调节开花时间的核苷酸序列的用途，表达它的植物以及其生产方法

专利名称：调节开花时间的核苷酸序列的用途，表达它的植物以及其生产方法
调节开花时间的核苷 酸序列的用途，表达它的植物以及其 生产方法本发明涉及编码单细胞绿藻，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的氨基酸序列的核苷酸序列，其在来自有花植物的植物细胞中表达。序列的表达被用于改变包含转染的植物细胞的植物的开花时间。此外，本发明涉及生产本发明的细胞和/或植物的方法。
现有技术花转变(floral transition)是植物的关键发育过程，因为它们繁殖的时间决定了个体和它的后代的成就。为了触发花转变，植物必需协调对各种外部和内部信号的应答，以能够诱导一些基因的表达，这些基因诱导顶端分生组织从营养性到生殖性的转变(Baurleet al. ,2006. Cell 125:655-664)。在转录和翻译后水平上 CONSTANS(CO) 的控制对于光周期性是关键的，这是调节花转变的最保守的途径之一(Kobayashi and ffeigel. 2007. Genes Dev.21 :2371_2384)。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中CO的转录作用受到昼夜节律钟和光周期的控制，与冬季的短日照下相比，在夏季的长日照的白天，其诱导更丰富的CO的信使 RNA(Su0rez-L0pez et al. ,2001. Nature 410:116-1120)。CO 转录产物水平的这些季节和昼夜节律受到遗传途径的调节，所述遗传途径包括基因GIGANTEA、FLAVIN-BINDING、 KELCHREPEAT、F-BOX 1 禾口 CYCLIN DOF FACTOR 1 (Sawa et al. ,2007. Science 318 261-265)。CO的白天的积累受到光的影响，处在光色素系统的控制下(Valverde et al., 2004. Science 303 1003-1006)，在夜间通过泛素连接酶CONSTITUTIVE PH0T0M0RPH0GENIC I(COPl)的方式由蛋白酶体所降解，COPl是幼苗的光形态发育的关键调节物(Jang et al., 2008. EMBO Τ. 27 1277-1288)。CO的降解的这些白天和黑夜的循环，与CO的信使RNA的昼夜节律和季节调节一起，意味着CO在长日照的夜间期间被活化。活性的CO产生叶的韧皮部中花整合基因(floral integrators)FT的表达，蛋白质FT从叶移动到顶端分生组织(Corbesier et al. ,2007. Science 316:1030-1033)。一旦处于顶端分生组织中， FT 与转录因子 FD —起，诱导花整合基因 APETALA1、SUPPRESSOR OF 0VEREXPRESS0R OF CONSTANS 1 (S0C1)、LEAFY、以及可能的控制花器官发育的花同源异型基因的表达。CO-FT模式广泛分布在显花植物和裸子植物中，构成了开花诱导中最保守的调节元件之一(B0hlenius et al. ,2006. Science 312 =1040-1043) 在所有陆地植物中，包括苔藓小立碗藓属(Physcomitrella) (Zobell et al. ,2005. Plant Biol. 7 :266_275)和石松植物卷柏(Selaginella)(本工作)，存在着与CO同源的基因(C0-样基因或C0L)，但是它们不在细菌、真菌和动物中存在(Robson et al. ,2001. Plant Τ. 28 :619_631)。然而，除了高等植物的某些基因例如水稻中的HEADING DATE 1 (HDl)、牵牛花(Pharbitis nil)中的 (PnCO)或近年来甜菜中的那个(BvCOLl)之外，植物的进化路线的COL基因没有能够补足拟南芥的C0突变体并因而显示植物到花期的转变中的功能。拟南芥的蛋白质COLl与CO具有85%的相似性百分比，不具有与CO相同的功能，因为它不能补足C0突变体(Ledger et al. ,2001. Plant Τ. 26 15-22)。以前试图证明在苔藓小立碗藓中存在CO的真实直系同源物已经失败了(Zobell et al. , 2005. Plant Biol. 7 266~275)。莱茵衣藻是单细胞的绿藻，由于它易于转化、健壮的遗传学性、代谢多面性和其单倍体的基因组，被用作模式生物体，近年来发布了它的完整序列(Merchant et al. ,2007. Science 318:245-251)。某些过程，例如趋光性、同步生长和淀粉的积累受到衣藻中的昼夜节律钟的调节(Mittag et al. , 2005. Plant Physiol. 137 399~409)。在这种和其他绿微藻中，生长在一定光周期下与细胞周期同步，从而培养物群体的大部分在给定的时刻将由同一分裂期的细胞构成(Bizova et al. , 2005. Plant Physiol. 137 475~491)。已知衣藻(roc66)的突变体展现了相比野生型藻类在它的生长节律中稍微更宽的周期(Matsuo et al. ,2008. Genes Dev. 22 :918_930)。然而，已经证明的是，昼夜节律钟允许在衣藻中进入细胞周期(Goto and Johnson, 1995. Τ. Cell Biol. 129 1061~1069),以及光周期对这种信号以及在另一种微藻Ostreococcus tauri中细胞周期的进展中也具有巨大影响(Moulager et al.，2007. Plant Physiol. 144 1360-1369)。将果实的生产提前可以呈现商业上的优势。遗传学工具的研究使得将开花提前到尽可能靠近生长周期内的特定时间成为可能，因而果实的采集符合最合适的市场期，意味着试验作物的生产中的增产。本发明的说明本发明涉及编码单细胞绿藻莱茵衣藻的氨基酸序列的核苷酸序列，其被转染到来自有花植物的植物细胞中。基因表达被用于改变包含所述序列的植物细胞的植物的开花时间。序列SEQ ID NO 1与拟南芥的蛋白质CONSTANS(CO)的氨基酸序列具有27%的同一性，与来自植物的其他COL蛋白的同一性在20到30%之间。这种低同一性没有预先提示与上述蛋白质的功能相关的可能的用途，特别是要记住，蛋白质例如属于拟南芥的同一基因组的COLl与蛋白质CO具有85%的同一性，但仍不行使与CO相同的功能，因为看起来它不能补足CO突变体的拟南芥植物(Co植物)中这种蛋白质的功能。因而，考虑到上述的低同一性百分比，不能推断的是SEQ ID NO :1在功能上是与 CO可比较的，而事实证明，它可以补足C0突变体，并且甚至促进拟南芥中的早开花。进行补足和开花提前诱导的实验所使用的植物，拟南芥，已经在许多生物技术过程中被用作模式植物，证明获得的结果可以推广到任何其他植物品种，特别是在植物界中保守的过程，如同通过蛋白质CO的方式调节开花的情况一样。这种植物的转化已经被用作实例，因为转化和监视重组基因表达的技术已经被优化。在本发明中获得的结果不应当引起事后回溯的分析，因为根据SEQ IDNO 1与CO 的27%的同一性百分比，我们不会预计到暗示SEQ ID NO :1用于加快任何植物开花的可能用途的结果，因为只有通过在植物的基因组中进行该序列的转化我们才能验证它对开花的影响。最后，基因的同一性不会使得SEQ ID NO :1的功能显而易见。本发明的序列SEQ ID NO 1的用途在其果实具有商业价值的各种植物中的应用， 可以产生开花的实质上的提前，结果可以提前果实的生产，提供相比不包含本发明的蛋白质的植物产生的果实商业上的优势。此外，在植物培育中刺激开花的提前在原理上将使得尝试将开花尽可能紧密地拉近到生长周期的特定时间内成为可能，从而随后的果实收获符合给定的地理区域中最合适的市场期。通常，这反映在被测试的作物的生产方面产量的提高中。 在这一点上，本发明的第一个方面是包含一核苷酸序列的分离的核酸用于控制植物的开花时间的用途，所述核苷酸序列编码与序列SEQ IDNO 1具有至少90%同一性的氨
基酸序列。序列SEQ ID NO :1是由单细胞藻类莱茵衣藻的基因组中存在的核苷酸序列编码的氨基酸序列。所述分离的核酸包含至少一个核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO 1具有至少90%同一性的序列或编码SEQ ID NO :1。在本发明的这些方面中，所述分离的核酸可以是编码核苷酸序列(cDNA)，如同在SEQ ID NO 14的情况下，或是有或者没有内含子的核苷酸序列，因而包括了编码SEQ ID NO :1的基因组DNA的序列(在下文中，所述核苷酸序列将被称为当前发明或本发明的核苷酸序列)。也就是说，它们包括这样的核酸序列，其转录产物、信使RNA(mRNA)编码相同氨基酸序列(在下文中，当前发明的氨基酸序列或本发明的氨基酸序列)。来自于本发明的核苷酸序列的变体序列，其产物是与序列SEQ ID NO :1编码的蛋白质具有相同功能的蛋白质，也被包括在内。在它们的N-末端、C-末端和/或在某些内部氨基酸位置上具有修饰的氨基酸序列，从而蛋白质的功能与本发明的核苷酸序列转录的mRNA序列的翻译产物是相同的，也被包括在内。氨基酸序列可以由任何核苷酸序列编码所述核苷酸序列产生本发明的任何氨基酸序列。由于遗传密码是简并的，一个和相同的氨基酸可以由不同的密码子(三联体)编码，因而相同的氨基酸序列可以由不同的核苷酸序列编码。与SEQ ID NO :1具有至少90%同一性的氨基酸序列是其他生物体或单细胞藻类的同源序列，其中它们编码的蛋白质具有与所述基因编码的蛋白质相同的功能。同源序列是指来自不同的物种、具有源自共同祖先序列的相似表型表达的序列。在序列同源性内，在两种类型的同源性直系同源和旁系同源之间产生区别。直系同源的序列属于具有共同祖先的物种。旁系同源序列是在同一生物体中出现的那些，一种来自另一种的副本。本发明的这个方面中，与氨基酸序列SEQ ID NO :1具有至少90%同一性的所有同源的序列都被考虑，包括直系同源和旁系同源。类似地，其转录产物与本发明的氨基酸序列相同的所有的序列都被包括。优选的实施方式是包含核苷酸序列的分离的核酸的用途，所述核苷酸序列编码与序列SEQ ID NO 1具有至少50%同一性的绿藻的氨基酸序列。来自莱茵衣藻的序列SEQ ID NO 1与其他绿藻，例如，但不限于团藻(Volvox)的氨基酸序列的同一性是约60%，因而本发明的这个实施方式包括包含核苷酸序列的任何分离的核酸，所述核苷酸序列编码具有与序列SEQ ID NO :1至少50%同一性、来自绿藻的氨基酸序列。本发明的另一个优选的实施方式是包含核苷酸序列的分离的核酸用于调节植物的开花时间的用途，所述核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ IDNO :1。如本发明的实施例部分中描述的，相对于不含有序列SEQ ID NO :1的对照植物的开花，用编码本发明的氨基酸序列的核苷酸序列转化的模式植物拟南芥的开花可以被提前。因而，序列SEQ ID NO :1调节植物的开花时间。术语“调节开花时间”是指改变营养顶端分生组织向花分生组织转化发生的时刻，即，开花的时刻。优选的，本发明的核酸序列被用于提前植物的开花时间。
本发明的另一个方面是包含根据任一前述方面的核酸的表达载体(在下文中，本发明的载体)用于调节植物的开花时间的用途。术语“载体”是指具有在具体宿主中复制的能力的DNA片段，如该术语表明的，可以充当用于扩增与之融合的其他DNA片段(插入物)的运载体。“插入物”是指与载体融合的DNA片段；对于本发明来说，载体可以包含与之融合的任何根据前述方面所描述的序列， 可以在合适的宿主中复制。载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，不排除符合上述载体定义的其他类型的载体。再一个方面是用本发明的载体转染的细胞(在下文中，本发明的细胞)用于调节植物的开花时间的用途，所述载体包含编码氨基酸序列SEQ IDNO 1的核苷酸序列。在本发明的意义上术语“细胞”是指原核或真核细胞。细胞可以是能够复制转化的外源DNA的细菌，例如，物种大肠杆菌(Escherichia coli)的任何菌株，或能够将感兴趣的DNA转移到植物中的细菌，例如，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。优选的， 细胞是指真核的植物细胞，在这一组中，更优选的，是指属于植物界的那些细胞。因而，在细胞是植物细胞的情况下，术语细胞包括实质细胞、分生组织细胞或任何类型细胞的至少一种细胞，为分化或未分化的。此外，这个定义还包括原生质体(缺少细胞壁的植物细胞)。术语“转染”是指通过质粒、病毒载体(在这种情况下，这也称为转导)或其他用于转移的工具的方式，将外部的遗传材料导入细胞内。术语转化优选地用于描述遗传材料向细菌中和非动物真核细胞例如真菌、藻类或植物中的非病毒的转移。优选的实施方式是本发明的细胞的用途，所述细胞包含编码氨基酸序列SEQ ID NO 1的分离的核酸的任何表达产物。术语“表达产物”在本发明的意义上是指产自根据任何前述方面的核苷酸序列的表达的任何产物。因而，“产自序列的表达的产物”是指，例如，获自序列的转录作用的RNA、 加工的RNA、产自细胞内RNA的翻译或随后的核苷酸序列的修饰的蛋白质，条件是产生的序列来源于转移的原始序列。另一个优选的实施方式是根据任何前述方面或实施方式的用途，其中分离的核酸与基因表达调节序列功能性组合。本发明的核酸通过它的3'末端与基因表达调节序列连接。在本发明中，术语“基因表达调节序列”是指一种核酸序列，其在DNA序列的转录开始时、RNA序列或其他未描述的序列的翻译开始时对所提及的本发明的核酸序列的功能具有影响。举例来说，本发明中考虑的基因表达调节序列包括启动子及其他较不常见的，例如，某些内含子。根据优选的实施方式，基因表达调节序列是SEQ ID NO 2或SEQ IDNO :3。序列SEQ ID NO :2是指启动子CaMV 35S的序列，其在植物的任何组织中产生在它之后的基因的组成型表达。序列SEQ ID NO :3是指SUC2基因的基因表达调节序列的部分， 其编码蔗糖-转运蛋白。这个序列引起在前的基因在韧皮部维管组织的伴随细胞或伴细胞中的表达。根据另一个优选的实施方式，根据任何前述方面或实施方式提及的调节开花的植物属于拟南芥物种。根据另一个优选的实施方式，植物属于番茄(Solanum lycopersicum) 物种。本发明的另一个方面是用包含核苷酸序列的分离的核酸转染的分离的细胞，所述核苷酸序列编码与序列SEQ ID NO :1具有至少90%同一性的氨基酸序列。术语“转染”是指通过质粒、病毒载体(在这种情况下，这也称为转导)或其他用于转移的工具的方式，将外部的遗传材料导入细胞内。术语非病毒方法的转染用于提及哺乳动物真核细胞，而术语转化优选地用于描述遗传材料向细菌和非动物真核细胞例如真菌、 藻类或植物中的非病毒的转移。对本发明来说，术语转染等价于术语转化。根据优选的实施方式，细胞包含绿藻的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与序列 SEQ ID NO :1具有至少50%同一性的氨基酸序列。另一个优选的实施方式是用分离的核酸转染的分离的细胞，所述分离的核酸包含编码氨基酸序列SEQ ID NO 1的核苷酸序列。前述的细胞在下文中将被称为本发明的细胞或当前发明的细胞。术语“分离的细胞”是指获自任何类型的微生物学的培养物(例如，但不限于，大肠杆菌(E. coli)或根癌土壤杆菌)或植物组织的细胞。优选的，细胞是来自有花植物的真核细胞。因而，术语细胞包括实质细胞、分生组织细胞或任何类型的细胞，分化的或未分化的，的至少一种细胞。此外，这个定义还包括原生质体(缺少细胞壁的植物细胞)。植物细胞稳定地或短暂地包含序列SEQ ID NO :1。本发明的又一个方面是包含本发明的细胞的植物。根据优选的实施方式，植物属于拟南芥物种。根据另一个优选的实施方式，植物属于番茄物种。在下文中，我们将通过术语“本发明的植物”或“当前发明的植物”来提及这些植物。术语“植物”涵盖其每个部分，其可以以分离的形式或组合地被保存或培养，以及种质。种质被定义为含有种内的遗传变异性的生物材料，或可以维持物种或生物体的群体的遗传材料(参见下文种子、繁殖体或子代)。植物必需以下述方式包含本发明的细胞， 即，所述细胞在特定的组织中表达(营养发育的具体时刻或取决于其发育的环境条件)或组成型地表达或异位表达(其在不同于普通的和预期的其他细胞或组织中表达)。考虑到本发明的序列编码的蛋白质令人惊讶地行使下述功能，S卩，恢复从基因组序列中除去CO基因的拟南芥植物(CO突变体)的CO基因的功能，假定本发明的序列在任何植物物种中转移和插入到合适的位置，其中获自上述序列的产物具有相同的氨基酸序列，因此产生了功能性表达这些序列的植物，该序列行使与所述植物的内在CO基因相同的功能。在这种意义上，优选的，所述植物选自以下植物的科，其包括但不限于禾本科 (Poaceae)、蝶形花禾斗(Fabaceae)、樟禾斗(Lauraceae)、藜禾斗(Chenopodiaceae)、十字花禾斗 (Brassicaceae)、葫声禾斗(Cucurbitaceae)、伞形花禾斗(Apiaceae)、爺禾斗(Solanaceae)、菊禾斗(Asteraceae)、蕃荡枝禾斗(Annonaceae)、棉树禾斗(Ebenaceae)、桑禾斗(Moraceae)、仙人掌科(Cactaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、芸香科(Rutaceae)、葡萄科(Vitaceae)、猕猴桃科 (Actinidiaceae)、凤果禾斗(Bromeliaceae)、色蕉禾斗(Musaceae)、山毛榉禾斗(Fagaceae)、桦木科(Betulaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、木犀科(Oleaceae) 或白花菜禾斗(Capparaceae)。优选的，葫芦科的植物选自，但不限于，南瓜属(Cucurbita)、黄瓜属(Cucumis)、 西瓜属(Citrullus)或葫芦属(Lagenaria)。优选的，茄科(Solanaceae)的植物选自，但不限于，茄属(Solanum)或辣椒属(Capsicum)。优选的，茄属的植物选自，但不限于，马铃薯(S. tuberosum)、番茄(S. Iycopersicum)或茄子(S. melongena)物种。更优选的，所述植物是番茄 (S. Iycopersicum)物种。优选的，辣椒属的植物选自，但不限于，C. angulosum、辣椒 (C. annuum)、C. pendulum 或 C. minimum。优选的，蔷薇科的植物选自，但不限于，蔷薇亚科(Rosoideae)、苹果亚科 (Maloideae)或梅亚禾斗(Prunoideae)。优选的，芸香科的植物选自，但不限于，柑桔属(Citrus)。更优选的植物是酸禮(C. aurantium)、C. nobilis、C. grandis、C. limetta、梓樣(C. limon)、C. medica 或 C. paradisiο本发明的植物可以含有纯合性、杂合性或半合子性的任何序列。可以通过基因枪、根癌土壤杆菌或任何允许本发明的任何序列整合到植物DNA中的其他技术所介导的植物细胞遗传转化，随后进行适合于转化的植物品种的特征和要求的体外再生，来获得本发明的植物，所述植物DNA是基因组的、叶绿体的或线粒体的。此外，植物还可以通过杂交，即，利用本发明的植物的花粉来授粉任何不含本发明的任何序列的其他植物，或用不含这些序列的植物的其他花粉授粉含有本发明的任何序列的植物的雌蕊， 通过本发明的任何序列的转移来获得。获得本发明的植物的方法不仅仅限于这个段落中描述的方法。此外，以稳定的或短暂的形式包含本发明的细胞的植物也被包括在内。来自本发明中描述的任何植物的花粉、种子、繁殖体、子代或植物部分。在本发明中，花粉被认为是遗传学和表型性状的传递者，其可以通过与提及的花粉相容的任何植物品种的授粉来进行。这样，获得了包含本发明的任何序列的植物，在相应的杂交和/或选择之后，可以获得其中所述序列被稳定地整合(虽然它们也可以是短暂表达的)、并且处于适合于在后代中获得相同的期望特征的拷贝数量的植物。繁殖体是允许植物中的繁殖或无性繁殖的植物部分，通过它们，获得新的植物或个体化器官。分离的部分的组织必需回复分生组织的状况用于产生植物的整套器官。所述繁殖体选自，但不是排他地，包括匍匐枝、地下茎、块茎或球茎的列表。术语“子代”是指繁殖的结果，S卩，通过一个或多个亲本个体的介入而产生的个体或多个个体。例如，通过有性繁殖获得的植物的子代是种子，然而植物的子代可以是任何细胞，其产自任何细胞内容物、质体、细胞区室、DNA或其任何组合的融合。在细胞分裂(例如， 当体外生长时)的过程中，子代是来自分裂的细胞。本发明的另一个方面是获得本发明的细胞的方法，其包括a.将编码SEQ ID NO=I的核苷酸序列插入到载体中，b.用根据(a)项获得的载体转化细胞，和c.选择包含编码SEQ ID NO 1的核苷酸序列的根据(b)项转化的细胞。本发明的任何序列在载体中的插入可以通过构成公知常识的部分的克隆方法、通过用限制性内切酶切割序列和载体，随后连接它们，使得载体的序列整合本发明选定的序列来进行。载体在前述段落中定义。包含本发明选定的序列的载体的选择可以通过一些技术进行，例如，-通过向培养基添加抗生素选择含有本发明的载体的细胞。这些细胞对物质例如抗生素的抗性通过由载体的序列中含有的序列所编码的分子的合成来产生。-用限制性内切酶消化，通过这种方式获得在载体中插入的某些本发明的序列的片段。- 检测转化载体中存在的标记物基因，其在植物中的存在表明本发明的序列的存在。细胞获自任何类型的微生物学培养物(例如，大肠杆菌(E.coli)或根癌土壤杆菌)或植物组织。细胞的遗传转化通过构成公知常识的部分的技术来进行，例如，电穿孔、通过基因枪、根癌土壤杆菌介导的遗传转化、或允许本发明的任何序列整合到细胞的DNA中的任何技术。使用这些技术，有可能稳定地将包括本发明的任何序列的载体导入，从而，在连续的细胞分裂之后，掺入的序列仍然被表达。短暂地包含本发明的任何序列的细胞也被包括在内。用包括本发明的任何序列的载体转化的细胞可以在细胞的任何DNA中掺入所述序列核的、线粒体的和/或叶绿体的(在这种情况下，通常的是插入tDNA的序列，tDNA的序列含有本发明的任何序列以及其他序列)，或仍然作为保持了其自身的自我复制机制的载体的部分。掺入了本发明的任何序列的细胞的选择通过向给细胞供应营养物的培养基中添加抗生素来进行。这些细胞对物质例如抗生素的抗性通过由载体或载体的tDNA的序列中含有的序列所编码的分子的合成来产生。包含SEQ ID NO :1的细胞也可以通过任何其他技术来选择，所述技术允许辩别SEQ ID NO 1的存在或缺乏和/或它的表达。本发明的另一个方面是获得本发明的植物的方法，其包括a.再生至少一种植物，其来自于根据上述方法的(C)项获得的细胞，b.选择根据(d)项再生的一种或多种植物，其至少表达编码SEQ IDNO 1的核苷酸序列，以及c.选择根据(b)项获得的一种或多种植物，其展示了对照植物相比开花的提前。如果是植物细胞，选定的细胞可以经历器官发生或体细胞胚胎发生的程序，通过所述程序，通过植物激素和其他化合物的合适组合在它的去分化之后，产生完整的植物，所述植物含有它起源的原始细胞的遗传材料。此外，需要适合于每个植物品种的光线和温度的条件。植物细胞是全能性的，即，它们含有它们所属植物的遗传材料的完整拷贝，而与它们的功能或在其中的位置无关，因而具有再生完整的新植物的潜力。一旦来自选定植物细胞的植物被再生，对于编码SEQ ID NO :1的核苷酸序列或本发明的任何其他序列(启动子序列，等等)的存在和/或表达进行分析。所述方法进一步包括选择相对于对照展示了开花的提前或延迟的植物。选择优选的植物，其展示了相对于对照植物开花的提前。对照植物是不含有编码SEQ ID N0:1的本发明的序列的植物。优选的，对照植物含有载体的其余的转化DNA序列，所述载体是用于将本发明的核苷酸序列插入到所述植物细胞中的载体。对照也可以是野生型植物，它的植物材料来自于被转化之前的转化植物(其包含编码SEQ ID NO :1的核苷酸序列)，其经历了与本发明的植物相同的体外培养步骤，或不经历这些培养步骤。根据另一个优选的实施方式，编码序列SEQ ID NO=I的核苷酸序列与基因表达调节序列功能性组合。如上所述，基因表达调节序列决定了表达本发明的序列的植物组织和 /或表达它们的时刻。在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和它的变体不意图排除其他技术特征、添加物、成分或步骤。对于本领域的技术人员来说，本发明的其他目的、优点和特征部分地根据说明书以及部分地根据本发明的实际应用将变得清楚。为了说明的目的，而不是意图限制本发明，提供以下的附图和实施例。 附图的说明附


图1显示了 SEQ ID NO 1相对于植物的CO蛋白质的大的相似性。A.基因的结构根据ESTs和通过PCR扩增推导，所述PCR扩增利用模板eDNA (上方)和根据衣藻基因组数据库预测的基因组序列(下方)。B.植物的进化分枝的CO和COL蛋白质的进化关系。距树的距离根据比例画出，相同单位的分枝的长度作为用来推论出系统树的进化距离。进化关系代表1000个副本。标记了主要的结果群。星号(*)表示95%置信度的自展值。附图2显示了在35S启动子控制下的CrCO的表达。在下文中，编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列将被称为CrCO，它编码的蛋白质被称为 CrCO。在35S启动子控制下CrCO的表达补足了 co突变并且加速开花。A.在重组植物35S: :CrC0中、库co-8(Ler) (35S: :CrC0 #1)中的植物中，或库 co-10 (col-0) (35S CrCO #2)中的植物中，通过RT-PCR的CrCO的mRNA的检测。野生型植物col-0和Ler，以及co-8突变体被用作阴性对照。B.突变体植物co-8和co-10 ；col-0和35S: :CrC0 #2在长日照(LD)条件下在土壤中生长4周。植物是T3纯合子。C.在包括阳性对照(SUC2: :C0和35S: :C0)和阴性对照(co-8)的35S: CrCO植物中通过RT-PCR的FT的mRNA水平的检测。植物在长日照条件下在土壤中生长2周，在正午(ZT4)和在下午/傍晚(ZT16)收
-M-犾。D.某些35S CrCO系的表型。附图3显示了在韧皮部专性启动子之下CrCO对拟南芥的开花的作用。A.处在韧皮部特异性启动子SUC2 (SEQ ID NO 3)的控制下的CrCO的表达加速了 col-0植物中的开花。如果表达受到分生组织特异性启动子KNATI的控制，早开花不会发生。突变体co-10、野生型col-0和35S: :C0植物(在库col_0中)用作对照。B.在与A相同的植物中CrCO和FT的表达。C.在来自植物 col-0，35S: CO (col-0)和用 SUC2: CrCO 或 KNATl CrCO 转化的植物col-0的核提取物中用特异于CO的抗体对蛋白质CrCO的免疫检测。H3的检测被用作负载对照。箭头表明在植物35S: :CrC0和SUC2: :CrC0中检测的45KDa特异性条带。D.通过共焦显微镜检查洋葱表皮细胞的核中YFP = CrCO融合物的检测。
实施例以下将通过一些试验来说明本发明，所述试验描述了获得编码氨基酸序列SEQ ID NO 1的核苷酸序列，生产表达它的细胞和植物的方法，以及所述序列用于调节表达它的植物的开花时间的用途。实施例1.实验方案
1. 1来自植物和藻类的实验材料对于基因表达和蛋白质生产的分析，拟南芥植物在80%湿度和75μ E/m2光强度的受控条件下的人工气候室中在不同的光周期下生长。拟南芥植物也在补充有(w/v) 蔗糖的MS-琼脂固体培养基中在65 μ tE/m2光强度的SG-1400人工气候室(Radiber SA, Spain)中在不同的光周期下生长。莱茵衣藻野生型株21gr、细胞壁突变体CW15和转基因系在搅动的锥形容器中或在充气的圆柱形瓶子中，在控制在22 °C的培养室内在Sueoka培养基或TAP培养基中生长。对于启动子OTAl的诱导，在Sueoka-铵培养基中生长到中期指数期的藻类通过离心来采集，悬浮在Sueoka-硝酸盐培养基中，并在各种培养条件下生长。 用30 μ E/m2 (低强度)或100 μ tE/m2 (高强度)的光照条件，从LD (16 8)到SD (8 16) 的条件，使用不同的光周期。1. 2CrC0的克隆和分析(编码SEQ ID NO 1的氨基酸序列)在下文中，编码SEQ ID NO :1的氨基酸序列将被称为CrCO，它编码的蛋白质被称为 CrCO。分析来自Kazusa的DNA中心的cDNA集合的几个克隆来获得CrCO的完整0RF。四种这些 cDNA(AV628196 ；Av628285 ；AV629179 ；AV638186)的测序显示了单一的 mRNA 核苷酸序列。从CrCO推导的氨基酸序列具有410个残基和三个特征性的结构域i)参与蛋白质-蛋白质相互作用的、处在氨基末端称为b-boxes的两个锌-指结构域；ii)可能参与转录活化的中间的酸性结构域；和iii)羧基结构域CCT(CO-COL-TOCl)，已经表明它介导与DNA的相互作用，在与中央振荡器(central oscillator)功能相关植物蛋白质例如TOCl或应答的其他伪调节物中是保守的。1.3开花时间的分析通过对至少10个个体中同一杆上莲座叶和茎生叶计数，分析在LD受控条件的房间中在土地中生长的植物的开花时间。数据表示为平均值士均值标准误差(s. e. m.)。1. 4系统发生分析CO和CO-样蛋白质之间的进化关系利用从不同数据库推导出的氨基酸序列来分析，并用CLUSTALX程序来比对。这种比对被用于使用不同的系统发生指标产生各种进化树。所有这些树显示了非常相似的拓扑结构，仅显示了用最小进化的指标产生的(附图 1B)。利用最小进化(Minimum Evolution, ME)的方法计算进化关系。通过1000个副本的方式计算的共有捕集树代表了所分析的蛋白质的进化史。该树根据比例画出，与进化距离的长度相同单位的分枝的长度作为用来计算系统树。ME树使用邻接算法在追踪水平1下进行追踪。邻接算法用于产生起始树。仅在配对序列的比较中移除含有错配的缺口或数据缺失的所有位置(配对删除的选择)。总起来，在最终结果的集中存在669个位置。用MEGA4 程序进行系统发生分析。比对中使用的序列的登记号码在表1中显示。表1. COL蛋白质的登记号码
蛋白质NCBI登记号码TIGR基因的No.COQ39057At5gl5840
权利要求
1.一种包含核苷酸序列的分离的核酸用于控制植物开花时间的用途，所述核苷酸序列编码与序列SEQ ID NO 1具有至少90%同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1中要求保护的包含核苷酸序列的核酸的用途，所述核苷酸序列编码与序列SEQ ID NO 1具有至少50%同一性的绿藻的氨基酸序列。
3.权利要求1或2任一项中要求保护的核酸的用途，其特征在于所述核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO =I0
4.一种表达载体的用途，所述表达载体包含权利要求1到3任一项要求保护的核酸。
5.一种细胞的用途，所述细胞用权利要求4要求保护的表达载体转染。
6.权利要求5中要求保护的细胞的用途，所述细胞包含所述分离的核酸的任何表达产物。
7.权利要求1到6任一项中要求保护的用途，其特征在于所述分离的核酸与基因表达调节序列功能性组合。
8.权利要求7中要求保护的用途，其特征在于所述基因表达调节序列是SEQID NO 2 或 SEQ ID NO :3ο
9.权利要求1到8任一项中要求保护的用途，其特征在于所述植物属于物种拟南芥 (Arabidopsis thaliana)。
10.权利要求1到8任一项中要求保护的用途，其特征在于所述植物属于物种番茄 (Solanum lycopersicum)0
11.一种分离的细胞，其用包含核苷酸序列的分离的核酸转染，所述核苷酸序列编码与序列SEQ ID NO 1具有至少90%同一性的氨基酸序列。
12.权利要求11中要求保护的细胞，其包含绿藻的核苷酸序列，所述绿藻的核苷酸序列编码与序列SEQ ID NO 1具有至少50%同一性的氨基酸序列。
13.权利要求11或12的任一项中要求保护的细胞，其包含编码氨基酸序列SEQID NO 1的核苷酸序列。
14.一种包含权利要求11到13任一项中要求保护的细胞的植物。
15.权利要求14中要求保护的植物，其属于物种拟南芥(Arabidopsisthaliana)。
16.权利要求14中要求保护的植物，其属于物种番茄(Solanumlycopersicum)。
17.花粉、种子、繁殖体、子代或植物部分，其来自于权利要求14到16中要求保护的任何植物。
18.一种获得权利要求11到13任一项中要求保护的细胞的方法，其包括a.将编码SEQID NO 1的核苷酸序列插入到载体中，b.用根据(a)项获得的载体转化细胞，和c.选择根据(b)项转化的、包含编码SEQID NO 1的核苷酸序列的细胞。
19.一种获得权利要求14到16任一项中要求保护的植物的方法，其包括a.再生至少一种植物，所述植物来自于根据权利要求18的(c)项获得的细胞，b.选择根据(d)项再生的一种或多种植物，其至少表达编码SEQIDNO=I的核苷酸序列，以及c.选择根据(b)项获得的、展示了与对照植物相比开花提前的一种或多种植物。
20.权利要求18或19任一项中要求保护的方法，其特征在于编码SEQIDNO 1的核苷酸序列与基因表达调节序列功能性组合 。
全文摘要
本发明涉及编码单细胞绿藻，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhartii)的氨基酸序列的核苷酸序列，其在来自有花植物的植物细胞中表达。序列的表达被用于改变包含转染的植物细胞的植物的开花时间。此外，本发明涉及生产本发明的细胞和/或植物的方法。
文档编号A01H5/00GK102325886SQ201080008267
公开日2012年1月18日 申请日期2010年2月2日 优先权日2009年2月18日
发明者何塞·玛里亚·罗梅罗罗德里格斯, 奥雷利奥·塞拉诺德尔加多, 费德里克·巴尔韦德阿尔瓦塞特 申请人:塞维利亚大学, 科学研究高等机关