专利名称：花药绒毡层特异表达启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻β -1,3-葡聚糖苷酶基因Osgl 基因启动子的分离鉴定和应用。该启动子被命名为OSGP (即Osgll^omoter)，是花药绒毡层 特异表达启动子。将其应用于研究基因在花药绒毡层的表达。特别是将其用于构建特定的 表达载体，使特定的基因在花药绒毡层特异表达，达到创造基因工程雄性不育系和恢复系 的目的。
背景技术：
水稻是模式植物，也是世界上最重要的两大粮食作物之一。水稻营养价值高，我国 有60%以上的人口，亚洲有4/5以上的人口以稻米为主食。随着我国人口的不断增加，人均 土地不断减少，如何保证中国的粮食安全已成为当前水稻生产中的热点难点问题。利用水 稻的杂种优势，培育高产、抗病良种水稻是解决这一问题的主要途径。水稻杂种优势研究始于上世纪60年代。袁隆平率先在我国开展水稻雌性不育研 究，并提出通过选育雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢复系的三系法途径来利用 水稻的杂种优势。花药和花粉特异性表达的基因及其调控序列的研究是利用基因工程创造 植物雄性不育系和恢复系的基础。至今植物雄性不育的研究广泛应用于基因工程育种，对 花药特异性表达基因调控序列的研究，已经取得很大的进展。在烟草中克隆得到的TA^基 因启动子中的TGAAATCA及ACTAAGTC两调控元件决定了该基因在花药绒毡层特异表达。拟 南芥中分离得到的A9基因的启动子只在花药绒毡层中起作用。玉米花粉特异性基因加13 启动子中QELEMENTZMZM13序列可以增强该基因在花粉中的特异表达。水稻花药特异启动 子0sg6B含有两个花药特异表达相关的顺式作用元件GTGANTG10和P0LLEmLELAT52。这些 启动子主要应用于构建特定的表达载体，使特定的基因在花药绒毡层特异表达，创造基因 工程雄性不育系和恢复系。本发明是鉴定了一个水稻β-1，3-葡聚糖苷酶基因Osgl的启动子。该启动子具 有花药绒毡层表达的特异性。通过启动子活性分析，将该启动子用于使特定的基因在花药 绒毡层特异表达，创造基因工程雄性不育系和恢复系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有花药绒毡层表达特异性的植物内源启动子及其 应用。本发明启动子来源于粳稻合江19的基因组。通过分离和研究水稻β-1，3_葡聚 糖苷酶基因(Osgl)的启动子(0SGP，即Osgl Promoter)，经研究发现，该启动子具有花药绒 毡层特异性。本发明启动子的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，序列全长1000bp。根据植物顺 式调控元件数据库(PLACE)的搜索，本发明所提供的启动子区域含有多个组织特异性顺式 作用元件(如图1所示)。其中在50-54，532-536，711-715，820-824，829-833位碱基含有花粉表达相关的应答元件GTGANTG10，在365-370，417-422，435-440，893-898位碱基含有 花粉特异表达相关的顺式作用元件P0LLEmLELAT52，在110-116碱基位含有花粉表达特异 的增强元件QELEMENTZMZM13。本发明技术人员应当理解根据SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，对其替换、缺失 或增加一个或几个核苷酸，获得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在非应答原件或作用原 件，替换一个或几个碱基。本领域技术人员还可以根据SEQ ID No. 1的序列获得具有控制 基因花药绒毡层特异表达的DNA功能片段。因此，本发明所述的启动子还包括SEQ ID No. 1 所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，如，缺失44位后的CTC核苷酸， 或在133位插入GT核苷酸，或将645位的T去掉且具有相同功能的核苷酸序列；以及由SEQ ID No. 1产生的具有控制基因花药绒毡层特异表达的DNA功能片段。这种功能片段可以是 能够控制基因在水稻花药绒毡层特异表达的DNA片段。本领域技术人员可以将本发明启动子用于构建组织特异表达的表达载体。此外还 可以将目的基因可操作地连接到本发明的启动子之下，构建得到表达盒，进一步可将该表 达盒导入植物表达载体，获得组织特异表达的重组表达载体。因此，本发明还包括由上述启 动子构建的表达盒，以及含有上述表达载体或表达盒的表达载体或重组载体。本发明启动子可以用于制备转基因植物。比如，通过农杆菌介导、基因枪法以及花 粉管通道等方式获得转基因植物。从而可以通过引入抗虫、抗病等基因，培育出抗虫、抗病 植物，提高植物抗虫和/或抗病活性。本发明的启动子可用于制备本领域公知的转基因植 物，用于控制外源或内源基因在植物花器官，优选在花药的绒毡层中的特异表达，优选的植 物为水稻、小麦、玉米等单子叶植物，最优选为水稻。本发明的启动子还可以应用于基因工程培育雄性不育系和恢复系，特别适于应用 于基因工程培育水稻雄性不育系和恢复系。在本发明实施例中，利用所述启动子OSGP构建植物表达载体，通过农杆菌介导的 遗传转化方法将所述载体转化水稻品种，可以在植物的花药绒毡层观察到报告基因GUS的 表达，表明本发明提供的启动子OSGP可以控制基因在植物的花药绒毡层中进行表达。本发明的优点和效果1.本发明的启动子为花药绒毡层特异表达，可以用于基因在花药绒毡层特异表达 的研究。2.本发明的启动子为花药绒毡层特异表达，可以用于创造植物雄性不育系和恢复 系。
图1为启动子OSGP的序列，下划线显示的碱基表示的是花粉特异相关的应答元件 GTGANTG10, P0LLEN1LELAT52 用方框显示，QELEMENTZMZM13 用圆角矩形显示。图2为定量PCR检测OSGP所控制的Osgl在水稻不同部位的表达量。图3为表达载体pCAMBIA1381z-0SGP的物理图谱，该载体含有潮霉素抗性筛选基 因，启动子被融合到GUS基因5’端非翻译区。图4为转化启动子OSGP的水稻的⑶S活性检测，图A、B、C分别为水稻减数分裂末 期，小孢子早期，小孢子中期的花药；图D、E、F分别为减数分裂末期，小孢子早期，小孢子中期的花药横切面，图中蓝色为⑶S在水稻花药绒毡层特异表达。标尺长度为100 μ m。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1 启动子的分离和鉴定发明人选取水稻β-1，3-葡聚糖苷酶基因Osgl的转录起始位点上游11Λ的范围 作为候选启动子区域进行PCR扩增。设计引物:F(GCTCTAGAGTCGACGAATAATGCCTTC) (SEQ ID No 2)和 R (CGGGATCCGAAGGAGATCCTTTGTCCCATA) (SEQ ID No. 3)，下划线表示添加的限制性 酶切位点。首先利用引物以粳稻合江19的基因组DNA(CTAB法抽提，Zhang QF等，1992， Genetic diversity and differentiation of indica and japonica rice detected by RFLP anaysis. Theor. App 1. Genet. 83，495-499)为模板进行扩增，反应条件是94°C 2min ； 94°C 15sec，58°C 30sec，72°C 2min，30 个循环；72°C 5min)。PCR 产物回收后连入 pGEM-T 载 体上，连接反应PCR 产物 1 μ l，pGEM-T 0. 5μ 1, IU T41igase, 5Xbuffer 2口1，总10口1体 积，4°C连接过夜；连接产物与大肠杆菌DHlOB混勻，42°C热激90s，加400 μ 1 LB，复苏45分 钟，取200 μ 1涂于含氨苄霉素的LA平板，37°C，过夜。筛选阳性克隆并测序。结果证实扩 增序列为预期的启动子序列。将该序列输入PLACE数据库，即给出了该启动子包含多个花 粉特异性相关应答顺式作用元件(图1)。结果表明，在水稻Osgl的启动子区域有花粉特异 相关的应答元件 GTGANTG10、P0LLEN1LELAT5 和 QELEMENTZMZM13。GTGANTG10 基序在 Osgl 的启动子区域有7个重复。P0LLEmLELAT52在Osgl的启动子区域有4个重复。实施例2 =Osgl基因在水稻中的表达以水稻品种合江19为材料，取其种子、根、叶、叶鞘以及不同时期的花药。用 Invitrogen 白勺 TRIzol M 总 RNA, # M Fermentas 白勺 RevertAid first strand cDNA synthesis kit反转合成cDNA第一链。用ABI PRISM 7300对不同时间处理的材料的Osgl 进行PCR检测。PCR的IOul反应体系加入了 0. 15ul的EvrGreen，反应条件是94°C 2min ； 94°C 5sec，58°C 10sec，72°C 10sec，40个循环。以萌发种子的Osgl的表达量为1，对水稻 其他部位的Osgl的表达量进行相对定量的计算(Lagarde D等，1996，Tissue-specific expression of Arabidopsis AKTl gene is consistent with a role inK+nutrition. Plant J. 9，195-20；3)。相对定量结果显示，Osgl的表达量在减数分裂后期、小孢子早期的 表达量较高(图2)。实施例3 启动子表达活性鉴定本发明的实施方案就是构建启动子的GUS基因表达载体并转化到水稻品种合江 19，⑶S显色及组织切片观察该启动子的组织特异表达活性。具体操作如下首先将实施例1中获得的含启动子的T载体扩大培养，抽提质粒，用)(ba I和BamH I酶切，反应体系总体积20 μ 1 含启动子的T载体约5 μ 1 (1 μ g)、1 X反应缓冲液、XbaI 和BamHI各0. 5U，混勻后37°C酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳回收所需片段。pCAMBIA1381z载体酶切体系同上，试剂盒纯化回收载体片段。将启动子片段连入pCAMBIA1381z载 体，连接反应回收产物 1 μ 1，pCAMBIA1381z 0. 5μ 1, IU T41igase, IOXbuffer 1 μ 1, 总10 μ 1体积，4 °C连接过夜，构建成pCAMBIA1381z-0SGP (图3)。通过酶切验证阳性 克隆后电转农杆菌EHA105。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，1994， Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal 6 :271-282) ^ pCAMBIA1381z-0SGP载体导入水稻品种。将获得的转基因阳性植株不同时期花药分别进行GUS活性染色(Lagarde D等， 1996, Tissue-specific expression of Arabidopsis AKTl gene is consistent with a role in K+nutrition. Plant J. 9，195-203)。染色后材料在体视镜观察拍照后，用FAA固定， 切片后在显微镜下观察(Hao PY等，2008Herbivore-induced callose deposition on the sieve plates of rice :an important mechanism for host resistance. Plant Physiol 146 :1810-1820)。观察结果表明，主要在水稻花粉绒毡层显示为蓝色(图4)。表明OSGP为花药绒毡 层特异性表达的启动子。
权利要求
1.一种水稻β-1，3-葡聚糖苷酶基因Osgl的启动子0SGP，其为1)SEQID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，且具有相同 功能的核苷酸序列；或3)由SEQID No. 1产生的具有控制基因在花药绒毡层特异表达的DNA功能片段。
2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述DNA功能片段为包含花粉特异相关的 应答元件GTGANTG10、P0LLEN1LELAT5和QELEMENTZMZM13的用以控制基因在水稻花药绒毡 层特异表达的DNA片段。
3.含有权利要求1或2所述启动子构建的表达盒。
4.含有权利要求1或2所述启动子的植物表达载体。
5.如权利要求4所述的表达载体，其为pCAMBIA1381z-0SGP。
6.权利要求1或2所述的启动子OSGP制备转基因植物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。
8.权利要求1或2所述的启动子OSGP在基因工程培育雄性不育系和恢复系中的应用。
9.权利要求1或2所述的启动子OSGP在基因工程培育水稻雄性不育系和恢复系中的 应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。从水稻(Oryza Sativa L.)中分离并克隆了一种水稻β-1，3-葡聚糖苷酶基因Osg1的启动子(OSGP，即Osg1Promoter)，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，控制该基因在水稻花药绒毡层特异表达。启动子含有GTGANTG10、POLLEN1LELAT52及QELEMENTZMZM13等顺式作用元件。本发明克隆的启动子可以作为花药绒毡层特异性表达的启动子使用。
文档编号A01H5/00GK102146404SQ20101062031
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者万凌琳, 何光存, 杜波, 祝莉莉, 闸雯俊 申请人:武汉大学