专利名称：重组缺失型人角质细胞生长因子Ⅰ型的化学偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及缺失型人角质细胞生长因子I型的重组制备，缺失型人角质细胞生长因子I型的聚乙二醇修饰，以及修饰后的纯化和其应用。
背景技术：
迄今为止，已发现两种角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)， 即角质细胞生长因子I型(KGF-I)和角质细胞生长因子II型(KGF-II)。它们分别是成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)家族的成员，又命名为FGF-7和 FGF-10 (Aaronoson SA. et al. J. Annals of the New York Academy of science,1991, 638 :62-77.)。KGF-1 最初由 Rubin 等人(Rubin, J. S.，et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(3) :p. 802-6.)从人胎肺成纤维细胞的培养上清中分离并纯化的，并发现具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用，故将其定名为角质细胞生长因子。KGF-II是Emoto等 (Emoto H Tagashira S MatteiMG,Journal of biology chemistry,1997(37)) ψ 1997 ^Ξ 从肺中分离出编码人KGF-II的cDNA。人角质细胞生长因子 I 型(human keratinocyte growth factor, hKGF-I)位于 15号染色体，其cDNA编码194个氨基酸残基，包括一段21个氨基酸的分泌信号肽。成熟的hKGF-I为一含163个氨基酸残基的单链多肽。临床前研究和临床研究显示，人角质细胞生长因子I型是一种多功能的生长因子，通过促进细胞的增殖、迁移、分化、存活、DNA修复以及诱导对活性氧具有解毒功能的酶的表达来加强上皮功能，从而保护上皮免于毒性物质的损伤(Finch, P. W.，et al.，Science, 1989. 245(4919) :ρ· 752-5. ； Rub in, J. S.，et al. V ；Farrel 1, C. L. , et al. ,Int J Radiat Biol, 1999. 75(5) :ρ· 609—20· ；Farrel 1, C. L., et al. , Cancer Res,1998. 58(5) :ρ·933-9. ；Ellison CA, et al. , J Clin Immunol,2008, 28(5) :600-615.)。由Amgen公司开发的重组人角质形成细胞生长因子hi if ermin (商品名 Kepivance)是缺失人角质形成细胞生长因子I型的N末端23个氨基酸(Δ 23hKGF) (Eric Hsu et al. ,ProteinEngineering,Design & Selection vol.19 no. 4 pp. 147-153,2006), 于2004年被美国FDA批准用于治疗血液肿瘤患者高剂量化疗或者联合放疗导致的严重口腔粘膜损伤。Δ 23hKGF在体内的半衰期仅为》ir，临床给药剂量大(60 μ g/kg/日)，需连续给药7天(1次/天)。在治疗用蛋白质药物的研究中，解决蛋白类药物在机体内半衰期短的方法众多。 其中最有效的方法之一是将蛋白质与水溶性聚合物共价结合成偶联物。而所使用的水溶性聚合物包括聚乙二醇、聚乳糖、聚合氨基酸等，其中聚乙二醇的使用最为普遍。聚乙二醇-蛋白质偶联物具有良好的热稳定性、抗酶解、增加水溶性、延长体内半衰期、降低免疫原性和毒性等多重优点anada，et al.，J. Bioact. And CompatiblePolymers, 5 :343(1990) ；Delgalo,et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carriersystems,9 :249 (1992) ；katre, Advanced Drug Delivery Systems,10 91(1993)). 1991年第一种用聚乙二醇(PEG)修饰的药物PEG-ADA上市，近几年上市的产品有PEG-干扰素、PEG-粒细胞集落刺激因子、PEG-天冬酰胺酶、PEG-生长抑素以及PEG-利巴韦林等。此外，尚有数十种PEG修饰的蛋白药物处于研究或临床实验阶段。检索国内外专利和文献发现，采用聚乙二醇修饰人角质细胞生长因子的公开文■ i又有 Zhifeng Huang 等人(Zhifeng Huang, et al.，Journal of Biotechnology 142(2009)242-249.)针对人角质细胞生长因子N末端的聚乙二醇修饰。本专利发明了马来酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇特异性修饰重组缺失型人角质细胞生长因子I型的第17 位半胱氨酸的游离巯基，该修饰方法修饰而成的重组缺失型人角质细胞生长因子I型化学偶联物，具有修饰位点专一、结构均一、易于实施等优势；更为重要的是在保留人角质细胞生长因子I型的生物活性下，能有效改善其体内代谢动力学特性，实现延长半衰期，减少给药频率，更适用作为一种预防或治疗性药物。
发明内容
本发明的目的是采用聚乙二醇与重组缺失型人角质细胞生长因子I型的半胱氨酸的游离巯基共价连接而形成的偶联物，该偶联物能有效改善人角质形成细胞生长因子在体内的药代动力学；同时该偶联物，可作为一种预防或治疗药物，或药物组合物，在有效治疗剂量用于治疗对放化疗引起的消化道粘膜损伤或溃疡性黏膜炎、急性化学性肝损伤。天然野生型人角质细胞生长因子是一个含163个氨基酸残基的单链多肽，含位于1,15,40,102,106的五个半胱氨酸，其中Cysl_Cysl5、Cysl02_Cysl06形成两对二硫键，Cys40 以游离巯基形式存在(Timothy D. Osslund et al. , prorein Science (1998)，7 1681-1690)。本发明所述的聚乙二醇与重组缺失型人角质细胞生长因子I型的半胱氨酸的游离巯基共价连接中的半胱氨酸的游离巯基，指的是天然野生型人角质细胞生长因子I型 (hKGF) N末端缺失23个氨基酸的人角质细胞生长因子突变体(A23hKGF)的第17位半胱氨酸(Cys)，相当于天然野生型人角质细胞生长因子I型的第40位半胱氨酸。为了实现本发明的目的，本发明首先界定了缺失型人角质细胞生长因子I型的氨基酸序列或组成。所述的缺失型人角质细胞生长因子I型是指在天然野生型人角质细胞生长因子I型的氨基末端缺失23个氨基酸的突变体，序列特征为(序列为SEQ ID No:l)Ser TyrAspTyr Met Glu GlyGlyAsp lieArgValArgArg LeuPhe
Cys ArgThrGln Trp Tyr LeuArglie AspLysArgGlyLys ValLys
Gly ThrGlnGlu Met Lys AsnAsnTyr AsnlieMetGlulie ArgThr
Val AlaValGly lie Val AlalieLys GlyValGluSerGlu PheTyr
Leu AlaMetAsn Lys Glu GlyLysLeu TyrAlaLysLysGlu CysAsn
Glu AspCysAsn Phe Lys GluLeulie LeuGluAsnHisTyr AsnThr
Tyr AlaSerAla Lys Trp ThrHisAsn GlyGlyGluMetPhe ValAla
Leu AsnGlnLys Gly lie ProValArg GlyLysLysThrLys LysGlu
Gln LysThrAla His Phe LeuProMet AlalieThr 同时包含在SEQ ID No :1序列的基础上氨基末端增加或减少1_5个氨基酸的变异体。如从SEQ ID No 1序列的N末端增加一个甲硫氨酸(Met)，或增加5个氨基酸序列为Pro-Glu-Arg-Hi s-Thr-Arg 或 Met-Glu-Arg-Hi s-Thr-Arg ；或从 SEQ ID No :1 序列的 N 末端减少一个丝氨酸，或减少5个氨基酸序列为Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met，或减少4个氨基酸序列为 Ser-Tyr-Asp-Tyr。所述的重组缺失型人角质细胞生长因子I型，是指通过基因工程重组技术，经大肠杆菌重组表达，表达后经层析分离技术获得纯度大于95%的重组缺失型人角质细胞生长因子 I 型(A23hKGF)。为了实现本发明的目的，本发明提供了 A23hKGF的聚乙二醇修饰制备。所述的聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(Monomethoxy Polyethylene glycolMaleimide, mPEG-MAL)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇邻二硫吡啶(MonomethoxyPolyethylene glycol Ortho-pyridyldisulfide,mPEG-OPSS)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇乙烯基砜 (Monomethoxy Polyethylene glycol Vinylsufone，mPEG-VS)活化分子，或单甲氧基聚乙二醇巯基(Monomethoxy Polyethylene glycol sulfhydryl，mPEG_SH)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺(Monomethoxy Polyethylene glycol Iodo acetamide,mPEG-IA) 活化分子，优选单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺基活化分子。聚乙二醇分子可为直链型或分枝型，分子量介于5，000-40, 000道尔顿，其中优选20，000道尔顿的直链型聚乙二醇分子和40，000道尔顿的分枝型聚乙二醇分子。所述的Δ 23hKGF的聚乙二醇修饰，是指重组制备的Δ 23hKGF蛋白浓度为 l-10mg/ml，在IO-IOOmm的磷酸盐缓冲液，pH值5. 0-8. O下，重组蛋白与聚乙二醇质量比在 1 0. 5-6 的条件与 mPEG-MAL，或 mPEG-OPSS，或 mPEG-SH，或 mPEG-IA，经 4_37°C，100r/min 搅拌反应0.5-Mhr后，调低pH终止反应。再采用层析分离技术除去未被修饰的A23hKGF 和游离PEG分子，获得纯度大于95%的聚乙二醇化重组A23hKGF的偶联物。其中优选的修饰条件为Δ 23hKGF原液用lOOmmol/L磷酸盐缓冲液，pH6. 5稀释样品至ang/mL，按 Δ 23hKGF 与 mPEG-MAL-20KD 或与 mPEG-MAL_40KD 质量比为 1 2 称取 mPEG-MAL_20KD 或 mPEG-MAL-40KD加入Δ 23hKGF溶液中，25°C，100r/min搅拌反应2hr后，用盐酸调低pH至 3. O终止反应。该制备方法经实例证明，修饰率高和修饰特异性专一，修饰后产物均一，且利于实施。本专利发明技术制备的聚乙二醇化重组缺失型人角质细胞生长因子I型 (PEG-A23KGF)，在试验动物中，经1次体内皮下注射，可有效保护由CC14引起的急性肝损伤，保护5氟尿嘧啶引起的急性小肠粘膜损伤。因此，本发明所述的重组缺失型人角质细胞生长因子I型的化学偶联物，可作为一种预防或治疗药物，或药物组合物，在有效治疗剂量下用于预防和治疗对放化疗引起的消化道粘膜损伤或溃疡性黏膜炎以及急性化学性肝损伤。至此已对本发明进行了详细的描述，通过参考下列实例，能够对本发明有更清楚地理解，所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。
图1重组Δ 23hKGF表达和纯化后的SDS-PAGE图谱，A图中1为大肠杆菌诱导前， 2为诱导后；B图中1为破菌上清，2为SP柱纯化后，3为肝素纯化后，M为蛋白质标准。图2 Δ 23hKGF的mPEG-MAL_20k修饰前后和修饰后经纯化的SDS-PAGE图谱，其中1为修饰前，2为修饰后，3为修饰后纯化的PEG-20K- Δ 23KGF, M为蛋白质标准。图3为Δ 23hKGF的mPEG-MAL_40k修饰前后和修饰后经纯化的SDS-PAGE图谱，其中1为修饰前，2为修饰后，3为修饰后纯化的PEG-20K- Δ 23KGF, M为蛋白质标准。
具体实施例方式实例1、缺失N末端23个氨基酸的人角质细胞生长因子I型(A2!3hKGF)的重组表达根据Δ 23hKGF氨基酸序列(SEQ ID No 1),设计大肠杆菌偏爱密码子的对应cDNA 序列包含5’端和3’分别设计限制性内切酶Nde I和BamH I位点(SEQ ID No :2)。委托宝生物工程(大连)有限公司全基因人工合成，并嵌入PUC18载体且命名为pUC18-A23hKGF/ DH5a 0质粒pUC18_A23hKGF DH5 α和表达载体质粒pET_3c用限制性内切酶Nde I 和BamH I双酶切，根据1 %琼脂糖电泳结果，回收pET_3c酶切后约4638bp的片段，回收pUC18- Δ 23hKGF/DH5 α酶切后约450bp的片段，将两个片段用T4连接酶进行连接，用 LA (胰蛋白胨2g，酵母提取物lg，NaCl 2g，琼脂3g，加水定溶至200mL，121°C，高压灭菌 30min,当温度降到50°C左右时加入Amp至终浓度为100ug/mL，取适量倒培养皿，凝固后即成LA琼脂平板)平板筛选重组子，Nde I和BamH I双酶切鉴定，阳性克隆。正确质粒命名为 pET-3c- Δ 23hKGF。再将质粒 pET_3c_ Δ 23hKGF 转化 BL21 (DE3) plysS 宿主菌中，筛选正确表达的工程菌命名pET-3c-A23hKGF/BL21(DE;3)plySS。用于表达的载体和宿主菌菌购于 Novagen公司，Nde I和BamH I酶购于宝生物工程(大连)有限公司。将上述表达最佳工程菌株划线接种于LA琼脂平板，37°C培养过夜。从过夜培养的 LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl IOg,加水定溶至1000mL，121°C，高压灭菌30min即可)试管中，37°C培养12小时，然后按的比例转接到含200mL LB培养液的IOOOmL三角瓶中，37°C培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5%的比例接种于含20L M9YT培养液的30L发酵罐中，37°C培养，整过发酵过程中，通过调节转速、空气量、纯氧量来保持溶氧在30%以上，用观％的氨水调节pH并保持在 7. 0。至菌液0D600 = 10 14时，加入终浓度为0. lmmol/L的IPTG，28°C继续培养6小时后停止发酵(图1A)，收集菌液，SOOOrpm离心10分钟，弃上清，收集菌体放入_20°C冰箱保存备用。实例2、Δ 23hKGF的纯化制备从_20°C冰箱中取出菌体，按1 15w/v放入细菌裂解液(50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/LEDTA, 10 μ g/mlDNase, 2mm MgCl2, pH 8.5-9.0)中，37°C下搅拌待破菌液不粘稠时加入终浓度0. IM的柠檬酸三钠，继续搅拌0.证。调节pH为7. 5，IOOOOrpm离心，15min, 收集上清。上清液上SP-S印harose Fast Flow柱(平衡液50mmpb，ρΗ7· 5)，复平衡，用 50-500mmNacl线性梯度洗脱，收集洗脱峰，经SDS-PAGE检测，确定含主要目的蛋白的洗脱峰。SP洗脱的目的样品上H印arin柱(平衡液20_ pb，pH7. 5)，复平衡，用50_500mm Nacl 线性梯度洗脱，收集洗脱峰，经SDS-PAGE和HPLC检测，获得纯度大于95%的A23hKGF(图 1B)。实例3、Δ 23hKGF 的 mPEG-MAL_20K 修饰及修饰后(PEG-20K- Δ 23KGF)的纯化
纯度大于95 %的Δ 23hKGF溶液用lOOmmol/L磷酸盐缓冲液，pH6. 5，稀释样品至ang/mL，按A23hKGF与mPEG-MAL_20KD (直链型，购于北京健凯科技有限公司)质量比为1 2称取mPEG-MAL-20KD加入A23hKGF溶液中，25°C，100r/min搅拌反应》ir，用盐酸调低PH终止反应。修饰后的A23hKGF(PEG-20K-A23KGF)溶液透析过夜(透析液 20mmNaAc, ρΗ5· 0)，透析后的 PEG-20K- Δ 23KGF 溶液上 SP-S印harose Fast Flow 柱(平衡液20mmNaAc，pH5. 0)，复平衡，用50_500mm Nacl线性梯度洗脱，收集洗脱峰，经SDS-PAGE 和HPLC检测，获得纯度大于95 %的PEG-20K- Δ 23KGF (图2)。实例4、Δ 23hKGF 的 mPEG-MAL_40K 修饰及修饰后(PEG-40K- Δ 23KGF)的纯化纯度大于95%的A23hKGF溶液用lOOmmol/L磷酸盐缓冲液，pH6. 5，稀释样品至 2mg/mL,按 Δ 23hKGF 与 mPEG-MAL_40KD (分枝型)质量比为 1 2 称取 mPEG-MAL_40KD 加入A23hKGF溶液中，25°C，100r/min搅拌反应2hr后，用盐酸调低pH至3.0终止反应。修饰后的Δ 23hKGF(PEG-40K-A 23KGF)溶液透析过夜(透析液20mmNaAc，pH5. 0)，透析后的 PEG-40K- Δ 23KGF 溶液上 SP-S印harose Fast Flow 柱(平衡液20mmNaAc，ρΗ5· 0)，复平衡，用50-500mm Nacl线性梯度洗脱，收集洗脱峰，经SDS-PAGE和HPLC检测，获得纯度大于 95 % 的 PEG-40K- Δ 23KGF (图 3)。实例 5、Δ 23hKGF、PEG-20K- Δ 23KGF 和 PEG-40K- Δ 23KGF 的体外活性检测样品Δ 23hKGF, PEG-20K-Δ 23KGF 和 PEG-40K-Δ 23KGF 分别用含 0. 5%胎牛血清的1640培养基稀释至1 μ g/ml，再按1 4梯度稀释7个浓度。将NBL-7细胞每孔3 X IO3 接种于96孔细胞培养板，置于37°C，5% CO2条件下培养过夜，吸净上清后复孔加入以上配制的不同稀释浓度的样品。置于二氧化碳培养箱继续培养72h，每孔加入MTT 10μ1染色， 再培养4 Mi后弃掉培养液，加入100 μ 1的DMS0，振荡混勻后在570nm波长下测定各孔吸光度OD值。根据KGF-I的国际活性标准品(来源于NIBSC)计算PEG修饰前后的Δ 23hKGF 的体外生物比活性(IU/mg)。结果
权利要求
1.本发明是对重组缺失型人角质细胞生长因子I型的半胱氨酸的游离巯基的聚乙二醇分子化学修饰而成的偶联物。
2.权利要求1所述的重组缺失型人角质细胞生长因子I型，指天然含163个氨基酸组成的人角质细胞生长因子I型在氨基末端缺失23个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID No=I0 同时包含在SEQ ID No 1序列的基础上氨基末端增加或减少1-5个氨基酸的变异体。
3.权利要求1所述的重组缺失型人角质细胞生长因子I型的半胱氨酸的游离巯基，指位于氨基酸序列SEQ ID No 1中的第17位氨基酸。
4.权利要求1所述的聚乙二醇分子，其特征在于，聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(Monomethoxy Polyethylene glycol Maleimide，mPEG-MAL)活化分子，或为单甲 ￠1 ^二酉享令P二？！^口比 (Monomethoxy Polyethylene glycolOrtho-pyridyldisulfide, mPEG-OPSS)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇乙烯基砜(Monomethoxy Polyethylene glycol Vinylsufone, mPEG-VS)活化分子，或单甲氧基聚乙二醇巯基(Monomethoxy Polyethylene glycol suIfhydry 1，mPEG-SH)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺(Monomethoxy Polyethylene glycol Iodo acetamide,mPEG_IA)活化分子，优选单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺活化分子。
5.权利要求1、4任一项所述聚乙二醇分子，其特征在于聚二醇分子可为直链型或分枝型；
6.权利要求1、4、5任一项所述聚乙二醇分子，其特征在于聚乙二醇分子分子量为 5，000-40, 000道尔顿，其中优选20，000道尔顿的直链型聚乙二醇分子和40，000道尔顿的分枝型聚乙二醇分子。
7.根据权利要求1所述的偶联物可作为一种预防和治疗性药物，其特征在于，所述药物为治疗有效剂量的聚乙二醇化重组重组缺失型人角质细胞生长因子I型的蛋白。
8.权利要求7所述作为预防和治疗药物的偶联物，可用于预防和治疗放化疗引起的消化道粘膜损伤、急性化学性肝损伤或溃疡性黏膜炎的临床治疗。
全文摘要
本发明公开了应用聚乙二醇分子对重组缺失型人角质细胞生长因子I型的化学修饰而成的偶联物。其特征是以分子量为5K-40K的活化聚乙二醇分子与N末端缺失23位氨基酸的重组人角质细胞生长因子I型(Δ23KGF-I)的第17位半胱氨酸的游离巯基共价化学偶联，再经柱层析分离纯化制备的聚乙二醇角质细胞生长因子。该偶联物在保留人角质细胞生长因子的生物学作用下，改变了其体内的代谢动力学特性，对放化疗引起的消化道粘膜损伤或溃疡性黏膜炎，急性化学性肝损伤有预防和治疗价值。
文档编号A61P1/00GK102260342SQ201010184240
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者张增涛, 李傲, 范开, 陈勇, 陈海容, 陈清 申请人:重庆富进生物医药有限公司