个 实施方案中，所述外植体从合子胚中切下。所述合子胚长度为大约0.3cm至大约1.5cm，优 选大约0. 5cm至大约1. 5cm，更优选大约0. 5cm至大约1. Ocm0在第二个实施方案中，外植 体从鱼雷期后(post-torpedo)体细胞胚中切下。在一个实施方案中，得自合子胚或者鱼雷 期后体细胞胚的外植体是下胚轴组织或者根端组织。在一个实施方案中，在这种组织中有 效诱导体细胞胚的生长素是2，4-D，其浓度范围例如是大约0. 5mg/l至大约10mg/l，优选大 约2mg/l至大约5mg/l。所述培养基可任选补加低浓度细胞因子。在一个实施方案中，可包
10含的细胞因子是激动素，浓度为例如大约0. 05mg/l至大约lmg/1。所述外植体在含有生长 素的培养基上培养一段足以起始胚胎发生愈伤组织的时间。在一个实施方案中，在含有生 长素的培养基上的培养时间为大约1周至大约8周，优选大约2周至大约6周，更优选大约 2周至大约4周。然后将胚胎发生愈伤组织和/或外植体移至第二固体培养基上成熟。该第二固体 培养基无激素，补加了一或多种氨基酸。在一个实施方案中，所述氨基酸是谷氨酰胺、天冬 酰胺或者谷氨酰胺与天冬酰胺的组合。在一个实施方案中，谷氨酰胺的浓度可以是例如大 约0. 2g/l至大约2g/l，优选大约0. 2g/l至大约1. 5g/l，更优选大约0. 5g/l至大约1. Og/ 1。在一个实施方案中，天冬酰胺的浓度可以例如是大约0. lg/Ι至大约1. 5g/l，优选大约 0. 2g/l至大约1. Og/Ι，更优选大约0. 25g/l至大约0. 5g/l。在另一个实施方案中，所述 氨基酸是酪蛋白水解物。这个培养基中酪蛋白水解物的浓度可例如是大约50mg/l至大约 1，000mg/l，优选大约100mg/l至大约500mg/ml，更优选大约100mg/l至大约200mg/l。在 一个实施方案中，第二培养基(即无激素培养基)不含NH4NO315在一个实施方案中，所述第 二培养基还含有碳水化合物来源以改善体细胞胚成熟。在一个实施方案中，所述碳水化合 物可以是蔗糖和/或麦芽糖。蔗糖的量可以是大约10g/l至大约20g/l。麦芽糖的量可以 是大约20g/l至大约60g/l。许多已知培养基可用于所述每种固体培养基(即含有生长素 的培养基和无激素培养基)，对于本发明的这个方面是有效的。合适的培养基例子包括MS 盐、B5盐或者FNL盐与MS维生素或者B5维生素的组合。由此诱导的体细胞胚通常以不同 大小的5个以上的胚群簇存在，在此称作II型体细胞胚(TIISE)。TIISE在含有2，4-D的 培养基上持续培养导致胚胎发生愈伤组织产生。TIISE和胚胎发生愈伤组织是植物大量繁 殖和转化的理想材料。然后将体细胞胚移至培养基上萌发。体细胞胚的萌发可以通过使用1/2或者1/4 强度MS或者B5培养基用赤霉酸(GA3)改善。在一个实施方案中，GA3的浓度是例如大约
0.5mg/l至大约10mg/l，优选大约lmg/1至大约5mg/l，更优选大约2mg/l至大约3mg/l。萌 发的胚可以在这个培养基中进一步发育2-6周，之后移植至盆栽土壤中。胶凝剂如琼脂和 Phytagen在制备固体培养基中的应用为本领域熟知。在一个实施方案中，优选的胶凝剂是 phytagel。在这个实施方案中，phytagel的量例如是大约2. 2g/l至大约2. 8g/l。在本发明的第三方面，从根据本发明第二方面产生的胚胎发生愈伤组织或者 TIISE中产生胚胎发生液体悬浮培养物。在一个实施方案中，将所述胚胎发生愈伤组织或 者TIISE移至液体培养基中，每2-3周定期传代培养。许多已知的培养基可用于液体培养 基，在本发明的这个方面有效。合适的培养基例子包括MS盐、B5盐或者FNL盐与维生素MS 或者B5维生素的组合。在一个实施方案中，所述液体培养基补加一或多种氨基酸。在一个 实施方案中，所述氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺或者谷氨酰胺与天冬酰胺的组合。在一个实 施方案中，谷氨酰胺的浓度可以是例如大约0. lg/Ι至大约2g/l，优选大约0. 2g/l至大约
1.5g/l，更优选大约0. 5g/l至大约1. Og/Ι。在一个实施方案中，天冬酰胺的浓度可以是例 如大约0. lg/Ι至大约2g/l，优选大约0. 25g/l至大约1. Og/Ι,以及更优选大约0. 25g/l至 大约0. 5g/l。在一个实施方案中，所述液体培养基含有生长素。在一个实施方案中，在所述 液体悬浮培养系统中有效的生长素是2，4-D，其浓度是例如大约0. lmg/1至大约0. 5mg/l, 优选大约0. 2mg/l至大约0. 3mg/l。在一个实施方案中，所述液体培养基已经被修饰为不含有NH4NO3盐。长度超过0.5cm的体细胞胚优选在传代培养期间通过筛选取出。如本文所述 使体细胞胚成熟和萌发。在一个实施方案中，将培养物以60-100rpm、优选70-90rpm、更优 选SOrpm保持在摇动平台上。在一个实施方案中，将培养物保持在大约20°C至35°C，更优 选大约28°C的温度下。在一个实施方案中，将培养物在光照和黑暗中分阶段培养，优选16 小时光照。所述液体培养系统非常适于大批量制备同步体细胞胚，其可用于植物繁殖及作 为遗传转化外植体。在上述条件下，一部分体细胞胚可继续成熟至不适于在液体培养基中起始新的胚 胎发生愈伤组织的阶段。如果这些材料是在设计为提供再起始的固体培养基中进一步成 熟，则其是再起始胚胎发生发育途径的极佳材料。在一个实施方案中，所述材料首先在含有 高浓度生长素的固体培养基上培养，随后在无激素而进一步补加氨基酸的固体培养基上培 养。在一个实施方案中，有效的生长素是2，4-D，其浓度例如是大约0. lmg/1至大约20mg/l， 优选大约1. Omg/1至大约5mg/l。在一个实施方案中，所述氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺或 者谷氨酰胺与天冬酰胺的组合。在一个实施方案中，谷氨酰胺的浓度可以是例如大约0. 2g/ 1至大约2g/l，优选大约0. 2g/l至大约1. 5g/l，更优选大约0. 5g/l至大约1. Og/Ι。在一 个实施方案中，天冬酰胺的浓度可以是例如大约0. 2g/l至大约1. 5g/l，优选大约0. 2g/l至 大约1. Og/Ι，更优选大约0. 25g/l至大约0. 5g/l。这个实施方案是所述液体悬浮培养系统 的实际补充，可以提供用于遗传转化的大量外植体。第四方面，本发明提供了维持液体悬浮培养物的方法，由此愈伤组织量增加而胚 萌发被抑制。根据这个方面，体细胞胚胎发生愈伤组织在液体维持培养基中维持悬浮培养 以及每2-3周定期传代培养。所述液体维持培养基是无NH4NO3培养基，其含有MS盐和B5 维生素。也可以使用其它培养基如B5盐与B5维生素，或者FNL盐与B5维生素。在一个实 施方案中，所述液体维持培养基优选补加一或多种氨基酸。在一个实施方案中，所述氨基酸 是谷氨酰胺、天冬酰胺或者谷氨酰胺与天冬酰胺的组合。在一个实施方案中，谷氨酰胺的浓 度可以是例如大约0. lg/Ι至大约2g/l，优选大约0. 2g/l至大约1. 5g/l，更优选大约0. 5g/ 1至大约1. Og/Ι。在一个实施方案中，天冬酰胺的浓度可以是例如大约0. lg/Ι至大约2g/ 1，优选大约0. 25g/l至大约1. Og/Ι，更优选大约0. 25g/l至大约0. 5g/l。在一个实施方案 中，所述液体维持培养基优选含有生长素。在一个实施方案中，在所述液体维持培养系统中 有效的生长素是2，4-D，其浓度例如是大约0. lmg/1至大约0. 5mg/l，优选大约0. 2mg/l至 大约0.3mg/l。在一个实施方案中，所述液体维持培养基进一步优选补加聚乙二醇(PEG)。 在一个实施方案中，培养基中PEG的浓度可以是例如大约至大约15%，优选大约3%至 大约10%，更优选大约3%至大约7%。在一个实施方案中，PEG适于植物组织培养。在一 个实施方案中，PEG的平均分子量可以是例如大约1，000至大约15，000，优选大约1，000至 大约10，000，更优选大约5，000至大约10，000。在液体维持培养基中培养使得愈伤组织的 量增加。将这种愈伤组织更均一地维持在球形期或者鱼雷期。所述培养基抑制胚的萌发。本发明可以使用麻风树属成员的植物实施，优选使用麻风树或者含有大量 麻风树的基因组DNA的麻风树人工杂种。这种人工杂种的例子是麻风树与琴叶珊瑚 (J. intergerima)的 Fl 代及其回交子代(Sujatha and Prabakaran，2003)。本发明提供了 可用于再生麻风树属植物的完整有效的系统。通过这些系统已经产生许多体细胞胚，而且 已经证实再生体在无性发育和有性繁殖中是完全正常的，即获得有性可育植物。
此外，本发明提供了可用于转化麻风树属植物的系统。转化/转染方法对于麻风 树属植物的转化不是关键的，目前可利用各种转化或者转染方法。可利用更新的方法直接 转化谷物或者其它宿主细胞。因此，已经揭示了许多方法将DNA序列插入宿主细胞的基 因组中以获得该序列的转录和/或翻译，实现生物体中表型改变。因此，可以使用有效转 化 / 转染的任何方法。见例如 Mathews et al. (1992)、Neuhaus et al. (1987)、Wilde et al. (1992)、美国专禾IJ No. 7，241，937,7, 273，966和7，291，765以及美国专利申请出版物 No. 2007/0231905 和 2008/0010704 所述。也见国际公开申请 No. W02005/103271 所述。在一个实施方案中，可以使用本领域熟知技术将外植体组织与携带含有感兴趣的 基因或者核酸的DNA构建体的农杆菌菌株共培养。可以使用本领域熟知的常规技术选择转 化的组织。在另一实施方案中，可以使用本领域熟知的技术将胚胎发生液体悬浮培养物与 携带含有感兴趣的基因或者核酸的DNA构建体的农杆菌菌株共培养。可以使用本领域熟知 的常规技术选择转化的组织。在再一个实施方案中，可以使用常规技术如颗粒轰击将所述 DNA导入外植体组织或者胚胎发生液体悬浮培养物细胞中。转化的组织可以通过使用本领 域熟知的常规技术选择。转化或者转基因植物可以通过使用本文所述方法再生。相似地，插入麻风树属植物中的DNA (感兴趣的DNA)对于转化过程不是关键的。通 常导入植物中的DNA是构建体的一部分。所述DNA可以是感兴趣的基因，例如蛋白质的编码 序列，或者其可以是能调节基因表达的序列，如反义序列、有义阻抑序列或者miRNA序列。 所述构建体典型包含调节区，其与感兴趣的DNA的5’末端和/或感兴趣的DNA的3’末端可 操纵地连接。含有所有这些元件的盒在本文也被称作表达盒。所述表达盒在表达盒构建体 中可另外含有5’前导序列。调节区(即启动子、转录调节区以及翻译终止区)和/或编码 信号锚的多核苷酸对于宿主细胞或者彼此是天然/相似的。或者，调节区和/或编码信号 锚的多核苷酸与宿主细胞或者彼此可以是异源的。见美国专利No. 7，205，453和美国专利 申请出版物No. 2006/0218670和2006/0248616所述。所述表达盒可另外含有选择标记基 因。见美国专利No. 7，205，453和美国专利申请出版物No. 2006/0218670和2006/0248616 所述。通常，所述表达盒包含用于选择转化的细胞的选择标记基因。选择标记基因用 于选择转化的细胞或者组织。通常，植物选择标记基因编码抗生素抗性，合适的基因包括 至少一组如下合适基因编码抗生素壮观霉素抗性的基因、编码链霉素抗性的链霉素磷酸 转移酶(SPt)基因、编码卡那霉素或者遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptll)基因、 编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt或者aphiv)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因。 或者，植物选择标记基因编码除草剂抗性如对磺酰脲型除草剂、草丙磷(glufosinate)、 草甘膦(glyphosate)、铵、溴苯腈、咪唑啉酮以及2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4_D)的抗性，包 括编码除草剂抗性的基因，其作用是抑制谷氨酰胺合酶如草胺膦或者basta的作用(例 如bar基因)。通常见WO 02/36782、美国专利No. 7，205，453和美国专利申请出版物 No. 2006/0248616和2007/0143880及其中引用的那些参考文献所述。选择标记基因的列表 非限于此。可以使用任何选择标记基因。许多启动子可用于实施本发明。可以基于希望的结果选择启动子。即核酸可以 与组成型、组织优选或者其它启动子组合以在感兴趣的宿主细胞中表达。这种组成型启动 子包括例如Rsyn7的核心启动子(W099/48338和美国专利No. 6，072, 050)、CaMV35s启动子(Odell et al.，1985)、水稻肌动蛋白(McElroy et al.，1990)、遍在蛋白(Christensen and Quail, 1989 andChristensen et al.，1992)、pEMU(Last et al.，1991)、MAS(Velten et al.，1984)、ALS启动子(美国专利No. 5，659，026)等。其它组成型启动子包括例如在美国 专利 No. 5，608，149,5, 608，144,5, 604，121,5, 569，597,5, 466，785,5, 399，680,5, 268，463 和 5，608，142 所述。其它启动子包括可诱导启动子，特别是病原体可诱导启动子。这种启动子包括来 自发病相关蛋白(ra蛋白)的那些启动子，其在感染病原体后被诱导，例如ra蛋白、SAR 蛋白、0-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。其它启动子包括在病原体感染部位局部或者附近 表达的那些启动子。在进一步的实施方案中，启动子可以是创伤可诱导启动子。在其它实 施方案中，可以使用化学调节的启动子以通过应用外源化学调节剂调节基因在植物中的表 达。所述启动子可以是化学可诱导启动子，其中应用化合物诱导基因表达；或者是化学可 阻抑启动子，其中应用化合物阻抑基因表达。此外，组织优选的启动子可用于在特定植物组 织内靶向增强感兴趣的多核苷酸表达。这些启动子在美国专利No. 6，506，962,6, 575，814、 6，972，349和7，301，069以及在美国专利申请出版物No. 2007/0061917和2007/0143880中 描述。感兴趣的DNA可以适当地优化以增加在转化的植物中表达。即可以使用植物优选 的密码子合成编码序列以改良表达。本领域可获得合成植物优选的基因的方法。见例如美 国专利 No. 5，380，831,5, 436，391 和 7，205，453 以及美国专利申请出版物No. 2006/0218670 和 2006/0248616 所述。除非特别指出，可以使用本领域技术人员已知的常规化学、分子生物学、微生 物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学等方法实 施本发明。见例如 Maniatis et al, 1982, MolecularCloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork)、 Sambrook et al,1989, Molecular Cloning,2nd Ed. (Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)、Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York)、Ausubel et al,1992, Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley&Sons, including periodic updates)、 Glover, 1985, DNACloning(IRL Press, Oxford) > Russell, 1984, Molecular biology of plants :alaboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N. Y. ) >Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York,1992)、Guthrie and Fink, Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology (Academic Press, New York,1991)、Harlow and Lane,1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)、 Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames&S. J. Higgins eds. 1984)、Transcription And Translation(B. D. Hames&S. J. Higgins eds.1984)、Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. ,1987)> ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press, 1986)、B. Perbal, A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984) ；the treatise, Methods In Enzymology (AcademicPress, Inc. , N. Y. ) > Methods In Enzymology, Vols.154 and 155(Wu et al. eds. ), Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer and Walker, eds. , Academic Press, London,1987)、Handbook Of Experimental Immunology, Volumes HV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds. ,1986)> Riott, Essentiallmmunology,6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988、Fireet al. , RNA Interference Technology :From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge,2005 ；Schepers, RNA Interference inPractice, ffiley-VCH,2005 ；Engelke, RNA Interference(RNAi) :The Nuts&Bolts of si RNA Technology, DNA Press, 2003 ；Gott, RNA Interference, Editing, and Modification :Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology), Human Ptess,Totowa,NJ,2004、Sohail,Gene Silencing by RNA Interference :Technology and Application, CRC, 2004 所述。
实施例参考如下实施例描述本发明，所述实施例只是举例说明本发明，无任何限制之意。 利用本领域熟知的标准技术或者在下文特别描述的技术。实施例1培养基5K :MS 盐、B5 维生素、30g/l 蔗糖、2. 2g/l phytagel、5mg/l 2，4_D、0. lmg/1 激动 素，pH 5. 8。10K :MS 盐、B5 维生素、30g/l 蔗糖、2. 2g/l phytagel、10mg/l 2，4_D，0. lmg/1 激动 素，pH 5. 8。d20 :MS 盐、B5 维生素、30g/l 蔗糖、2. 2g/l phytagel、2，4_D 20mg/12，4_D，pH 5. 8。EGA0 缺乏 NH4N03(NH4N03_deficient)的 MS 盐、B5 维生素、30g/l 葡萄糖、2. 4g/l phytagelUg/1谷氨酰胺、0. 5g/l天冬酰胺。EGAh 缺乏 NH4N03 的 MS 盐、B5 维生素、30g/l 蔗糖、2. 4g/l phytagel、lg/1 谷氨酰 胺、0. 5g/l 天冬酰胺、0. 95g/l KN03DGA 无 NH4N03 的 MS 盐、B5 维生素、30g/l 蔗糖、2. 2g/l phytogel、lg/1 谷氨酰胺、 0. 5g/l 天冬酰胺，pH 5.8。G13 :MS 盐、B5 维生素、3mg/l GA3、30g/l 蔗糖、2. 2g/l phytagel, pH 5. 8。G12-1 :1/2MS 盐、1/2B5、0. 01mg/l 萘乙酸(NAA)、200mg/l 酪蛋白水解物、15g/l 蔗 糖、3g/l phytagel, pH 5. 8。MS培养基成分的一般描述见Murashige and Skoog (1962)，B5培养基成分的一般 描述见 Gamborg et al. (1968)。实施例2无菌外植体的组织培养条件和制备除非特别指出，将植物材料在90mm培养皿中培养，将其置于清洁房间中的光照架 子上，在28°C恒定温度以16-8小时日-夜循环培养。用1-4个具有大约60-150 iimol/m2/ s光合作用光子流量(PPF)的Phillips Fluotone管(36W)提供光照。在播种进土壤中之后第5至第7天收获幼苗。通过在10% H202中洗涤20分钟及
15随后用无菌水漂洗3次进行表面灭菌。发育中的果实通过在70%乙醇中浸泡30分钟及随 后在无菌水中洗涤3次而灭菌。在置于层流内的立体显微镜下用外科手术刀切下发育中的 种子和合子胚。在65mm塑料圆柱形容器中或者250ml玻璃锥形瓶中进行液体培养，所述容器置于 80rpm摇床中在28°C恒定温度及16_8小时日_夜循环条件下培养。实施例3外植体对于诱导体细胞胚胎发生的作用我们检测了各种外植体和激素浓度对于诱导麻风树体细胞胚的作用。将在播种 于土壤中5-7天后收获的幼苗进行表面灭菌，从萌发的种子中切下茎、叶、叶柄、子叶、下胚 轴，并且切成长度为大约0. 5cm。将外植体在许多固体培养基上培养，所述培养基含有MS盐 和B5维生素，补加0-20mg/12，4-D、0-0. 01mg/l萘乙酸(NAA)和0-lmg/l细胞因子，如激动 素、6-苄基氨基嘌呤(BAP)、N6-(2-异戊烯基)腺嘌呤(2ip)、玉米素或者玉米素核苷。将 外植体和愈伤组织大约每两周在相同培养基或者无激素培养基中传代培养。具有二倍浓度 KN03(1.9g/l)的修饰的无NH4S04-培养基也用于传代培养。在至少4个月后在所有检测的 培养基中均未观测到体细胞胚。实施例42,4-D对于合子胚外植体中体细胞胚胎发生的作用将发育中的果实表面灭菌。使用外科手术刀将未成熟的合子胚和胚乳(En)彼此 分离。将长度超过0. 5cm的合子胚在子叶_下胚轴交界处进一步切割，产生仅子叶外植体 及具有根radicals的下胚轴。将短于0. 5cm的合子胚完整培养，因为其太易碎。我们将这 些外植体分类为子叶(Cot)、有根radicals的下胚轴(Rh)、完整胚(Eb)和胚乳(En)。将外植体在包含MS盐、B5维生素和0. 1至20mg/L的各种浓度2，4_D的固体培养 基上培养。在一些处理中加入0. lmg/L激动素。在大约第10天，体细胞胚开始出现，无明 显愈伤组织形成迹象，其主要在已经分离胚的胚乳组织边缘形成。体细胞胚最可能源自附 着于胚乳上的合子胚组织的剩余二倍体细胞。在胚乳_合子胚交界处优先形成体细胞胚提 示胚乳组织也许提供为体细胞胚起始和发育必需的外部信号或者营养素。这些体细胞胚迅 速发育及主要成熟为单胚(
图1)。我们称其为I型体细胞胚(TISE)。尽管2，4-D在高水 平呈现出抑制性，但是在所有检测的培养基中均观测到TISE (表1)。表 12,4-D及培养基改变对于体细胞胚形成的作用
权利要求
通过体细胞胚胎发生再生麻风树属(Jatropha)可育植物的方法，包括(a)从麻风树属未成熟合子胚中分离胚乳组织；(b)在含有生长素的固体培养基上培养该胚乳组织一段足以诱导体细胞胚产生的时间；及(c)在固体萌发培养基上培养该体细胞胚一段足以使体细胞胚萌发产生小植物的时间。
2.权利要求1的方法，其进一步包括在步骤(b)之后及在步骤(c)之前的步骤(bl)在 固体成熟培养基上培养体细胞胚一段足以使该体细胞胚成熟的时间。
3.权利要求1或2的方法，其进一步包括在步骤(c)之后和步骤(d)之前的在培养基 上使小植物生根、使小植物适应盆栽土壤以及使小植物生长成开花植物的步骤。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述含有生长素的培养基含有2，4-D。
5.权利要求4的方法，其中含有生长素的培养基中2，4-D的浓度为大约0.lmg/1至大 约20mg/l，优选大约0. lmg/1至大约5mg/l。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中含有生长素的培养基包含选自由MS盐、B5盐和 FNL盐组成的组中的盐。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中含有生长素的培养基不含NH4NO315
8.权利要求6或7的方法，其中所述培养基包含选自由MS维生素和B5维生素组成的 组中的维生素。
9.权利要求1的方法，其中胚乳组织在黑暗中培养。
10.权利要求1的方法，其中胚乳组织在光照和黑暗循环条件下培养。
11.权利要求1的方法，其中胚乳组织与携带DNA构建体的农杆菌菌株共培养。
12.权利要求2的方法，其中成熟培养基补加有大约0.25g/l至大约2g/l、优选大约 0. 5g/l至大约lg/Ι、更优选大约0. 5g/l至大约0. 75g/l的谷氨酰胺。
13.权利要求2的方法，其中成熟培养基补加有大约0.lg/Ι至大约lg/Ι、优选大约 0. lg/Ι至大约0. 75g/l、更优选大约0. 25g/l至大约0. 5g/l的天冬酰胺。
14.权利要求2的方法，其中成熟培养基补加有大约50mg/l至大约1，000mg/l、优选大 约100mg/l至大约500mg/l、更优选大约100mg/l至大约200mg/l的酪蛋白水解物。
15.权利要求1的方法，其中萌发培养基含有大约0.5mg/l至大约10mg/l、优选大约 lmg/1至大约5mg/l、更优选大约2mg/l至大约3mg/l的GA3。
16.权利要求1的方法，其中合子胚的长度为大约0.3cm至大约1. 5cm,更优选长度大 约0. 5cm至大约1. 0cm。
17.通过体细胞胚胎发生再生麻风树属可育植物的方法，包括(a)在含有激素的固体培养基上培养麻风树属外植体一段足以使愈伤组织开始生长的 时间；(b)在无激素培养基上培养所述外植体或者愈伤组织一段足以发生体细胞胚或者胚胎 发生愈伤组织的时间；(c)在固体成熟培养基上培养所述体细胞胚一段足以使所述体细胞胚成熟的时间；及(d)在萌发培养基上培养所述成熟的体细胞胚一段足以使所述体细胞胚萌发产生小植 物的时间。
18.权利要求17的方法，其进一步包括在步骤(d)之后的步骤(e)使所述小植物在培 养基上生根、使所述小植物适应盆栽土壤以及使所述小植物生长为开花植物。
19.权利要求17或者18的方法，其中所述外植体是未成熟合子胚。
20.权利要求19的方法，其中所述合子胚的长度为大约0.3cm至大约1. 5cm，优选长度 大约0. 5cm至大约1. 0cm。
21.权利要求17或者18的方法，其中所述外植体是体细胞胚。
22.权利要求21的方法，其中所述体细胞胚是鱼雷期后体细胞胚。
23.权利要求19-22任一项的方法，其中所述外植体是下胚轴和根端组织。
24.权利要求17-23任一项的方法，其中含有激素的培养基包含选自由MS盐、B5盐和 FNL盐组成的组中的盐。
25.权利要求24的方法，其中含有激素的培养基包含选自由MS维生素和B5维生素组 成的组中的维生素。
26.权利要求17-25任一项的方法，其中含有激素的培养基含有生长素。
27.权利要求26的方法，其中所述生长素是2，4-D。
28.权利要求27的方法，其中2，4-D的浓度为大约0.5mg/l至大约10mg/l，优选大约 2mg/l 至大约 5mg/l。
29.权利要求17-28任一项的方法，其中将所述外植体在含有激素的固体培养基上培 养大约1周至大约8周，优选大约2周至大约6周，更优选大约2周至大约4周。
30.权利要求17-29任一项的方法，其中无激素培养基含有硝酸盐。
31.权利要求30的方法，其中所述无激素培养基含有大约0.5g/l至大约3.8g/lKNO3, 优选大约0. 95g/l至大约1. 9g/l KNO30
32.权利要求17-31任一项的方法，其中无激素培养基不含NH4NO315
33.权利要求17-32任一项的方法，其中无激素培养基补加有一或多种氨基酸。
34.权利要求33的方法，其中氨基酸是大约0.2g/l至大约2g/l、优选大约0. 2g/l至 大约1. 5g/l、更优选大约0. 5g/l至大约1. Og/Ι的谷氨酰胺。
35.权利要求33的方法，其中氨基酸是大约0.2g/l至大约1. 5g/l、优选大约0. 2g/l 至大约1. 0/1、更优选大约0. 25g/l至大约0. 5g/l的天冬酰胺。
36.权利要求17-35任一项的方法，其中无激素培养基是固体培养基。
37.权利要求17-36任一项的方法，其中成熟培养基含有大约10g/l至大约20g/l蔗糖。
38.权利要求17-36任一项的方法，其中成熟培养基含有大约20g/l至大约60g/l麦芽糖。
39.权利要求17-38任一项的方法，其中萌发培养基含有大约0.5mg/l至大约5mg/l、 优选大约lmg/1至大约4mg/l、更优选大约2mg/l至大约3mg/l的GA3。
40.权利要求17-39任一项的方法，其中萌发培养基是1/2至1/4强度MS盐和MS维生
41.权利要求17-40任一项的方法，其中所述外植体和愈伤组织任选用DNA构建体转化。
42.建立麻风树属的植物体细胞胚胎发生液体悬浮培养物的方法，包括(a)在含有激素的固体培养基上培养所述麻风树属外植体一段足以使愈伤组织开始生 长的时间；(b)在无激素培养基上培养所述外植体或者愈伤组织一段足以发生体细胞胚或者胚胎 发生愈伤组织的时间；(c)在液体培养基上培养胚胎发生愈伤组织或者体细胞胚，产生体细胞胚胎发生愈伤 组织或者胚状体；及(d)定期传代培养及根据大小选择体细胞胚胎发生愈伤组织或者胚状体。
43.权利要求42的方法，其中所述外植体是未成熟合子胚。
44.权利要求43的方法，其中所述合子胚的长度为大约0.3cm至大约1. 5cm，优选长度 大约0. 5cm至大约1. 0cm。
45.权利要求42的方法，其中所述外植体是体细胞胚。
46.权利要求45的方法，其中所述体细胞胚是鱼雷期后体细胞胚。
47.权利要求43-45任一项的方法，其中所述外植体是下胚轴和根端组织。
48.权利要求42-47任一项的方法，其中含有激素的培养基包含选自由MS盐、B5盐和 FNL盐组成的组中的盐。
49.权利要求48的方法，其中含有激素的培养基包含选自由MS维生素和B5维生素组 成的组中的维生素。
50.权利要求42-49任一项的方法，其中含有激素的培养基含有生长素。
51.权利要求50的方法，其中所述生长素是2，4-D。
52.权利要求51的方法，其中2，4-D的浓度为大约0.5mg/l至大约10mg/l，优选大约 2mg/l 至大约 5mg/l。
53.权利要求42-52任一项的方法，其中在含有激素的固体培养基上培养所述外植体 大约1周至大约8周，优选大约2周至大约6周，更优选大约2周至大约4周。 权利要求42-53任一项的方法，其中无激素培养基含有硝酸盐。
54.权利要求53的方法，其中无激素培养基含有大约0.5g/l至大约3.8g/lKNO3，优 选大约0. 95g/l至大约1. 9g/l KNO30
55.权利要求42-54任一项的方法，其中无激素培养基不含NH4NO315
56.权利要求42-55任一项的方法，其中无激素培养基补加有一或多种氨基酸。
57.权利要求56的方法，其中氨基酸是大约0.2g/l至大约2g/l、优选大约0. 2g/l至 大约1. 5g/l、更优选大约0. 5g/l至大约1. Og/Ι的谷氨酰胺。
58.权利要求56的方法，其中氨基酸是大约0.2g/l至大约1. 5g/l、优选大约0. 2g/l 至大约1. 0/1、更优选大约0. 25g/l至大约0. 5g/l的天冬酰胺。
59.权利要求42-58任一项地方法，其中无激素培养基是固体培养基。
60.权利要求42-59任一项的方法，其中液体培养物保持在摇动平台上，优选保持在 60-100rpm。
61.权利要求42-60任一项的方法，其中液体培养物每天保持一定时间的光照。
62.权利要求42-61任一项的方法，其中所述液体培养基含有低浓度的生长素。
63.权利要求62的方法，其中所述生长素是2，4-D。
64.权利要求63的方法，其中2，4-D的浓度为大约0.lmg/1至大约0. 5mg/l，优选大约.0. 2mg/l 至大约 0. 3mg/l。
65.权利要求42-64任一项的方法，其中液体培养基含有一或多种氨基酸。
66.权利要求65的方法，其中所述液体含有大约0.lg/Ι至大约2.0g/l、优选大约 0. 2g/l至大约1. 5g/l、更优选大约0. 5g/l至大约1. Og/Ι的谷氨酰胺。
67.权利要求65的方法，其中所述液体培养基含有大约0.lg/Ι至大约2g/l、优选大约 0. 25g/l至大约lg/Ι、更优选大约0. 25g/l至大约0. 5g/l的天冬酰胺。
68.了要求42-67任一项的方法，其中所述液体培养基含有大约0. 5g/l至大约3. 8g/l KNO3，优选大约 0. 95g/l 至大约 1. 9g/l KNO30
69.权利要求42-68任一项的方法，其中所述液体培养基不含NH4NO315
70.权利要求42-69任一项的方法，其中所述液体培养基含有聚乙二醇(PEG)。
71.权利要求70的方法，其中PEG的分子量在大约1，000和大约10，000之间。
72.权利要求70的方法，其中PEG的浓度在大约和大约15%之间、优选在大约3% 和大约之间。
73.权利要求42-72任一项的方法，其中所述液体培养基含有选自由MS盐、B5盐和FNL 盐组成的组中的盐。
74.权利要求73的方法，其中所述液体培养基含有选自由MS维生素和B5维生素组成 的组中的维生素。
75.权利要求1-74任一项的方法，其中所述植物是麻风树(Jatrophacurcas)。
76.权利要求1-74任一项的方法，其中所述植物是含有麻风树的大量基因组DNA的人 工杂种。
全文摘要
本发明涉及体细胞胚胎产生领域，特别涉及通过体细胞胚胎发生再生麻风树属(Jatropha)的方法。更特别地，本发明涉及再生麻风树(麻风树)植物的方法和培养基组合物。本发明的方法非常适于麻风树转化和产生克隆种植原种，用于大规模麻风树种植。
文档编号A01G7/00GK101952447SQ200980103600
公开日2011年1月19日 申请日期2009年1月7日 优先权日2008年2月1日
发明者纪良辉, 蔡林 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司