专利名称：局限曲霉28代谢产物在防治黄瓜立枯病菌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及生防内生真菌一局限曲霉菌 (Aspergillus restrictus)的培养及其代谢产物的应用。
背景技术：
植物体内都存在大量的内生真菌，内生真菌最早发现于牧草，后来又在木本植物、 草本植物、禾本植物、苔藓、地衣、海藻等植物中被发现。迄今的研究表明，植物内生真菌可增强宿主的抗病性、提高植物的生产力、抗逆抗虫等。发挥这些作用是由于内生真菌在植物体内繁殖和生长，并在体内产生有生物活性的次生代谢产物。因此，内生真菌可能成为生物防治中有潜力的生物控制剂，在生态农业和生物农药研制方面具有重要的用途。近年来植物内生真菌已引起了微生物学家、生态学家、植物保护学家的广泛兴趣，逐渐成为国内外研究的热点。目前微生物源生物化学农药的研究和开发在我国十分活跃，但微生物资源及其应用潜力尚没有得到充分的发挥，而植物内生真菌即是这样一类有待开发的新兴微生物资源。目前对植物病害的防治，主要采用化学农药杀灭病原菌，但化学农药对人畜的毒副作用和残留问题至今仍难以有效的解决。利用内生真菌产生的抗病原真菌的活性物质进行植物病原真菌病害的生物防治，则具有周期短、易于研究、便于生产和低毒等优点。本发明从大蒜中分离到一株生防内生真菌，并对该菌株发酵代谢产物进行了抑菌作用研究。该发明为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株。
发明内容
本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一种从大蒜中分离筛选出的内生真菌-局限曲霉菌(Aspergillus restrictus)；本发明的另一目的是提供利用该菌株代谢产物防治植物真菌病害的方法。本发明局限曲霉菌的分离、筛选与鉴定是于2009年4月在浙江杭州郊外菜园中采集大蒜，经分离、纯化、培养、发酵和活性测定等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为局限曲霉菌(Aspergillus restrictus)，定名为局限曲霉菌(Aspergillus restrictus) 28。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登记号CGMCC No.4507。局限曲霉菌28，其固体培养特征为菌落在PDA平板上培养5-7天扩展至直径9cm，初期白色稀疏，菌丝沿培养基表面匍匐生长，后形成灰色，反面无色，菌丝具隔，分枝。显微形态特征分生孢子梗顶端膨大呈头状；分生孢子浅灰色，近球形。本发明所述的局限曲霉菌观，经发酵提取可获得对部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的代谢产物。本发明目的通过以下技术方案来实现
一种防治水稻纹枯病或黄瓜立枯病等植物真菌病害微生物代谢产物的制备方法， 按以下步骤进行(1)菌种的活化培养将分离保存的局限曲霉观菌种移至马铃薯葡萄糖PDA固体平板上，在士 1°C条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为4mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；(2)发酵培养发酵培养液为每IOOOmL中含有黄豆饼粉20g，玉米粉15g，可溶性淀粉 20g，麸皮 10g，蛋白胨 8g，NH4NO3 3g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，MgSO4 lg，每 300mL 三角瓶装发酵培养液60mL ；配制后121°C灭菌20min，待冷却至40°C在无菌条件下挑取1直径为 4mm菌饼，在士 1°C条件下，摇床转速180转/分钟，发酵培养7天；(3)发酵物提取发酵完毕，离心收集发酵上清液，用常规有机溶剂萃取，经真空浓缩后获得浸膏，用于抑菌活性测定。本发明的有益效果一是本发明从植物大蒜中分离筛选出代谢物对部分植物真菌病害病原菌具有较强抑制作用的局限曲霉观，这为农业上防治植物真菌病害病原菌提供了一种微生物菌株；二是本发明提供了利用局限曲霉观发酵获得活性代谢产物的方法；该代谢产物可应用于植物真菌病害的防治，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。
具体实施例方式实施例1 (局限曲霉28的分离与筛选)本发明于2009年4月在浙江杭州郊外菜园中采集大蒜，经表面消毒、内生真菌分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤，从中获得局限曲霉菌(Aspergillus restrictus) 28，保存。局限曲霉菌(Aspergillus restrictus)观抑菌活性测定取经0. 22 μ m膜过滤的发酵上清液ImL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅速混勻，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的黄瓜立枯病菌(lihizoctonia solani)或水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)等供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)， 置培养箱中培养36h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率
苗■膽_对照菌落直径-处理菌落直径1ΛΛ0/
菌丝生长抑制率=-Λ-χ ιοο%
对照菌落直径-4测定结果表明局限曲霉菌(Aspergillus restrictus)观代谢产物对黄瓜立枯病菌和水稻纹枯病菌的抑制率分别为85%和88%。实施例2 (局限曲霉观发酵代谢产物的制备方法)按以下步骤进行(1)菌种的活化培养将分离保存的局限曲霉28菌种移至马铃薯葡萄糖PDA固体平板上，在士 1°C条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为4mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；(2)发酵培养发酵培养液为每IOOOmL中含有黄豆饼粉20g，玉米粉15g，可溶性淀粉 20g，麸皮 10g，蛋白胨 8g，NH4NO3 3g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，MgSO4 lg，每 300mL 三角瓶装发酵培养液60mL ；配制后121°C灭菌20min，待冷却至40°C在无菌条件下挑取1直径为 4mm菌饼，在士 1°C条件下，摇床转速180转/分钟，发酵培养7天；(3)发酵物提取发酵完毕后离心收集发酵液，采用等体积乙酸乙酯萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏，得乙酸乙酯萃取物，供抑菌活性测定。以下实施例3、4中所述的局限曲霉观代谢产物均为实施例2所制产品；所述产品的百分含量均为质量/体积百分比。实施例3 (局限曲霉观代谢产物对水稻纹枯病菌和黄瓜立枯病菌的抑制作用)(1)准确称取局限曲霉观代谢产物30mg，并加入IOmL体积的无菌水，超声波震荡充分溶解，最终配置成浓度为3000mg/L的母液；(2)抑菌活性测定取上述母液分别稀释成浓度为1250mg/L、1000mg/L和500mg/L 的溶液，取各浓度溶液ImL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅速混勻(局限曲霉28代谢产物终浓度为125mg/L、100mg/L和50mg/L)，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的水稻纹枯病菌或黄瓜立枯病菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中培养36h，以井R霉素药剂和无菌水处理作为对照，重复3次；
采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率
权利要求
1.局限曲霉观代谢产物防治黄瓜立枯病菌(Miizoctoniasolani)的应用。
2.权利要求1所述的应用，其中局限曲霉观代谢产物由以下方法获得局限曲霉观经斜面活化培养、发酵培养获得发酵液，采用乙酸乙酯(体积比发酵液1 乙酸乙酯1)萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏，得乙酸乙酯萃取物，所述的局限曲霉观已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No. 4507。
全文摘要
本发明涉及微生物技术领域，本发明所述的大蒜内生真菌是从浙江杭州郊外菜园中采集的大蒜植物活体中采用内生真菌微生物分离技术分离获得的，经微生物分类学鉴定，命名为局限曲霉菌(Aspergillus restrictus)28，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登记号CGMCC No.4507。本发明最显著的特征是该菌株液体发酵能够产生对植物真菌病害病原菌如黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)和水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)等有抑制作用的活性代谢产物，是农业上重要的微生物资源。
文档编号A01N63/04GK102210329SQ20111008820
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月8日 优先权日2011年4月8日
发明者俞晓平, 申屠旭萍, 董胜张, 边亚琳, 郝培应, 马正 申请人:中国计量学院