专利名称：一株鸡源浸麻芽孢杆菌及其制备的菌剂和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株鸡源浸麻芽孢杆菌的筛选及其制备的菌剂对鸡肉风味的改善应用，属于生物技术领域。
背景技术：
在厌倦少风味的饲料鸡或圈养鸡后，近年来，人们越来越追求散养下的口感、风味都更优的放养土鸡。后院养鸡作为农户提高经济收入的一种饲养方式。放养鸡在扩大的栖息环境下，足够的自由采食行为增加，不仅降低了饲料消耗，其鸡肉风味也更受到消费者的喜爱。有别于可控制的笼养条件，鸡在放养的环境中能自由接触到各种微生物，它们随着鸡啄食行为的发生进入肠道并定殖下来，对宿主的肠道微环境的形成、稳定、营养物质的吸收或提高饲料利用转化率都有影响。微生物菌剂添加入动物日粮中，益生菌以活的有机体形式对预防外界环境变化是 肠道菌群的紊乱作用明显，研究表明它可直接刺激免疫器官的发育，或使SIgA生物合成增力口，提高消化道黏膜免疫功能。而芽孢杆菌类的抑菌效果已发现有促进家兔机体免疫的作用；另外，芽孢杆菌在生长繁殖过程中产生的短链不饱和脂肪酸能降低肠道的PH值，而有效抑制病原菌的生长；或参与多种营养物质(如维生素、氨基酸、活性酶)的合成，并参与肠道内蛋白质、脂肪、微量元素的代谢，为动物新陈代谢提供能量。对禽肉风味的大量研究揭示，脂肪族芳香化合物对鸡肉风味区别于其他动物风味贡献重大。美拉德反应、脂质降解反应以及它们产生的物质相互作用能产生大量与鸡肉风味有关的挥发风味物。其中，肌肉中不饱和脂肪酸加热产生的许多脂质氧化的产物如2反，4反-癸二烯醛和Y -十二内酯具有较低的风味阈值，对特征性鸡肉风味非常重要。微生物在合成风味成分中发挥着积极的作用。比如乳酸乳球菌(LactococcusIactis)或其他乳酸菌产生了对乳制品的风味非常重要的物质一二乙酰。而谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)能提高卩比嗪类物质的含量,而增加肉中坚果和烘烤的风味。因此，通过对从160日龄健康放养鸡盲肠中分离筛选出的一株浸麻芽孢杆菌，在通过模拟人工胃肠道环境的耐受试验后，按照固体发酵最优化条件制备出粉状微生物菌剂，直接添加入鸡群饲料中，改善上市日龄时(72日龄)动物个体鸡肉风味指标的应用意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一株从鸡盲肠内容物中分离筛选出的、并通过模拟人工胃肠道环境耐受试验的浸麻芽孢杆菌，并对该菌株以饲料原料为培养基的固体发酵条件优化，制备得到含浸麻芽孢杆菌活菌的微生物菌剂以及对改善鸡肉风味上的应用。一株鸡源浸麻芽孢杆菌，保藏编号=CGMCC NO. 6573。所述的鸡源浸麻芽孢杆菌制备的菌剂，制备方法包括以下步骤(1)种子培养将所述的鸡源浸麻芽孢杆菌菌株，在无菌条件下用接种环接I 2环于40ml液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37°C恒温摇床培养48h，得一级种子液；以接种环接2 3环于同样配方的液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37°C恒温摇床培养36小时，得二级种子液；(2)固体发酵培养以3% 10%质量比的接种量，将二级种子液接种于经121°C、30分钟灭菌的固体培养基中，按照料水比I : O. 9-1. 5 g/ml和容量比为8% 24%在发酵瓶进行混合后，置于恒温培养箱上，控制环境温度在35 42°C，并用带4层灭菌纱布封口 ；时常拍打发酵瓶壁，使上、中、下料舒散、混合，发酵72小时，发酵结束；(3)发酵产物晾干将发酵产物于干净搪瓷盘，加入两倍量饲用玉米粉(过40目筛)混合均匀，平摊散开放置于通风处自然风干，当含水率低于10%时结束风干过程，收集产物并粉碎，过40目筛，所得粉末即为含浸麻芽孢杆菌活菌的固体发酵成品。所述固体培养基的配方，按质量百分含量计2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化钠，O. 5%牛肉膏，I. 7%琼脂粉，加灭菌水至完全溶解，调节pH至6. 8 7，高压121 °C灭菌30分钟后冷却备用；
所述液体培养基的配方，按质量百分含量计2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化钠，
O.5%牛肉膏，加灭菌水至完全溶解，调节pH至6. 8 7，高压121°C灭菌30分钟后冷却备用；上述固体发酵培养基配方及制备方法为以百分比计，将玉米、豆柏、麦麸打碎过40目筛，按照玉米600g，豆柏300g，麦麸50g，高压115°C灭菌15分钟，冷却后无菌条件下加磷酸缓冲液1000ml,自然pH即可。所述菌剂的应用，育雏阶段按O. 15wt%浸麻芽孢杆菌微生物菌剂添加入饲料中；育成阶段到上市日龄按O. lwt%浸麻芽孢杆菌微生物菌剂添加入饲料中。本发明从160日龄成年放养公鸡的盲肠内容物中分离筛选出一株浸麻芽孢杆菌，并优化菌株的固体发酵条件以提高有效活菌数的含量，每克固体发酵成品中浸麻芽孢杆菌活菌数达到6. 9X 109CFU/mL ;将该微生物菌剂添加到禽饲料中，饲喂笼养鸡群以开发出风味更佳的鸡肉。本发明通过从健康成年160日龄放养公鸡的盲肠内容物分离出一株浸麻芽孢杆菌。在经历人工胃肠道环境耐受选择后，优化该菌株的固体发酵条件并生产出含足够活菌数的浸麻芽孢杆菌微生物菌剂。本发明将微生物活菌制剂直接添加入饲料，笼养鸡肉中具有特征“鸡香味”挥发性风味组分和含量得到了显著地提高。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I :(I)宿主选择从散养鸡农户处选购一只健康的160日龄公鸡；除饲喂基础日粮夕卜，动物个体在充足的户外活动中自由觅食；(2)菌种分离与筛选分离自散养鸡盲肠内容物；取2g内容物置于80°C恒温水浴锅内IOmin后，直接涂抹于芽孢杆菌固体培养基上，37°C培养24小时；将芽孢杆菌固体培养基上生长所占比例最高的单个菌落重新接种在新的芽孢杆菌固体培养基上，37°C培养24小时；(3)菌株保藏步骤(2)筛选得到的浸麻芽孢杆菌SCS3菌株已于2012年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC NO. 6573,分类命名浸麻芽孢杆菌Bacillus macerans。(4)人工胃液耐受试验将(3)所述菌株，在无菌条件下按照系列稀释法在pH2 4的人工胃液中培养2小时，并进行稀释平板计数计算活菌数，以O小时活菌数为参照；人工胃液配方为依据中国药典2010版，取稀盐酸16. 4毫升，加水约800毫升与胃蛋白酶10克，摇匀后，加水稀释成1000毫升即得，放入4°C冰箱备用；(5)菌落计数以系列稀释法进行平板计数，结果为(3)所述菌种浸麻芽孢杆菌经人工胃液耐受试验后活菌数在PH2人工胃液中培养O小时后活菌数为2. 12X IO6CFU/mL，两小时后活菌数为2. 34 X 106CFU/mL ;在pH3人工胃液中培养O小时后活菌数为
3.lX106CFU/mL，两小时后活菌数为I. 3X106CFU/mL ;在？財人工胃液中培养O小时后活菌数为3. 3X 106CFU/mL，两小时后活菌数为2. 45 X 106CFU/mL。(6)人工胰液耐受试验将(3)所述菌株，在无菌条件下按照系列稀释法再人工肠液中培养O 3小时，并进行稀释平板计数计算活菌数，以O小时活菌数为参照。人工胰液配方为依据中国药典2010版，取磷酸二氢钾6. 8克，加水500毫升溶解，用O. 4%氢氧化钠回调pH至6. 8，每100毫升液体加入I克胰蛋白酶，混匀，用O. 2微米的无菌滤头过滤后即得，放入4°C冰箱备用。(7)菌落计数以系列稀释法进行平板计数，结果为上述步骤(3)所述菌种浸麻芽孢杆菌经人工胰液耐受试验后活菌数在O小时培养后为2. 6X 107CFU/mL，培养2小时后为 I. 52X 107CFU/mL，培养 3 小时后为 3. 6 X 107CFU/mL。(8)人工胆盐溶液耐受试验将(3)所述菌株，在无菌条件下按照系列稀释法再0% O. 3%四个浓度梯度的人工胆盐溶液中培养O 4小时，并进行稀释平板计数计算活菌数，以0%浓度下培养O小时的活菌数为参照。人工胆盐溶液配方为依据中国药典2010版，称取I. 5克猪胆盐加入到有100毫升O. 5%灭菌氯化钠溶液的三角瓶中，再加入O. I克胰蛋白酶，摇匀，调pH值至7. O,即制备成含胆盐I. 5%的胆盐溶液，放入4°C冰箱备用；(9)菌落计数以系列稀释法进行平板计数，结果为(3)所述菌种浸麻芽孢杆菌经人工胆盐溶液耐受试验后活菌数在O. 1%浓度人工胆盐溶液培养O小时后为7. 8X107CFU/mL,培养4小时后为4. 6 X 107CFU/mL ;活菌数在O. 2%浓度人工胆盐液培养O小时后为5. OXlO7 CFU/mL,培养4小时后为I. 4 X IO7 CFU/mL ;在O. 3%浓度人工胆盐液培养O小时活菌数为5. OX 107CFU/mL，培养4小时后为2. 9 X 106CFU/mL。(10)浸麻芽孢杆菌种子培养将(3)所述浸麻芽孢杆菌SCS3斜面活化(芽孢杆菌固体培养基按百分含量计，2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化钠，O. 5%牛肉膏，I. 7%琼脂粉，力口灭菌水至完全溶解，调节pH至6. 8 7，高压121°C灭菌30分钟后冷却，置于37±2°C生化培养箱培养18h ;在无菌条件下用接种环接I 2环于40ml液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37°C恒温摇床培养48h，得一级种子液；以接种环接2 3环于同样配方的液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37°C恒温摇床培养36小时，得二级种子液。菌落计数以系列稀释法进行平板计数，二级种子液活菌含量为6. OX 109CFU/mL的发酵液。
上述液体发酵种子培养基及制备方法为按百分含量计，2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化钠，O. 5%牛肉膏，加灭菌水至完全溶解，调节pH至6. 8 7，高压121 °C灭菌30分钟后冷却备用。实施例2 (I)菌种于2012年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCCNO. 6573,分类命名浸麻芽抱杆菌Bacillus macerans。(2)种子培养将步骤(I)所述菌株，在无菌条件下用接种环接I 2环于40ml液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37°C恒温摇床培养48h，得一级种子液；(3)以接种环接2 3环于同样配方的液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37°C恒温摇床培养36小时，得二级种子液。 (4)固体发酵培养将步骤(I)所述浸麻芽孢杆菌以5%质量比的接种量，将二级种子液接种于经121°C、30分钟灭菌的固体培养基中，按照料水比为1:1. I g/ml和容量比为16%接入发酵瓶，混合后置于生化培养箱内，并用带4层灭菌纱布瓶口，温度控制为42°C ;时常拍打发酵瓶壁，使培养基舒散、上下料混合，发酵72小时，发酵结束；(5)发酵产物晾干将步骤(4)发酵产物于干净搪瓷盘，加入两倍量饲用玉米粉(过40目筛)混合均匀，平摊散开放置于通风处自然风干，当含水率低于10%时结束风干过程，收集产物并粉碎，过40目筛，所得粉末即为含浸麻芽孢杆菌的固体发酵成品。(6)菌落计数利用系列稀释法对含浸麻芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，结果为浸麻芽孢杆菌微生物菌剂的有效活菌数为6. 9 X IO9/克发酵成品。上述液体发酵种子培养基及制备方法为按百分含量计，2%葡萄糖，1%蛋白胨，
0.5%氯化钠，O. 5%牛肉膏，加灭菌水至完全溶解，调节pH至6. 8 7，高压121 °C灭菌30分钟后冷却备用。上述固体发酵培养基及制备方法为以百分比计，将玉米、豆柏、麦麸打碎过40目筛，按照玉米600g,豆柏320g,麦麸50g,高压115°C灭菌15分钟,冷却后无菌条件下按I :
1.I g/ml加磷酸缓冲液，自然pH即可。实施例3 本发明发酵产品的动物试验使用效果。本实例在四川农业大学家禽育种场进行，选择健康I日龄雏鸡60只(公鸡)，随机分成2个处理，每个处理2个重复，每个重复15只雏鸡，分别为空白对照组和本发明浸麻芽孢杆菌发酵组，试验期72天；本发明浸麻芽孢杆菌发酵组本发明含浸麻芽孢杆菌活菌的发酵微生物菌剂，活菌数> IO9CFU/克，育雏阶段(I日龄 42日龄)按O. 15被％浸麻芽孢杆菌微生物菌剂添加入饲料中；育成阶段到上市日龄(43日龄 72日龄)按O. lwt%浸麻芽孢杆菌微生物菌剂添加入饲料中；屠宰与鸡胸肉的收集达到72日龄时，从空白对照组和本发明浸麻芽孢杆菌发酵组随机抽出6只健康鸡(每个重复3只);经放血、去羽毛后，统一取整块左胸肌肉；每个个体的鸡胸肉取4克，绞碎后装袋、标记后放入_20°C保存；整个屠宰取样过程在I小时内完成。鸡胸肉风味测定前准备将鸡胸肉样本放置于4°C冰箱，熟化过夜；带标记的重复组内两个体的鸡胸肉混合成一个测定样本，即两个试验组共有4个测定样本。鸡胸肉风味测定采用顶空固相微萃取技术萃取鸡胸肉中挥发性物质，并用气相色谱-质谱联用技术分析鸡胸肉中挥发性成分和含量；
鸡胸肉风味结果与分析表I.本发明浸麻芽孢杆菌发酵组和空白对照组鸡胸肉中挥发性风味成分的比较
权利要求
1.一株鸡源浸麻芽孢杆菌，保藏编号CGMCC NO. 6573。
2.根据权利要求I所述的鸡源浸麻芽孢杆菌制备的菌剂，其特征在于，制备方法包括以下步骤(I)种子培养将所述的鸡源浸麻芽孢杆菌菌株，在无菌条件下用接种环接I 2环于40ml液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37°C恒温摇床培养48h，得一级种子液；以接种环接2 3环于同样配方的液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37°C恒温摇床培养36小时，得二级种子液； (2)固体发酵培养以3% 10%质量比的接种量，将二级种子液接种于经121°C、30分钟灭菌的固体培养基中，按照料水比I : O. 9-1. 5 g/ml和容量比为8% 24%在发酵瓶进行混合后，置于恒温培养箱上，控制环境温度在35 42 °C，并用带4层灭菌纱布封口 ；时常拍打发酵瓶壁，使上、中、下料舒散、混合，发酵72小时，发酵结束； (3)发酵产物晾干将发酵产物于干净搪瓷盘，加入两倍量饲用玉米粉(过40目筛)混合均匀，平摊散开放置于通风处自然风干，当含水率低于10%时结束风干过程，收集产物并粉碎，过40目筛，所得粉末即为含浸麻芽孢杆菌活菌的固体发酵成品。
所述固体培养基的配方，按质量百分含量计2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化钠，O. 5%牛肉膏，I. 7%琼脂粉，加灭菌水至完全溶解，调节pH至6. 8 7，高压121°C灭菌30分钟后冷却备用； 所述液体培养基的配方，按质量百分含量计2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化钠，O. 5%牛肉膏，加灭菌水至完全溶解，调节pH至6. 8 7，高压121°C灭菌30分钟后冷却备用； 上述固体发酵培养基配方及制备方法为以百分比计，将玉米、豆柏、麦麸打碎过40目筛，按照玉米600g，豆柏300g，麦麸50g，高压115°C灭菌15分钟，冷却后无菌条件下加磷酸缓冲液1000ml，自然pH即可。
3.根据权利要求2所述菌剂的应用，其特征在于，育雏阶段按O.15#%浸麻芽孢杆菌微生物菌剂添加入饲料中；育成阶段到上市日龄按O. lwt%浸麻芽孢杆菌微生物菌剂添加入饲料中。
全文摘要
本发明公开了一株鸡源浸麻芽孢杆菌及其制备的菌剂和应用，鸡源浸麻芽孢杆菌保藏编号CGMCC NO.6573。育雏阶段按0.15wt%浸麻芽孢杆菌微生物菌剂添加入饲料中；育成阶段到上市日龄按0.1wt%浸麻芽孢杆菌微生物菌剂添加入饲料中。本发明通过从健康成年160日龄放养公鸡的盲肠内容物分离出一株浸麻芽孢杆菌。在经历人工胃肠道环境耐受选择后，优化该菌株的固体发酵条件并生产出含足够活菌数的浸麻芽孢杆菌微生物菌剂。本发明将微生物活菌制剂直接添加入饲料，笼养鸡肉中具有特征“鸡香味”挥发性风味组分和含量得到了显著地提高。
文档编号A23K1/16GK102899274SQ201210430869
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者孙静, 刘益平, 李念珍, 熊彦, 朱庆, 钟航 申请人:四川农业大学