专利名称：枳转录因子PtrbHLH及在提高植物抗寒中的应用的制作方法
技术领域：
本专利属于植物基因工程领域。具体涉及一种从积(Poncirus trifoliata)中分离、克隆的一个bHLH (basic helix-loop-helix,碱性螺旋-环-螺旋)家族转录因子PtrbHLH,还涉及一种转录因子PtrbHLH在提高植物抗寒中的应用。
背景技术：
植物经常遭受一系列的环境胁迫，包括干旱、高温、低温、盐碱、淹水等，其中，低温是影响作物生长发育和产量及限制植物地理分布最为重要的因素之一。在漫长的进化过程中，植物已经形成一套复杂的机制来适应和生存非生物逆境。近二十年来，国内外科学家在对植物响应非生物逆境分子机制解析方面已经取得了很大的进步(Qin et al.，2011)。现 在清楚的是，植物逆境响应是一个非常复杂的多个信号途径的过程。外界胁迫信号由已知或未知的传感元件识别，激活第二信使(如钙离子，活性氧和肌醇磷酸盐)。之后，由不同的信号元件转导、传达、放大胁迫信号，最终导致一系列的生理和代谢改变。人们在鉴定参与逆境响应答的信号转导元件中已经取得了巨大的进步。大量的证据表明，复杂的逆境信号传导途径包括了大量的逆境响应基因，根据基因产物的功能大体上可以分为两类。第一类是由直接保护细胞免受损伤的功能蛋白组成，第二类是由在信号转导和基因表达起调控作用的调节蛋白组成(Agarwal etal. , 2006;Chinnusamy et al. ,2006;Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki 2007;Lataand Prasad, 2011)。对逆境响应基因的研究不仅能够了解逆境响应机制，而且也使得人们通过转基因创造抗性增强的转基因植物(Wang et al. , 2003; Qin et al. , 2011; Lata andPrasad, 2011)。大量研究表明，通过过量表达功能基因和调控基因能够显著提高植物的抗逆性。但是，功能基因和转录因子在组成性表达的结果可能不同(Agarwal et al.，2006)。与功能基因相比，转录因子在提高植物的抗性功能更强大。一个转录因子的超表达能够激活一系列的靶基因，它们可以会一起在应对逆境上起作用，而不是一个转入的功能基因起作用。因此，转录因子遗传转化是植物抗性遗传改良的一种重要途径和手段。植物基因组拥有大量的转录因子；例如，拟南芥中有多于1500个转录因子，占它的基因组将近 6%(Riechmann et al.，2000),其中 bHLH(basic helix-loop-helix,喊性螺旋-环-螺旋)类转录因子是调控网络中重要的成员，该家族蛋白具有bHLH域，HLH区域位于b HLH模体的C端，由约60个氨基酸组成的两个功能明显不同bHLH模体组成。HLH模体参与同型二聚体或异质二聚体的形成是由于α -螺旋的相互作用。碱性区域位于bHLH模体的N端,含有大约15个碱性氨基酸,它决定着DNA和蛋白互作的特异性(Buck and Atchley,2003; Toledo-Ortiz et al. , 2003; Li et al.，2006)。bHLH 转录因子在真核生物中广泛分布，如在拟南芥和水稻中分别有147和167个基因(Li et al.，2006 ；ToIedo-Ortiz etal.，2003)。在动物中，bHLH家族成员的功能已经被广泛研究，但在植物中的研究相对较少。自第一个植物bHLH蛋白(Lc)在玉米中被报道(Ludwig et al.，1989)以来，在一些植物中鉴定了部分bHLH转录因子。已经表明，植物bHLH蛋白在不同的生物学过程起转录调控作用，包括皮毛或根毛发育(Berhardt et al. , 2003; Tominaga-ffada et al. , 2012;Karasetal.，2009)、叶绿体发育(Monte et al.，2004),类黄酮生物碱和花青素合成(Nesi etal. , 2000; Yamada et al.，2011)。一些bHLH蛋白，诸如PIF3 (光敏色素相互作用因子3)、PIF4 及 HFRl 参与光诱导的信号转导(Ni et al. , 1998;Huq and Quail, 2002;Fairchildet al.，2000)。然而，植物bHLH转录因子在环境胁迫应答方面却不多。目前，研究得最为清楚的逆境应答bHLH转录因子是ICEl (inducer of CBF expression 1)，它编码一个MYC类似的转录因子，它通过调控CBF3启动子中的顺式作用元件来提高植物的抗寒能力(Chinnusamy et al.，2003)。之后，鉴定了 2个与ICEl有较高同源性的bHLH基因，即拟南芥ICE2 及苹果 MdCibHLHKFursova et al. , 2009;Feng et al.，2012)。其它与胁迫应答有关的bHLH转录因子包括AtbHLH38、AtbHLH39、FIT，它们能被缺铁所诱导，AtbHLH38、AtbHLH39的过量表达能增强植物对铁或镉的吸收(Yuan et al. , 2008; Lignam et al. , 2011 ；ffuetal.，2012)，表明它们在重金属毒害应答中起作用。此外，水稻的一个bHLH基因也被发现参与干旱胁迫应答(Seo et al.，2011)。所有这些研究表明，bHLH转录因子在非生物逆境响应中发挥着重要作用，在利用基因工程提高植物抗逆性方面有很大的潜力。
发明内容
本发明目的是提供了一种从极抗寒的积(Poncirus trifoliata)中分离、克隆出的一个bHLH类转录因子(申请人将其命名为PtrbHLH)，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示。本发明的另一个目的是提供了一种bHLH类转录因子PtrbHLH在提高植物抗寒中的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入烟草和柠檬，鉴定其抗寒功能，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。为了达到以上目的，本发明采用以下技术手段以bHLH为关键词搜索柑橘EST数据库(HarvEST =Citrus ver. 0. 51)，搜索到17个和bHLH高度同源的EST序列，利用其重叠部分进行拼接，利用拼接软件DNAstart将其拼接成一条序列，序列分析发现拼接后的序列包括一个完整的ORF阅读框，根据这条拼接好的序列作为一个参考序列，设计引物在枳上扩增出基因PtrbHLH，其核苷酸序列为SEQ IDNO I所示，在SEQ ID NO 1所示序列的253-1824bp处为该基因的编码区；其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，它包含1464bp的开放阅读框，编码487个氨基酸，等电点为
5.3，预测的分子量为53. 6kD。申请人:设计了克隆上述的基因PtrbHLH的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示正向引物5，-TTGTCGACGCAGCGAGTAAAGTATGGCCAATGG-3，；反向引物5’ -ATGGTACCGGATCCATGATACCATTACCCTACCAC-3，。利用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草和柠檬，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PtrbHLH基因具有提高抗寒性的功能。在本发明的实施例部分，我们阐述了枳PtrbHLH转录因子的分离、功能验证和应用。与现有技术相比，本发明具有以下优点本发明利用转基因技术得到抗寒性提高的植株，突破了传统育种手段的障碍；此外，本发明的基因在多种植物中抗性稳定，为植物抗寒基因工程提供了重要的基因资源。
图I为一种本发明的技术流程图。图2为一种PtrbHLH基因在低温、盐胁迫和脱水迫下的表达。其中图2A是枳田间苗(未转基因)在4°C处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量；图2B是枳田间苗(未转基因)在200mM氯化钠处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量；图2C是枳田间苗(未转基因)室温下脱水不同时间点下本发明基因的表达模式。图3为一种PtrbHLH基因亚细胞定位示意图。图3A，GFP基因(对照)在明场(图左)、暗场(中)下的成像，右图为二者叠加后的成 像；图3B，PtrbHLH基因在明场(左)、暗场(中)下的成像，右图为二者叠加后的成像。图4为一种PtrbHLH基因转录激活鉴定示意图。图4A是空载体(pDEST 32)转化的酵母在不同培养基上的生长情况；图4B是融合载体PtrbHLH转化的酵母在不同培养基上的生长情况。图5为一种PtrbHLH基因载体构建示意图。图6为一种PtrbHLH基因转化柠檬过程示意图。左上为共培养的茎段，右上为在筛选培养基上长出抗性芽，左下为芽伸长培养基上的丛芽，右下为生根培养苗。图7为一种PtrbHLH基因转化烟草和柠檬再生植株PCR鉴定示意图。图7APtrbHLH转化烟草后得到的再生植株PCR鉴定图(左为NPTII基因特异引物PCR扩增图，右为35S正向引物和PtrbHLH特异引物PCR扩增图)。图7B是PtrbHLH转化柠檬后得到的再生植株利用NPTII基因特异引物PCR扩增图。图7C是PtrbHLH转化柠檬后得到的再生植株利用35S正向引物和PtrbHLH特异引物PCR扩增图。图8为一种鉴定阳性转基因植株中转基因PtrbHLH的表达量分析示意图。图8A为转基因烟草PtrbHLH的表达量分析，图8B是转基因柠檬PtrbHLH的过量表达分析。图9为一种30天大小的PtrbHLH转基因烟草苗(0E8和OElO两个系)与野生型抗寒性比较及成活率统计示意图。图9A (左)是转基因烟草和对照低温处理前的表型-M (中)是0°C处理23小时后的表型；9A (右)是0°C处理23小时并在25°C下恢复10天后的表型。图9B是烟草转基因系和野生型0°C处理23小时并在25°C下恢复10天后的成活率。图10为一种60天大小的PtrbHLH转基因烟草苗(0E8和OElO两个系)与野生型抗寒性比较示意图。左图(上)是PtrbHLH基因转化烟草和野生型在低温处理前；(中)0°C处理23小时后的表型；(下)25°C恢复生长5天后的表型。右图是另一组重复。图11为一种30天大小的PtrbHLH转基因烟草苗(0E8和OElO两个系)与野生型(TC处理23小时后细胞坏死染色、电导率测定示意图。图IlA是细胞坏死染色；图IlB是电导率测定。图12为一种PtrbHLH转基因柠檬(#2和#8)与野生型抗寒性比较示意图。
(上)野生型和两个转基因系低温处理前的表型；(中)是0°C处理48小时转入_3°C处理2小时后的表型；(下)是25°C恢复生长5天的表型。图13为一种转基因柠檬与野生型低温0°C处理48h小时转入_3°C处理2小时的电导率测定及细胞坏死染色示意图。图13A电导率测定；图13B细胞坏死染色。图14为一种PtrbHLH转基因烟草和柠檬及对应的野生型在低温处理后的DAB染色示意图。指示H2O2含量，染色越深表明H2O2越多；图14A显示转基因烟草(0E8和0E10)和野生型在低温处理后的DAB染色；图14B显示转基因柠檬(#2和#8)和野生型在低温处理后的DAB染色。
具体实施例方式以下结合具体实施对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例I PtrbHLH基因分离克隆及表达分析以bHLH为关键词搜索柑橘EST数据库(HarvEST =Citrus ver. O. 51)，搜索到17个和bHLH高度同源的EST序列，利用其重叠部分进行拼接，利用拼接软件DNAstart将其拼接成一条序列,序列分析发现拼接后的序列包括一个完整的ORF阅读框，根据这条拼接好的序列作为一个参考序列，设计引物在枳上扩增出基因PtrbHLH。使用Trizol试剂盒抽提积叶片4°C处理48小时的RNA (试剂盒购自Invitrogen公司，抽提按照提供的说明书操作)，将抽提的IugS RNA样品经IU的DNaseI (购自Fermentas公司)室温处理30分钟后，加入I μ I EDTA (25mM),于65°C温育10分钟。用MBI反转录试剂盒合成第一链cDNA(货号K1621，购自Fermentas公司，按照试剂盒说明书操作)，所得的第一链cDNA用于扩增PtrbHLH基因全长。50 μ I的反应体系中包括200ng cDNAUX缓冲液(TransStart FastPfu缓冲液)、10mM dNTPUU Taq聚合酶(前述缓冲液和聚合酶购自TRANS公司)及I. O μ M引物。正向引物5 ’ -TTGTCGACGCAGCGAGTAAAGTATGGCCAATGG-3 ’ ；反向引物5 ’ -ATGGTACCGGATCCATGATACCATTACCCTACCAC-3’。PCR反应在ABI 7500 (Applied Biosystem)扩增仪上按以下程序完成95°C I分钟；95°C变性20秒、58°C退火20秒、72°C延伸60秒(共40个循环)；循环完成后72°C延伸5分钟。产生一条PCR条带产物，经1%的琼脂糖凝胶电泳后，用E.Z.N.A t)NA凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，美国)回收特异带(提取步骤参照使用说明)。回收纯化的DNA溶液与pMD18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司，即TaKaRa公司)进行连接反应(按说明书操作)，连接反应体系中PtrbHLH基因与pMD18-T载体的摩尔比为3 :1，连接反应总体积是10 μ 1，包括5 μ I的2Χ缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司)，4. 5 μ I纯化的PCR产物和O. 5 μ I T载体。16 °C连接过夜。取10 μ I连接产物，热激法转化大肠杆菌DH5 α，在含有50mgL氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取2_4个克隆测序。为分析PtrbHLH基因是否对胁迫有响应，采用实时定量PCR分析该基因在低温、盐 和脱水处理下的表达。结果表明，低温(见图2A)、盐(见图2B)和脱水处理(见图2C)均能诱导该基因表达，表明它是一个逆境应答基因。实施例2PtrbHLH基因亚细胞定位、转录激活分析由于PtrbHLH基因有I个核定位信号(NLS)，本研究利用洋葱表皮来研究PtrbHLH基因的亚细胞定位。利用RT-PCR扩增出PtrbHLH基因整个ORF (阅读框)，并在其扩增引物两端分别加上NcoI和SpeI两个酶切位点。首先将扩增产物装在pMD 18-T载体上，从而得到一个 PMD18-TN/s-PtrbHLH 重组载体。同时用 NcoI 和 SpeI 双酶切 PMD18_TN/s-PtrPtrbHLH和pCAMBIA1302，回收产物并连接，从而得到pCAMBIA1302-PtrbHLH_GFP重组载体，并将其转入农杆菌EHA105。农杆菌侵染洋葱表皮按如下方法进行(I)划平板，挑单克隆(含有重组质粒的农杆菌)于3毫升YEB培养基(含卡那霉素40 μ g/ml，利福平25mg/L)，28°C震荡培养24小时,至OD6tltl约O. 6。(2)用手术刀将洋葱内表皮划成Icm2大小,撕下置于MS基本培养基(含3%蔗糖，O. 75%琼脂，不含激素)上暗培养24小时。(3)按体积比为I :1000比例，接种50 μ I农杆菌菌液于50毫升YEB (含卡那霉素40 μ g/ml，利福平25 μ g/ml)中，28°C振荡培养12-24小时。(4) 4000rpm，4°C离心10分钟，弃上清。(5)加入50毫升YEB培养基(含有IOmM MgCl2)，将洋葱表皮放入菌液中浸泡30分钟。(6)吸干表面菌液，置于MS基 本培养基(含3%蔗糖，O. 75%琼脂，不含激素)上28°C暗培养两天。用Olympus BX61型显微镜观察报告基因定位情况，结果表明，对照载体转化时整个细胞中均有荧光(图3A)，而重组载体转化的细胞中荧光只能在核中检测到(图3B)，说明PtrbHLH是一个核定位蛋白。采用PCR扩增PtrbHLH基因ORF (扩增引物5’端和3’端分别加上EcoRI和XhoI两个酶切位点)，扩增产物用EcoRI和XhoI消化后，回收并亚克隆到用EcoR I和XhoI消化的线性pENTR 3C (购自Invitrogen公司)载体上，得到融合载体pENTR 3C-PtrbHLH，再利用重组技术将pENTR 3C-PtrbHLH重组到pDEST 32表达载体上，从而得到融合表达载体pDEST 32-PtrbHLH。测序确认序列无误后将融合表达载体及空载体(pDEST 32)分别转化酵母菌株MV203 (购自invitrogen),然后在不同的缺失培养基上进行培养。结果发现,空载体转化的酵母细胞只能在缺失培养基SD/-Trp上生长(图4A)，在添加了不同浓度的3-AT缺失培养基SD/-Leu/-Trp/-His上完全被抑制，而融合载体转化的酵母细胞能在缺失培养基SD/-Leu/-Trp/-His (含有不同浓度的3-AT)上正常生长(图4B)，表明PtrbHLH具有转录激活活性。实施例3植物转化超表达载体构建根据PMV载体的多克隆位点和PtrbHLH基因的编码区序列上的酶切位点分析，选择SalI和KpnI作为内切酶。首先将以PtrbHLH基因的克隆子为模板进行PCR扩增，再通过TA克隆连接到pMD18-T载体上，从而构建一个重组载体pMD18-T-PtrbHLH。双酶切体系总体积为 40 μ 1，其中含有 pMD18-T-PtrbHLH 质粒 8μ 1、10ΧΜ 缓冲液(购自 Takana) 4 μ UKpnI及XhoI各2μ I、双蒸水24 μ I。在37°C酶切3-4h后纯化回收。pMV载体的双酶切体系同上。连接反应体系中PtrbHLH基因与载体pMV分别为6 μ I和2 μ 1，反应总体积为10 μ 1，10ΧΤ4连接缓冲液I μ 1，Τ4连接酶I μ 1，16°C连接14-16小时。连接产物转化大肠杆菌菌株DH5 α，在含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选，挑单克隆PCR检测呈阳性后抽提质粒进行酶切，测序确定读码框没有突变后，即PMV-PtrbHLH重组载体构建成功。构建完成的载体图见图5。应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体导入到根癌农杆菌EHA105中并保菌。
实施例4烟草遗传转化根癌农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下I.根癌农杆菌培养取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L的LB平板上划线，刮取划线菌斑，加入液体MS基本培养基中，28°C 180转/分钟振荡培养，待菌液浓度达到0D_=0. 3-0. 8时作浸染。2.浸染取未转基因的烟草叶片，切成O. 5cmX0. 5cm大小,然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡8-10分钟，期间不断振荡。3.共培养取浸染后的烟草叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然后接种于共培养培养基上(叶背面向下)，25°C暗培养3天。4.筛选培养经共培养3天后的烟草叶片，用500mgL浓度的头孢霉素溶液洗一遍，然后无菌水冲洗3-5次,再转移入添加了 100mg/L卡那霉素和500mgL头孢霉素的筛选
培养基中。5.生根培养待筛选培养基上的不定芽长到Icm左右时，切下并转入添加了100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培养基上。6.烟草苗转入土培待生根后的转化苗长满培养瓶，由生根培养基中取出，用自来水洗净转化苗上的培养基，并栽植于灭菌的营养土中。烟草转化苗所用培养基见表I。表I烟草转化苗所用培养基配方
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丨工,!,JiifrU-OJ ing/L NAA^HlO nmL Km -5()0 rng^L Ccf7.阳性转基因烟草初步确定按照上述方法得到转PtrbHLH烟草抗性芽，提取DNA。方法如下设计引物NPTII和35S+基因内引物进行PCR扩增鉴定阳性苗。鉴定为可能的阳性植株移栽后独立收获种子(Tl代种子)，4°C春化处理3天，取O. Ig在I. 5ml的离心管中，先用70%酒精浸泡种子20秒，接着用灭菌双蒸水洗一次，再加入Iml 2. 5%NaC10表面消毒7分钟，充分振荡，弃去NaClO后用灭菌双蒸水洗3次,最后用接种针将灭好的种子播于50mg/l具有卡那霉素(Km)MS基本培养基的上，结果表明本发明获得的抗性苗在抗性平板上能正常生长，为绿色，而非抗性苗则黄化死去。成活的植株移栽再收获Tl代种子，T2代种子用于播种及抗性分析。实施例5朽1檬遗传转化I、取柠檬种子，用lmol/L的NaOH浸泡15分钟后洗净，再在超净工作台上用2%(体积比)的次氯酸钠浸泡灭菌15-20min，无菌水洗涤3次再在无菌条件下剥去种皮，接种于MT固体培养基上，暗培养3-4周再光照培养3-5d用于转化。2、农杆菌在含有卡那霉素50mg/L的固体LB培养基上划线，28°C暗培养两天；挑取单菌落接种在新的加有卡那霉素的LB平板上，28°C暗培养2-3天；用手术刀刮下已长好的农杆菌，接种在不加抗生素的液MT培养基中，同时加20mg/L (IOOuM) AS，28°C 200r/min振荡培养2h (同时在这段时间准备切上胚轴)；用分光光度计测量菌液的OD6tltl值，用MT液体培养基调整OD6tltl值到O. 6-0. 8进行侵染。3、取实生苗上胚轴，于超净工作台斜切成1-1. 5cm长茎段，切好的茎段暂时放于灭菌的空三角瓶中(加少量水保湿)，待农杆菌菌液制备完成后用于转化。4、将切好的外植体浸泡在已制备好的农杆菌菌液里，侵染20min，中间摇动几次。侵染完后用无菌吸水纸吸干外植体表面菌液，再接种到共培养基上21-23°C暗处共培养3天。5、共培养3天后，用无菌水洗3-5次，再用无菌吸水纸吸干表面的农杆菌，转到加有卡那霉素50mg/L及头孢霉素400mg/L的筛选培养基上，25°C暗培养4周后再转到光照条件下培养。在筛选培养基上长出抗性芽，当抗性芽>0. 5cm时，再转到伸长培养基上促其伸长。待芽有I. 5cm长时，切下并转入生根培养基诱导生根，柠檬转化过程见图6。 常用培养基配方LB固体培养基蛋白胨10g/l+酵母提取物5gl+NaCl IOgl+琼脂15g/l柠檬生芽及伸长培养基MT+BA1. Omg/1 +琼脂7. 5g/l+蔗糖35gl (pH为5. 8)柠檬生根培养基1/2MT+IBAO. lmg/1+NAA O. 5mg/l+ 活性炭 O. 5g/l+ 琼脂 7. 5g/1+鹿糖 35g/l (pH 为 5. 8)实施例6转化植株分子及生理鉴定I烟草及柠檬叶片DNA提取取适量的叶片放入I. 5mL离心管中，加液氮，充分研磨；然后加入700 μ I 65°C预热的十六烷基三乙基溴化铵(简称CTAB) DNA提取缓冲液(配方100mM Tris-HCl, pH8. 0，
I.5M NaCl, 50mM EDTA, pH 8.0,1% (质量比)聚乙烯吡咯烷酮，2% (质量比)CTAB)，65°C温浴60-90分钟(温浴过程中每15分钟取出离心管上下轻轻颠倒混匀)；10000Xg离心10分钟；取上清，加600 μ I氯仿，颠倒混匀静置3分钟；10000 Xg离心15分钟；取上清450 μ 1，加入900μ I预冷无水乙醇，34μ I 5Μ NaCl，混匀后，冰冻30分钟，10000 X g离心10分钟；弃上清后，用Iml 75% (体积比)的乙醇，洗涤3次后，加适量双蒸水溶解。2阳性转基因植株PCR检测采用引物NPTII和35S上游引物和基因右侧内弓丨物进行PCR扩增。弓丨物序列、反应程序及体系分别见表2、表3和表4。首先采用NPTII引物对烟草再生植株进行PCR鉴定，发现6个转基因株系均能扩增出NPTII基因的片段，利用35S上游引物和基因右侧引物进行PCR，表明选取的5个转基因株系扩增出预期大小的片段(图7A)，表明它们为阳性转基因株系。在柠檬鉴定中，采用NPTII引物对21个再生系进行PCR鉴定，发现13个转基因株系能扩增出NPTII基因的片段(图7B)，利用35S上游引物和基因右侧引物对其中7个系进行PCR，均扩增出预期大小的片段(图7C)，表明它们均是转基因植株。表2、引物序列信息
权利要求
1.一种分离的基因，其特征在于其序列为SEQ ID NO. I所示。
2.—种权利要求I所述的基因在提高植物抗寒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种枳转录因子PtrbHLH及在提高植物抗寒中的应用，以bHLH为关键词搜索柑橘EST数据库(HarvESTCitrusver.0.51)，搜索到17个和bHLH高度同源的EST序列，利用其重叠部分进行拼接，利用拼接软件DNAstart将其拼接成一条序列，序列分析发现拼接后的序列包括一个完整的ORF阅读框，根据这条拼接好的序列作为一个参考序列，设计引物在枳上扩增出基因PtrbHLH利用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草和柠檬，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PtrbHLH基因具有提高抗寒性的功能，突破了传统育种手段的障碍；此外，本发明的基因在多种植物中抗性稳定，为植物抗寒基因工程提供了重要的基因资源。
文档编号A01H5/00GK102719451SQ201210221920
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者刘继红, 黄小三 申请人:华中农业大学