专利名称：种子油含量相关的植物基因及其使用方法
种子油含量相关的植物基因及其使用方法相关申请本申请要求于2009年12月17日提交的美国临时专利申请系列第61/287，572号和2010年4月27日提交的美国临时专利申请系列第61/328，545号的权益，在此通过引用将其内容并入本申请。背景I.发明领域本公开涉及与油产生有关的某些植物基因及利用这些基因来提高或调节植物种子中的油含量。更具体地，本公开涉及通过这些基因的受控表达来调节植物或其一部分中不同脂肪酸之间的比例。 2.相关技术描述植物油在多种应用中使用。在其种子中合成并储存大量油的植物是人和动物所消耗的油的重要来源。植物油还在许多行业同样被广泛使用，例如油漆和涂料行业。根据预期的用途，需要植物油中的不同脂肪酸组成。植物和动物油(或脂肪)几乎完全由三酰甘油(TAG)组成。三酰甘油是由脂肪酸和丙三醇形成的酷，其中脂肪酸与丙三醇的三个羟基发生酯化。植物和鱼类脂肪来源通常被认为比大多数动物的脂肪来源更健康，因为这些植物和鱼类脂肪来源通常具有更高含量的不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸的摄入量和食物来源中这些脂肪酸之间的比例与人类心血管疾病和其他慢性疾病的发病率具有一定的因果关系。综述见Simopoulos，AP, Exp BiolMed (Maywood)，233 (6) :674-88 (2008)。而且，饱和脂肪酸通常比不饱和脂肪酸具有更高的熔点，因而在许多应用中需求较少。例如，当用作燃料时，饱和脂肪酸在低温下可以导致浑浊，并可能会赋予燃料很差的冷流特性。长链多不饱和脂肪酸是细胞膜中磷脂的必需组分，也是人体多种功能中很重要的各种代谢物的前体。在人类中，可以通过“ω-6途径”从饮食的ω-6和ω-3脂肪酸合成某些长链多不饱和脂肪酸，所述ω-6和ω-3脂肪酸分别例如亚油酸(也被称为LA或18:2)和α-亚麻酸(也被称为ALA或18:3)。然而，由于人类不能合成LA或ALA，这些脂肪酸必须从饮食或其他来源中获得。因为ω-6和ω-3脂肪酸的每ー种都在人体内发挥了重要而不同的作用，所以維持这两类不饱和脂肪酸之间的最佳平衡非常重要。虽然推荐在人类饮食中ω-6和ω-3脂肪酸的比列为5:1，但是在当今西方饮食中这个比例已经严重向ω-6脂肪酸偏移。Sargent, J. R. (1997)Br. J. Nutr. 78, Suppl. 1,5 - 13。实际上，据估计，ω-6脂肪酸的量高达推荐值的30倍。ω-6和ω-3脂肪酸之间的这种比例失衡至少部分归咎于富含LA而ALA含量低的蔬菜油和其他食物的消耗量的增加。Simopoulos, A. P. (1999)Am. J. Clin. Nutr. 70,560S - 569S。因而，在常见食物来源(例如植物油)中增加ALA的量可以帮助纠正饮食中ω-6和ω-3脂肪酸之间的比例失衡。表I主要脂肪酸的特征碳^(键"!名称ι饱和度
16:0棕榈酸饱和的
18:0硬脂酸饱和的
18:1油酸单不饱和的
18:2亚油酸ω-6多不饱和的
18:3α -亚麻酸ω-3多不饱和的表I总结了植物中的主要脂肪酸。(18:1)、(18:2)、(18:3)等命名是指脂肪酸链中的碳原子数及其中的双键数。正如本领域和本公开中通常使用的，上述命名有时代替相应的脂肪酸常用名。例如，油酸(18:1)包含18个碳原子和I个双键，可以被称为“18:1”。在高等真核生物中，细胞色素b5(Cb5)是ー种小的血红素结合蛋白，其通常与内质网(ER)和线粒体外膜相连。Cb5在酰基辅酶A脂肪酸(FA)的去饱和中提供电子[I]。在高等植物中，Cb5也被认为是酰基辅酶A脂肪酸羟基化[2-4]、不同FAD2(例如结合酶、こ炔酶(acetylenase))介导的反应[5_7]、鞘脂的去饱和和轻基化[8,9]、固醇的去饱和[10]和细胞色素P450反应[11]中的电子供体。除了在脂质代谢相关反应中的作用，最近已报导，内质网驻留的Cb5与蔗糖和山梨醇转运蛋白相关的质膜的相互作用导致所述转运蛋白与其底物糖的亲和カ上调，这对于调节细胞内的糖水平至关重要[12]。诸如烟草[16,17]、拟南芥(Arabidopsis)[4,18]、油桐(Tung) [19]、Crepisalpina[7]和大豆的高等植物被独特地赋予了多种Cb5基因，与此相反，在哺乳动物[20]和酵母[21]中分别只有単一的ー种Cb5基因。除了典型的内质网或线粒体外膜相关的“独立” Cb5，还报导了许多前端去饱和酶(例如哺乳动物和线虫(C. elegans)中的Λ5或Λ6去饱和酶[8]和紫草科植物中的Λ6去饱和酶[22])中的Cb5样结构域。还报导了高等植物鞘脂A8-LCB去饱和酶[8]和硝酸还原酶[23]中的Cb5基序。高等植物FAD2和FAD3的已有的大量的分子遗传学和生物化学表征使我们对于18C PUFA合成的理解取得了重大进展；然而，关于这些去饱和酶中各种Cb5同エ型之间联系的并行信息还很有限。概述本文描述的方法克服了上文列出的问题，并通过提供可以在调节种子油含量中起到重要作用的基因而改进了技木。更具体地，已知Cb5基因产物在脂肪酸去饱和中发挥了作用。本公开首次报导了非真菌的FAD3去饱和酶和某些Cb5基因在酵母中的共表达导致ω-3脂肪酸的产量增加。本公开还报导了来自高等植物的不同Cb5基因的不同功能，并提供了调节植物中多不饱和脂肪酸水平的方法。根据本公开，可以对植物进行遗传修饰，使其在种子中产生较高水平的油。一方面，可以对植物进行遗传修饰，使得可以根据不同的需要改变不同脂肪酸之间的比例。例如，可以使不饱和脂肪酸(如18:3)的水平高于未修饰的植物中的水平。由于饮食中的不饱和脂肪酸有多种好处，所以不饱和脂肪酸较高的这种植物具有更高的营养价值。而且，由于不饱和脂肪酸具有快速干燥的特性，不饱和脂肪酸较高的植物还可以在エ业上应用于油漆和涂料ィ丁业。在一个实施方案中，利用内源Cb5基因缺陷的突变酵母菌株表征来自大豆(Glycine max var. Williams)或拟南芥的不同的Cb5基因。已经证明酵母是用于植物脂质生物合成基因(如去饱和酶[24-27]、结合酶[5]、环氧化酶[28]、羟化酶[3，29]、Cb5 [19]和NADH:细胞色素b5还原酶[4，30])的功能表征的很好的实验系统。拟南芥的不同Cb5同エ型在ω-6去饱和中并非同样有效。这个观察结果与大豆Cb5同エ型所表现出的相对类似的效率形成对比。对于ω-3去饱和，在可比较的生长条件下，大豆和拟南芥中的某些Cb5同エ型能够比其它同エ型积累明显更多的18:3。可以通过它们与非天然FAD3的共表达进ー步证实在ω-3去饱和效率中的这些差异。 在另ー个实施方案中，本文公开了来自植物(如大豆或拟南芥)的Cb5同エ型能够调节酵母中的ω-3去饱和。在大多数被子植物中，FAD3是主要的去饱和酶，其负责产生ω-3脂肪酸，例如α-亚麻酸(18:3)。在酵母系统中研究了各种Cb5同エ型在ω-3去饱和中的作用及其与FAD3的相互作用。本研究所获得的结果表明不是所有来自拟南芥和大豆的Cb5同エ型在ω-3去饱和中都同样有效，如当在酵母系统中表达不同的Cb5同エ型吋，α-亚麻酸(ALA，18:3)累积明显不同所证实的。在可比较的生长条件下，来自拟南芥或大豆的某些Cb5同エ型比其它同エ型在产生和积累18:3中具有更高的效率。通过其中用大豆Cb5基因取代拟南芥Cb5基因或相反的分析证实各种Cb5同エ型所发挥的重要作用。本文进ー步公开了 ω-3去饱和的效率不仅取决于Cb5的性质，还取决于各自去饱和酶的效率及Cb5与FAD3之间的相互作用。尤其是，在大豆Cb5基因和天然FAD3共表达的突变cb5酵母中观察到，18:3产量比仅表达FAD3的酵母高2倍多。还显示不同Cb5同エ型之间在它们的18:3水平上的功能变异。表达Cb5-C2或Cb5-El时的18:3水平比表达Cb5-C3时高大约I. 5倍。当表达Cb5-Al时，18:3水平比表达Cb5_C2和Cb5_El时低，但比表达Cb5-C3时的18:3水平高。大豆种子中18:3的水平占总种子脂肪酸的大约8%。已证实过表达FAD3基因能够有助于将18:3的百分比提高至大约50%(Cahoon 2003)，或者在一种情况下，甚至高达总种子脂肪酸的大约70%(Damude et al，2006)。然而，提取这些脂肪酸在商业上是不可行的，因为脂肪酸的水平仍然很低。由于其它辅助因子的可供性有限，通过过表达FAD3进ー步提高去饱和可能是有限的。Cb5可能是这样的辅助因子之一。在转基因植物中，共同过表达某些FAD3和某些Cb5同エ型可以有助于将18:3的含量提高至总脂肪酸的70%(w/w)以上，甚至达至Ij 80%(w/w) ο如本文所公开的，不同Cb5同エ型具有不同的功能。某种Cb5同エ型可以更有效地与某些FAD3蛋白作用，从而促进脂肪酸的去饱和，但与其它去饱和酶作用效率较低。一方面，可以以种子特异的方式使某些Cb5基因与适合的FAD3基因过表达。Cb5-FAD3基因的这种共表达有可能显著提高18:3的水平，使得从种子中提取18:3成为商业上可行的。另一方面，可以使较高的总油含量的性状与特定脂肪酸较高水平的另ー个性状相结合。例如，可以使高种子油性状与高18:3性状相结合，从而产生相对于通常未修饰的大豆植物具有更高价值的大豆作物。本文公开了与种子油和脂肪酸调节相关的基因，包括但不限于编码酶、支架蛋白、电子供体、电子受体、电子载体的基因，这些基因在脂肪酸途径中发挥了作用。这些基因，包括但不限于Cb5基因或去饱和酶基因，可以被导入宿主植物以产生遗传修饰的植物，所述植物能产生更高的种子油含量或使种子中含有更加希望的脂肪酸比例。可选地，可以修饰植物内源的Cb5和/或去饱和酶基因，使得这些基因与未修饰的基因相比以升高的水平表达。待导入宿主植物的Cb5基因或去饱和酶基因可以从所述宿主植物或从不同植株或物种中分离或衍生。例如，可以将真菌基因导入植物，反之亦然。另ー方面，本文的方法可以按照以下来实施步骤一，创造包含一种或多种转基因的ー种或多种植物，所述转基因能提高内源FAD3基因的表达。步骤ニ，从步骤一创造的所述ー种或多种植物的每ー种中获得至少ー个种子。可以进行步骤三，以使用从步骤ニ获得的种子，測定总的种子油含量和亚麻酸在总脂肪酸中的重量百分比。然后可以进行步骤四，以鉴定所产生种子中亚麻酸含量超过总的种子脂肪酸重量比的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或者更优选80%的植物。另ー方面，本文的方法可以按照以下来实施步骤一，创造包含ー种或多种转基因的ー种或多种植物，所述转基因能提高脂肪酸的去饱和来生产亚麻酸。步骤ニ，从步骤ー创造的所述ー种或多种植物的每ー种中获得至少ー个种子。可以进行步骤三，以使用从步骤 ニ获得的种子，測定总的种子油含量和亚麻酸在总脂肪酸中的重量百分比。可以进行步骤四，以鉴定所产生种子中亚麻酸含量超过总的种子脂肪酸重量比的10%、20%、30%、40%、50%、60%, 70%或者更优选80%的植物。步骤一中的转基因可以从宿主植物中分离，或者它们可以从异种来源中分离，例如不同的植物、真菌等。在优选的实施方案中，转基因包括两种基因，一种编码FAD3，另ー种编码Cb5同エ型。另ー方面，ー种或多种转基因置于组织特异性启动子的控制下，使得转基因以种子特异的方式表达。根据本公开的一方面，为了提高宿主生物产生的油的量和/或质量，可以将转基因导入宿主生物用于产生转基因生物。方法包括将第一转基因导入宿主生物的步骤，其中第一转基因具有与SEQ ID. No: 1-8的多核苷酸之一至少95%，优选99%，更优选100% —致的序列。优选地，第一转基因编码的多肽具有与SEQ ID. No: 1-8的多核甘酸之一所编码的多肽的序列至少95%，优选99%，更优选100%—致的氨基酸序列。另ー方面，转基因可以是使柠檬酸发生分解代谢的柠檬酸裂解酶。例如，可以将ACLl基因、ACL2基因或者两者导入宿主植物，这些基因在质体中的过表达可以有助于提高こ酰辅酶A的合成。另ー方面，转基因可以与SEQ ID. No:9-10的多核苷酸之一具有至少95%的同一性。方法还可以包括允许所述宿主生物表达由第一转基因编码的蛋白的步骤。宿主生物优选植物，转基因生物优选转基因植物。除第一转基因之外，方法可以包括将第二转基因导入所述宿主植物的步骤，其中第二转基因编码脂肪酸去饱和酶，例如高等植物的FAD2或FAD3ο 一方面，第一和第二转基因来自相同的植物物种。另ー方面，第一和第二转基因来自不同的植物物种。一方面，转基因植物比非转基因宿主植物产生更高的油含量。另ー方面，转基因植物产生的油比非转基因宿主植物产生的脂肪酸，具有更高百分比的不饱和脂肪酸。所公开的方法可以应用于任何植物，优选含油植物，例如大豆、拟南芥、玉米、花生、加拿大油菜及其它。传统培育也可以用来产生具有期望的油含量或不同脂肪酸之间期望的比例的植物品系。为了产生能表达相对高水平的Cb5和FAD的新品系，可以将自然条件下表达相对高水平的Cb5和/或FAD的品系用作培育的亲代植株。在另ー个实施方案中，可以将耶罗威亚酵母ATP柠檬酸裂解酶(ACL)基因(如ACLl (Genbank :XM 504787)和 ACL2 (Genbank :XM 503231))导入宿主植物以产生转基因植物，所述转基因植物能比非转基因宿主植物产生更高水平的种子油含量。为了指导ACL基因产物进入质体,可以将该基因进行工程化改造使之包含质体定位序列。由于ACL酶能够使质体内可用的柠檬酸发生分解代谢，在质体中过表达ACL酶可以有助于提高こ酰辅酶A的合成。依次地，増加的こ酰辅酶A可以导致脂肪酸的合成増加及种子中油的累积提高。可以使用本文公开的基因的各种形式，它们与本文公开的基因可以不100%—致。这些改变的基因可以编码这样的蛋白，该蛋白能进行与本文所公开的蛋白本质上相同或相似的功能。举例说明，可以使用编码FAD3蛋白的突变的FAD3基因，所述FAD3基因与本文所公开的FAD3序列具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%的同一性。这些FAD3基因包括但不限于本文公开的大豆和拟南芥FAD3基因。类似地，可以使用突变的Cb5同エ型或真菌的ACL基因。的确，通过点突变、断裂或插入的某些突变可以赋予表达的蛋白某些期望的特性，例如定位信号、结合基序等。在另一方面，ACL基因、Cb5基因和编码去饱和酶的各种基因可以在同一植物中共表达，以实现较高的油含量和特定脂肪酸间期望的比例，例如，不饱和脂肪酸占总脂肪酸重量的较高百分比。
图I说明了大豆(Glycine max)Cb5蛋白的系统发育关系。图2展示了大豆(Glycine max var. Williams)器官特异的Cb5基因的表达分析。图3展示了共表达大豆Cb5和FAD2的酵母中16:2和18:2的含量。图4展示了共表达拟南芥Cb5和FAD2的酵母中16:2和18 :2的含量。图5展示了共表达大豆Cb5和FAD3的酵母中18:3的含量。图6展示了共表达拟南芥Cb5和FAD3的酵母中18:3的含量。图7展示了共表达拟南芥或大豆Cb5和非天然FAD3的酵母中18:3的含量。图8展示了利用vector NTI软件对推断的大豆Cb5 (GmCb5)同エ型的氨基酸序列与油桐和拟南芥中已知的和推测的位于内质网的Cb5蛋白进行的比对。图9展示了过表达耶罗威亚酵母ACL基因的转基因拟南芥中种子脂肪酸的范围。图10展示了大豆(Glycine max)的细胞色素b5 (Cb5)基因，即Cb5Al (SEQID. No. I)、Cb5-C2 (SEQ ID. No. 2)、Cb5_C3 (SEQ ID. No. 3)、Cb5_El (SEQ ID. No. 4)的核酸序列。图11展不了拟南芥(Arabidopsis thaliana)的细胞色素b5(Cb5)基因，即Cb5-A (SEQ ID. No. 5)、Cb5-B(SEQ ID. No. 6)、Cb5_C (SEQ ID. No. 7)、Cb5_E (SEQ ID. No. 8)的
核酸序列。图12 展不了解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)ACLl (SEQ ID. No. 9)和ACL2 (SEQ ID. No. 10)基因的核酸序列。详细说明植物经由被称为脂肪酸合成酶(FAS)途径的常见代谢途径合成脂肪酸。β_酮脂酰-ACP (酰基载体蛋白部分)合酶是脂肪酸合成酶途径中重要的限速酶。β-酮脂酰-ACP合酶在植物细胞中以数种形式存在。β -酮脂酰-ACP合酶I催化链延长至棕榈酰-ACP (C16:0)，而β -酮脂酰-ACP合酶II催化链延长至硬脂酰-ACP (C18:0)。β -酮脂酰-ACP合酶IV是β -酮脂酰-ACP合酶II的变体，并且也能够催化链延长至18:0-ACP。在大豆中，FAS的主要产物是16:0-ACP和18:0-ACP。在大豆和许多其他植物中，位于质体的可溶的Λ-9去饱和酶(也被称为“硬脂酰-ACP去饱和酶”)催化18:0-ACP的去饱和，从而形成18:1-ACP。质体FAS和Λ -9去饱和酶的产物(即16:0-ACP, 18:0-ACP和18:1-ACP)可以被特定的硫酯酶水解。根据序列同源性和底物偏好性，植物硫酯酶可以被分为两个家族。第一家族(FATA)包括长链酰基-ACP硫酯酶，主要对18:1-ACP具有活性。第二家族的酶(FATB)通常利用 16:0-ACP (棕榈酰-ACP)、18:0-ACP (硬脂酰-ACP)和 18:1-ACP (油酰-ACP)。植物中在脂肪酸从头生物合成期间，这些硫酯酶在决定链的长度中发挥了重要作用，因而对提供脂肪酰基组分的不同修饰是有帮助的，特别是关于存在于储存油的种子中的不同脂肪酰基的相对比例。 FATA和FATB反应的产物(即游离脂肪酸)离开质体，并转化成为他们各自的酰基辅酶A酷。酰基辅酶A是脂质-生物合成途径(Kennedy途径)的底物，该途径发生在植物细胞的内质网(ER)中。这条途径负责膜脂质的形成和三酰甘油的生物合成，三酰甘油是种子油的主要成分。内质网中的其他膜结合的去饱和酶可以进ー步将18:1去饱和形成多不饱和脂肪酸，例如18:2和18:3。大豆基因组具有两种种子特异性Λ-12去饱和酶FAD2的同エ型，命名为FAD2-1A和FAD2-1B，它们之间只有24个氨基酸残基的不同。在大豆基因组序列中，编码FAD2-1A和FAD2-1B的基因分别被命名为连锁群O中的Glymal0g42470和连锁群I中的Glyma20g24530 (GlymaL O,大豆基因组计划,DoE Joint Genome Institute)。在内质网中发现FAD2-1A和FAD2-1B，在那里它们能够进ー步将油酸去饱和形成多不饱和脂肪酸。Λ-12去饱和酶催化双键插入油酸(18:1)，形成亚油酸，并导致油酸水平随之降低。Λ-15去饱和酶(FAD3)催化双键插入亚油酸(18:2)，形成亚麻酸(18:3)。大豆基因组具有四种FAD3基因的同エ型，例如 FAD3-lA(Anai et al. ,2005)和 FAD3B(Bilyeu et al. ,2003)等。在高等植物中，脂肪酸的从头合成只发生在质体中，但是它们后续的去饱和发生在两个不同的间隔中，即质体和内质网。除了氧，需要某些辅助因子将双键引入脂肪酸。这些辅助因子可以有助于为位于这两处间隔中各自的去饱和酶提供电子。在质体中，光反应产生的还原型铁氧还蛋白作为辅助因子。在内质网中，Cb5蛋白为FAD2和FAD3两者提供电子[13]。尽管两条途径对去饱和的终产物的相对贡献随组织和物种而不同，但在大量的被子植物中，大多数PUFA的合成通过内质网驻留的FAD2(18:1至18:2的去饱和)和FAD3(18:2至18:3的去饱和)去饱和酶[14，15]。在高等植物中，几乎全部脂肪酸都由こ酰辅酶A合成。已经证实，拟南芥中通过大鼠ATP柠檬酸裂解酶(ACL)的组成型表达而导致的质体中こ酸量的升高，提高了转基因拟南芥叶子中脂肪酸的产生。參见Rangasamy and Ratledge (2000)。根据本公开，不同高等植物中不同的Cb5同エ型可能不具有相同的去饱和效率。拟南芥的Cb5-C和Cb5-B同エ型显示出较高的ω-6去饱和以及Cb5_B和Cb5_E同エ型显示出较高的ω-3去饱和，这表明它们可以以不同的效率分别与FAD2和FAD3相互作用。与拟南芥相反，大豆Cb5同エ型没有表现出不同的ω-6去饱和。然而，不同大豆Cb5同エ型表现出不同的ω-3去饱和效率。而且，本研究获得的结果进一歩表明，ω-3或ω-6去饱和的终产物的产量不仅由Cb5的属性决定，而且由脂肪酸去饱和酶的性质決定。在内质网中存在两种电子传递链ー个是NADPH:细胞色素P450还原酶和P450，另ー个是NADH:细胞色素b5还原酶和Cb5[18]。后者被认为是提供基于内质网的FAD2(18:1至18:2的去饱和)和FAD3(18:2至18:3的去饱和)去饱和酶的还原等同物的主要途径[14，15]。生物化学证据也表明，高等植物的FAD2和FAD3都利用Cb5作为电子供体[41]。尽管大量数据显示高等植物的FAD2和FAD3调节18C PUFA的合成，但是关于这些去饱和酶介导的反应中各种Cb5同エ型作用的并行信息还很有限。本文利用内源Cb5基因 缺陷的突变酵母菌株证明了来自拟南芥或大豆的各种Cb5同エ型在FAD2和FAD3介导的反应中的贡献。如通过图I的系统树所显示的，同拟南芥一祥，大豆Cb5同エ型有类似的分岐。研究了这些大豆Cb5基因的表达模式。显然，尽管所有GmCb5基因显示组成型表达模式，但在所有器官(包括是油储存和TAG合成位置的种子)中，GmCb5-Al和GmCb5_El的表达高于其他同エ型(图2)。有趣的是，这些不同的大豆Cb5蛋白显示类似的ω-6去饱和效率。虽然这些结果与用油桐Cb5同エ型所观察到的结果一致，但是即使前体的可供性类似，在突变cb5酵母中大豆FAD2通常导致双不饱和脂肪酸的累积比拟南芥FAD2高大约10倍。这些结果表明大豆FAD2与硬脂酰辅酶A去饱和酶的功能性Cb5结构域有较高的相互作用效率[35]。这种主张还通过以下来支持特别是在较低温度条件下证明在只表达FAD2或共表达Cb5和FAD2的突变cb5酵母中，总双不饱和脂肪酸具有相对相似的水平(图3A)。综合起来，这些数据表明大豆Cb5同エ型在ω-6去饱和中明显没有差别，这可能是由于硬脂酰辅酶A去饱和酶的功能性Cb5结构域的其他贡献。本文公开了利用酵母olel cb5双突变体(分别缺陷硬脂酰辅酶A去饱和酶和微粒体Cb5)，探究大豆Cb5同エ型在ω -6去饱和中的作用的试验。酵母是研究脂肪酸去饱和的合适系统，因为酵母提供了真核生物的内质网、Cb5和NADH:细胞色素b5还原酶。已证实酵母代谢相关的几个因素(如脂肪酸合成速率、脂肪酸分解速率和外源脂肪酸并入速率)决定了终产物的累积水平。然而，现有的数据至多只是半定量的[25]。本文公开的结果证明拟南芥不同的Cb5同エ型在ω-6去饱和中并非同样有效，如通过分别在较高(图4Α)或较低温度(图4Β)下，Cb5-B和Cb5-C同エ型二者表现出的双不饱和脂肪酸(18:2和16:2)高于其他同エ型约I. 5至2倍所证实的。与之相反，在大豆Cb5同エ型的实例中，在较高(图3A)或较低(图3B)温度下，它们总双不饱和脂肪酸水平的差异不显著，这表明不同的同エ型具有类似的ω-6去饱和效率。有趣地注意到，大豆和拟南芥实验是在可比较的生长条件下独立进行的。更具体地，在大豆和拟南芥实验中FAD2前体(18:1和16:1)的可供性是类似的，这排除了可能会对大豆和拟南芥的不同结果造成任何偏差的可能性。尽管转录本水平还没有被測量，但在可比较的生长条件下，不同的转录本累积不可能成为因素，因为大豆和拟南芥的FAD2和Cb5分别被同样的GALlO和GALl启动子驱动。除了 Cb5同エ型在ω-6去饱和中的行为不同，在可比较的生长条件下，还证明了大豆和拟南芥的Cb5同エ型在ω-3去饱和中的显著变化。大豆Cb5-C2、Cb5-El和Cb5-Al (图5A)以及拟南芥Cb5-B和Cb5_E(图6A)始终显示出高于它们的其他同エ型的18:3累积。大豆(图5)和拟南芥(图6)实验是在可比较的生长条件下独立进行的，因为FAD3前体(18:2)的可供性是类似的，这排除了 18:2參与所观察到的不同的18:3累积。更重要的是，在可比较的生长条件下，通过大豆Cb5-El(GmCb5-El)和Cb5_Al (GmCb5_Al)以及拟南芥Cb5-B (AtCb5-B)和Cb5-E (AtCb5-E)甚至与非天然FAD3(图7A)导致的较高的18:3积累，证明它们保留了较高的ω-3去饱和效率。在较低温度条件下，用除AtCb5-C以外的大多数Cb5同エ型均观察到类似的趋势，它们显示18:3的水平与AtCb5-B类似(图7B)。尽管观察到大豆和拟南芥中大多数Cb5同エ型保留了不同的ω-3去饱和特性，但是吸引人的是，尤其在用非天然AtFAD3的条件下(图7)，用GmCb5-C2和GmCb5_C3 二者的18:3水平比用其天然FAD3所获得的水平(图5)显著降低了大约3倍。需要注意的是，在与其天然FAD3共表达的条件下，拟南芥Cb5-C积累的18:3比与其他同エ型少2_4倍(图6)。 然而，在较高或较低的温度条件下(图7A和B)，拟南芥Cb5-C(AtCb5-C)与非天然GmFAD3的共表达导致18:3的水平比与天然FAD3共表达所获得的水平(图6A和B)显著增加2至4倍。有趣的是，在仅用大豆FAD3而不用拟南芥FAD3的情况下，观察到不论是用来自大豆还是拟南芥的‘C’类Cb5蛋白都具有较高的18:3累积。在系统发育分析中(图l)，Cb5蛋白的四个任意类别(即A、B、C和E)中，来自大豆的‘C’类形成了単独的组，其与拟南芥Cb5-C(AtCb5-C)成簇接近。来自大豆、油桐和拟南芥的不同的Cb5蛋白的氨基酸比对表明，尽管‘C’类蛋白与其他种类具有显著较高水平的总体同一性，但是在它们的C末端(盒中)有大量的差异，尤其是在位于跨膜结构域之前的区域(图8)。还不清楚氨基酸的这种不同对于‘C’类Cb5蛋白与大豆FAD3而不是拟南芥FAD3的更大的相互作用效率是否有任何意义，但本文提供的结果表明，Cb5同エ型的进化趋异可能有助于它们与去饱和酶不同的相互作用效率，如通过它们的去饱和产物产量的差异所证实的。已证明与拟南芥相比，利用大豆去饱和酶(FAD2/FAD3)具有显著更高的产物积累，这表明它们可能具有不同的酶促效率。几项以前的研究也报导了高等植物去饱和酶的不同效率。例如，大豆FAD2-1A和FAD2-1B蛋白共享大约93%的氨基酸同一性，较高或较低温度下在野生型酵母中已证实后者多积累2至4倍的双不饱和脂肪酸(18:2和16:2) [34]。对于本文公开的大豆研究，使用了与拟南芥FAD2蛋白序列共享66%同一性的FAD2-1B (数据未显示)。这种分岐可以解释利用大豆FAD2(FAD2-1B)具有显著更高水平的18:1和16:1去饱和。在另ー项研究中，已证实野生型酵母中大豆的两种不同的FAD3基因(即FAD3-1A和FAD3-1B)的表达，分别积累了 10. 7%和3. 7%的18:3[39]，尽管它们预测的蛋白序列的同一性高于93%。本公开使用的大豆FAD3(FAD3-1A)与拟南芥FAD3蛋白共享66. 6%的同一性(数据未显示)。与拟南芥FAD3(图6)相比，利用大豆FAD3 (图5)分别在突变体cb5和野生型酵母中观察到18:3的累积增加了 30至40倍，这可能是由于来源于两种分歧物种的这些蛋白的内在变异。同样的理由还可以解释与大豆FAD3相比，拟南芥FAD3缺少Λ-12去饱和活性。有趣地注意到内质网定位的蛋白中，脂肪酸去饱和酶(FAD)与其它内质网驻留蛋白相比具有较短的半衰期。例如，与内质网驻留的Cb5蛋白的2-6天的半衰期相比，哺乳动物内质网驻留的硬脂酰辅酶A去饱和酶具有4小时的半衰期，所述硬脂酰辅酶A去饱和酶在结构上与植物FAD2/FAD3酶家族有关[42及其參考文献]。已经有文献表明，环境因素能够调节内质网驻留的FAD蛋白的半衰期。例如，低温下在异源酵母系统中由高等植物FAD2[34]和FAD3[26]导致的不饱和度的提高，与其转录本的任何増加都没有关系，但与各自去饱和酶的稳态水平的増加有关。通过上面的例子类推，似乎有可能的是，尤其在较低温度条件下所观察到的，大豆FAD3蛋白丰度的増加及其与酵母Cb5更高的相互作用效率，可能会导致大豆Cb5同エ型中18:3的水平没有差别(图5B)。而且，尤其在较低温度条件下(图6B)与其天然EAD3共表达时，拟南芥Cb5-A与Cb5_E和Cb5_B 二者中能够达到相对类似的18:3水平，这也表明FAD3丰度的可能增加有可能促成18:3水平较小的差异。在用拟南芥FAD3(AtFAD3)而不是用大豆FAD3 (GmFAD3)的情况下，观察到不论是来自大豆(GmCb5_C2和GmCb5-C3)还是来自拟南芥(AtCb5-C)的‘C’类Cb5蛋白都具有较低的ω-3去饱和效率。这些不同可以解释，在较低温度条件下所观察到的拟南芥Cb5-C与天然FAD3作用为什么没有实质上増加18:3的水平(图6B)，并且还可以解释在较低温度下在用非天然大豆 FAD3 (GmFAD3)的条件下，拟南芥Cb5_C(AtCb5_C)与AtCb5_B中展示了相对类似的18:3水平(图7B)。本文描述的方法和材料涉及与植物中控制种子油含量有关的基因和蛋白。根据本公开，植物可以被遗传修饰，从而改变它们的种子油含量。术语“遗传修饰”被用于提及通过传统育种或通过转基因或定向破坏某些基因来改变植物性状的行为。这些基因和蛋白可以被导入宿主植物，从而获得在种子中产生和储存更多或更少油的植物。本文使用的“基因”是指编码蛋白或多肽的核酸序列。基因的广泛定义可以包括启动子区、内含子和外显子区以及位干与基因产物表达相关的编码序列的3’或5’端的非翻译区。本文使用的“基因型”是指细胞或生物的遗传构成。本文使用的“表型”是指可检测的细胞或生物特性，这些特性是所述细胞或生物中基因表达的表现。为了本公开的目的，非遗传修饰的(非-GM0)表示能够适度地在自然界中发生。如果没有通过遗传工程改造而改变生物的遗传构成，则生物被认为是非遗传修饰的。遗传エ程可以通过以重组核酸的形式添加基因或其片段，例如转基因，通过缺失生物中的某些多聚核酸，或通过改变生物内源基因的序列或表达水平。本文使用的“杂交”是指两个亲代植株的交配。“脂肪酸”(或“FA”)是羧酸，通常含有长的无支链的脂肪族烃链。(18:2)、(18:1)、(18:3)等命名分别指脂肪酸链中的碳原子数及其中的双键数。例如，油酸(18:1)包含18个碳原子和I个双键。示例性脂肪酸包含ω -3 脂肪酸如α -亚麻酸(CH3 (CH2CH=CH) 3 (CH2) 7C00H) ω -6 脂肪酸如亚油酸(CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH(CH2) 7C00H)ω -9 脂肪酸如油酸(CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 7C00H)及饱和脂肪酸如棕榈酸(CH3 (CH2) 14C00H)硬脂酸(CH3(CH2) 8C00H)。本文使用的分离的核酸是指不含与自然环境中存在的核酸相关的至少ー些污染物的核酸。分离的核酸可以包括去除内含子的DNA。对于多核苷酸，术语“突变”或“突变的”是指ー个或多个核苷酸缺失或插入，ー个或多个核苷酸被不同核苷酸取代。对于编码序列，突变可以弓I起编码多肽的任何变化或可以不引起编码多肽的任何变化。同样地，对于多肽，突变可以是ー个或多个氨基酸的缺失或插入，一个或多个氨基酸被不同氨基酸取代。可以通过本领域内已知的技术，例如但不限于定点诱变，在分离的多聚核酸中产生突变。突变也可以通过X射线、伽马射线或快中子照射和化学诱变剂处理(如烷化剂こ基甲磺酸(EMS)或N-亚硝基-N-甲基脲(NMU))诱导。此外，由在植物基因组DNA复制过程中发生的随机的DNA聚合酶错误所产生的突变能够导致自然的遗传变异。暴露于自然来源的电离或非电离辐射后DNA修复机制的活化也可以在植物中导致自然的遗传变异。
可以使用整株植物或植物的一部分。优选的植物部分包含生殖部分或储存部分。本文使用的术语“植物部分”包括但不限于种子、胚乳、胚珠、花粉、根、块茎、茎、树叶、叶柄、果实、浆果、坚果、树皮、豆荚、种子和花。在本公开的实施方案中，植物部分是种子。通常通过被称为启动子的基因非编码区调节蛋白的表达。当启动子控制基因的转录时，也可以表述成启动子驱动基因(或编码的蛋白)的表达。当启动子被置于编码序列附近，使得所述编码序列的转录受启动子的控制时，可以表述成编码序列可操作地连接于启动子。与基因不是正常相关的启动子被称为异源启动子。当启动子只在特定组织中启动某些基因的表达时，这样的启动子被称为组织特异性启动子。在本公开中，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”可以相互交換使用，它们都是指氨基酸聚合物。除了本文明确公开的肽，可以在这些肽中进行某些“保守性”突变而不会显著改变肽的功能。如同本领域内所通常理解的，直系同源蛋白中的保守氨基酸残基是进化压カ的结果，从而維持生物学功能和/或蛋白折叠。直系同源的ー组基因中，保守的氨基酸位置能够參与结构和功能的许多方面。不变的位置或表现出保守的某些残基特性(如电荷、疏水性等)的位置不可能比蛋白家族允许突变成各种氨基酸的位置耐受突变。例如，根据数据库中储存的序列，位置上的氨基酸序列保守在决定可能对蛋白折叠和/或生物学功能产生不利影响的氨基酸取代中是有用的。根据序列同源性和氨基酸的物理性质，可以使用计算机算法序列比对程序预测氨基酸取代是否会影响蛋白的功能。可以使用例如，但不限于SIFT、PolyPhen, SNPs3D、PANTHER PSEC、PMUT和TopoSNP的氨基酸取代预测方法预测氨基酸取代对蛋白功能的影响。保守性氨基酸取代通常定义为用不同的保留蛋白结构和功能特性的ー个或多个氨基酸取代一个或多个氨基酸。用另ー个氨基酸对ー个氨基酸的“非保守性”取代是指具有不同结构和/或化学特性的氨基酸取代，并且通常基于所涉及的残基的极性、电荷、疏水性、亲水性和/或两性性质的不同。取代的氨基酸可以包括天然存在的氨基酸以及在自然界存在的蛋白中不是正常存在的那些氨基酸。
实施例
以下非限制性的实施例报道了一般程序、试剂及通过实例教导的表征方法，并且不应该以将公开限制为具体公开内容的狭义的方式解释。本领域技术人员应当理解，可以做出多种修改，而结果仍然落入本发明的精神和范围内。实施例I大豆Cb5基因的鉴定、克隆和表达模式公开发表的几乎全部的大豆基因组序列(Glycine max var. Williams ;也可以从WWW. phytozome. org网站获得)使得我们可以在基因组范围内研究Cb5基因。当使用推断的拟南芥Cb5(At5g53560)蛋白查询TBLASTN全大豆基因组时，鉴定了 11个有前景的Cb5候选基因(表2)。表2 大 (Glycine max var Williams)细胞色素 b5(Cb5)基因
权利要求
1.产生转基因生物来提高所述生物产生的油的量和/或质量的方法，所述方法包括如下步骤 a)将第一转基因导入宿主生物中，所述第一转基因具有与选自SEQIDNO: 1-8的多核苷酸的序列至少95%—致的序列； b)允许所述宿主生物表达由所述第一转基因编码的蛋白。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述宿主生物是植物，并且所述转基因生物是转基因植物。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述转基因植物比非转基因宿主植物产生更高的油含量。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述转基因植物产生的脂肪酸比非转基因宿主植物产生的脂肪酸具有更高百分比的不饱和脂肪酸。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述植物选自大豆、拟南芥、玉米、花生和加拿大油菜。
6.如权利要求2所述的方法，其中将编码脂肪酸去饱和酶的第二转基因导入所述宿主植物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述第二转基因选自高等植物FAD2和FAD3。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述第一和第二转基因来自相同的植物物种。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述第一和第二转基因来自不同的植物物种。
10.产生转基因生物来提高所述生物产生的油的量和/或质量的方法，所述方法包括如下步骤 a)将编码多肽的第一转基因导入宿主生物中，所述多肽具有与选自SEQID ΝΟ:1-8的多核苷酸所编码的多肽序列至少95% —致的氨基酸序列； b)允许由所述第一转基因编码的所述多肽在所述宿主生物中表达。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述宿主生物是植物，并且所述转基因生物是转基因植物。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述转基因植物比非转基因宿主植物产生更高的油含量。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述转基因植物产生的脂肪酸比非转基因宿主植物产生的脂肪酸具有更高百分比的不饱和脂肪酸。
14.如权利要求10所述的方法，其中将编码脂肪酸去饱和酶的第二转基因导入所述宿主生物。
15.产生转基因生物来提高所述生物产生的油的量和/或质量的方法，所述方法包括如下步骤 a)将转基因导入宿主生物中，所述转基因具有与选自SEQID N0:9-10的多核苷酸的序列至少95%—致的序列； b)允许所述宿主生物表达由所述第一转基因编码的蛋白。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述宿主生物是植物，并且所述转基因生物是转基因植物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述植物选自大豆、拟南芥、玉米、花生和加拿大油菜。
18.如权利要求15所述的方法，其中将两种转基因导入所述宿主生物中，第一转基因具有与SEQ ID N0:9的多核苷酸至少95%—致的序列，并且第二转基因具有与SEQ ID NO: 10的多核苷酸至少95% —致的序列。
19.转基因植物，其根据权利要求2所述的方法从宿主植物产生。
20.转基因植物，其根据权利要求11所述的方法从宿主植物产生。
21.转基因植物，其根据权利要求16所述的方法从宿主植物产生。
全文摘要
细胞色素b5(Cb5)是一种位于高等真核生物内质网(ER)和线粒体外膜中的血红素结合蛋白。在高等植物、动物和真菌中，已证实内质网驻留的细胞色素b5在酰基辅酶A脂肪酸去饱和中发挥了作用。来自诸如大豆或拟南芥的植物的高等植物Cb5同工型能够调节ω-3去饱和。在宿主植物中共表达某些Cb5同工型和FAD3能导致产生的种子油含量增加，以及不同脂肪酸之间的比例改变。本发明还公开了在宿主植物的质体中过表达耶罗威亚酵母ACL酶有助于提高乙酰辅酶A的合成，从而可以导致脂肪酸合成的增加以及种子中油累积的提高。
文档编号A01H5/00GK102822344SQ201080062940
公开日2012年12月12日 申请日期2010年12月17日 优先权日2009年12月17日
发明者拉杰什·库马尔, 亨利·T·恩圭耶 申请人:密苏里大学管委会