专利名称：贮存红细胞的组合物和方法
贮存红细胞的组合物和方法本申请是申请日为2005年2月17日，申请号为200580049506.0的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。John R.HessTibor J.Greenwalt关于联邦赞助的研究或发展的声明本工作的一部分在美国 军队合约DAMD17-95-C-5029下进行，美国政府在此可以孚有所有者权益。
背景技术：
本发明主要涉及与贮存红细胞(RBCs)有关的组合物和方法。特别涉及改进RBC贮存的组合物和方法以及其应用。贮存和保存红细胞(RBCs)用于其后再灌注到患者体内的能力是一种相对新近的作为现代外科实践先驱的科技发展。这种保存在科学上是棘手的，而且实现长期贮存并得到高质量的再灌注用红细胞的步骤也已经越来越多。一旦从捐赠人处收集到红细胞，它们便开始死亡因为它们会凝结、饥饿、失去ATP、2，3-DPG、膜表面积和完整性，以及血色素(Hb)。Rous&Turner在1916年以及Robertson在1917年首先成功示范了全血的忙存。后来，柠檬酸葡萄糖(ACD，1943)，其含有作为抗凝剂的柠檬酸盐和作为被红细胞利用的唯一养料右旋糖，以及柠檬酸盐磷酸盐右旋糖溶液(CPD，1957)，其中加入了磷酸盐作为代谢来源并用于膜固定，被认可用于贮存全血21天。含有腺嘌呤的CPD(CPDA-1，1979)随后被引入并能将被贮存的全血和浓缩RBCs (packed RBCs)的贮存期延长至5周。最初，贮存组合物被设计为酸性的以防止葡萄糖在最后生产步骤中的热消毒期间被焦糖化。在20世纪50年代，腺嘌呤被发现能作为添加剂并代替脱氨化引起的腺嘌呤损失。在20世纪70年代，为了血小板和生产血浆衍生物，开始期望从收集的全血中除去血浆。然而，这会导致所得“浓缩RBC(packed RBC) ”的回收率下降。为了防止这种情况发生，开发了本领域已知的作为添加溶液(AS)的组合物以补偿容量、营养素和其它有用的RBC稳定剂。有必要对用于保护从全血中分离后红细胞(RBCs)的添加溶液组合物进行特别调整以使其符合RBCs的需要。1981年开发了特定的添加溶液将RBC的贮存期延长到6周。然而，贮存在这个溶液中的红细胞(RBCs)在约6周后却出现了稳定的退化，因为在再灌注到人供体后24小时的循环中存活的这种细胞有75%都被确定是没用的。已经发现在连续的冷冻贮存期间，葡萄糖以渐减的速率被消耗，因为代谢废物，即乳酸和氢离子的浓度在增加。这种葡萄糖代谢速率的下降导致三磷酸腺苷(ATP)耗损，这在细胞重返循环时与RBCs的复原(recovery)直接相关。设计了添加溶液例如Adsol.RTM(AS-1) ,Nutricel RTM(AS_3)、0ptisol RTM(AS_5)和 ErythroSol RTM 用于下延长在1-6°C下RBCs的贮存期。最近在美国批准的所有这些ASs，AS-1, AS-3和AS-5，都包含盐水、腺嘌呤、葡萄糖和一些柠檬酸盐和/或甘露糖醇作为“膜保护剂”。AS-3还包含磷酸二氢钠。每个美国批准的ASs都符合贮存RBC6周的许可要求，但是不能贮存7周。目前批准的RBC添加溶液组合物已经在知晓RBC贮存损伤(在此定义为RBCs贮存中对存活和/或功能限制的总和)是一种细胞凋亡过程前就被开发了。目前几乎所有的收集全血都被制成组份，RBC部分以浓缩RBCs的形式被贮存。为了将血引入到添加溶液系统中，我们通过冷冻将RBCs浓缩，除去血浆以使RBCs占80%的体积，然后无菌地加入IOOml添加溶液。所得悬液的RBC体积部分约占55%。贮存在一般FDA-认可的添加溶液中的RBCs仅能被贮存6周，有24小时的体内可接受复原。为了增加在贮存一段时间后再灌注到患者体内RBCs的体内可接受复原时间，已经试图改进了添加溶液和贮存方法。在“红细胞保存的研究_7。改进的磷酸铵添加溶液的体内和体外研究”中，Greenwalt等，Vox.Sang.65:87-94 (1993)，作者确定，实验性添加溶液(指定为EAS-2)，其含有(mM):20NH4Cl、30Na2HP04、2腺嘌呤、110右旋糖、55甘露糖醇，在PH7.15下形成，能用于延长人RBCs的贮存期限，从目前5-6周的标准到增加到8_9周的改进标准。然而，贮存在EAS-2中的浓缩RBCs不能直接注入而需要用在输注前经洗涤步骤除去上清液，因为添加溶液中存在铵。在“红细胞保存的研究_8。在含有甘油的添加溶液中红细胞的液态贮存”中，Vox.Sang.67:139-143(1994)，Greenwalt等，记载了能在九周后复原73%浓缩红细胞的添加溶液(指定为EAS-25)。然而，所得的RBC单元包含约I %的甘油，这对于大剂量的人体输注是不安全的。在“4°C下延长红细胞忙存”中，Transfus.Sc1.15:105-115 (1994) ,Meryman 等，证明了贮存在非常淡的悬液中以低红细胞比容存在27周RBCs有可接受的存活力。然而,这种贮存RBC的悬液不能被直接输注所接受因为它们的钾和氨含量高且RBCs体积部分低。用于贮存200mLRBC且需要产生实测有益效果的5L溶液在临床上是不可行的。就能被批准和可商购的产品而言，目前美国批准的添加溶液仅起效6周，平均复原约80%。目前欧洲批准的两种添加溶液 起效约7周，平均复原77% (ErythroSol fromBaxter Healthcare, La Chatre, France)和 75% (PAGGS mannitol from Maco Pharma)。Kurup etal.(Vox Sang2003:85 =253-261)目前记载的新溶液预期可能有更短的贮存期，因为ATP浓度低。针对现有技术中的不足，本发明的发明人开发了含有低容积磷酸氢二钠的碱性实验添加溶液(EASs)，其能部分中和收集血对酸性抗凝剂溶液例如CPD (柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖)的作用，并显示这些EASs能改善RBC ATP浓度，降低溶血，并降低RBC膜的形态变化和损失(参见美国专利6，150，085和6，447，987，Hess and Greenwalt，在此通过参考的方式将其公开内容全部引入)。各种EASs都支持9到12周的贮存期。尽管这些EASs产生了较高的性能结果，但是它们包含氯化钠并被制成相对大的体积致使被贮存RBC被更多地稀释，这样在输注到患者受体时就增加了血液被稀释的危险性。此外，氯化钠的存限制了缓冲盐和磷酸盐的溶解量使该系统能维持预期的体积。当有较高的时间要求而且还是间断的时间要求时，例如战争时，以及在间断地、分散地需要输注血液的地理区域中，提高RBC的贮存时间就显得非常重要。事实上，假设据报道目前的损耗水平是由于RBCs通常在实际应用以前就过了安全贮存期，因此提高RBCs的安全贮存时间就是人们目前普遍关心的问题。因此，需要在低体积常规添加溶液中能保持或提高RBC复原及性能的RBC贮存组合物。在血液贮存和输注领域中仍然有改善RBC贮存的需求，这能使贮存时间延长，复原百分率更高，且改善了输注RBC的生理功能。因此，仍然需要改进RBC贮存的组合物以及生产方法。还需要添加组合物，这种组合物能使加入该组合物的RBC悬液可被直接输注到人体中，并能允许活性RBCs在输注后有可接受的复原性，其中活性RBCs拥有增强的生理功能并且降低了在被输注患者循环中的清除率。发明简沭因此，本发明提供了适于贮存和保存被收集红细胞的新的组合物。本发明的发明人意外地发现，从这种组合物中基本上除去氯化钠(之前这被认为是正确制备贮存组合物所必须的)能提供用于增强的PH调节系统的高性能组合物，这对贮存红细胞以及随后的再输注红细胞的完整性和生理功能性质都是有益的，而且鉴于时间的延长，RBCs在贮存时就可以保持符合相关法律规定的复原性和溶血水平。此外，本发明组合物在常规体积下保持了较好的性能，这使得它们特别适于贮存红细胞，其中红细胞可以是多次或大量输注给患者的。本发明的一个实施方案提供了用于在约I到约6°C下贮存红细胞的组合物。该组合物主要由以下物质组成:腺嘌呤、右旋糖、至少一个不可代谢的膜保护剂糖，和pH缓冲系统。pH缓冲系统含有碳酸氢钠和磷酸氢二钠并以足够使pH为约8到约9的量存在。该组合物能保持红细胞(RBC)悬液的pH，其中该组合物以在贮存期间足够在红细胞中建立并保持下述反应平衡的量被加入到悬液中，所述平衡是一种抑制从I，3-DPG合成2，3- 二磷酸甘油酯(DPG)而有助于糖酵解的平衡，由此在贮存期间的反应平衡中产生了三磷酸腺苷(ATP)的净收益。本发明的另一个实施方案提供了基本上不含氯化钠的组合物。本发明更具体的实施方案是提供特定的组份及其含量，摩尔渗透压浓度范围和组合物的pH。其它具体 实施方案是针对能使红细胞的pH保持在特定数值范围内的本发明组合物。本发明的另一个实施方案是提供含有本发明组合物的红细胞悬液。还提供了方法实施方案。一个这样的实施方案是针对在贮存期间保存红细胞(RBCs)的方法。该方法包含:(a)将含有需有待贮存的RBCs和血浆的被收集全血样品与抗凝血剂溶液混合，由此形成所收集的全血的悬液；(b)对所收集的全血的悬液进行处理以除去血浆并浓缩RBCs，由此形成浓缩RBCs ； (c)将袋装RBCs与一定量的组合物混合，该量足以形成有约35%到约70%体积RBCs的RBCs悬液；(d)冷却RBCs悬液到约I至约6°C ；以及(e)根据标准存储步骤贮存冷却的RBCs悬液。该组合物主要由以下物质组成:腺嘌呤；右旋糖；至少一个不可代谢的膜保护剂糖；和PH缓冲系统。该pH缓冲系统包含碳酸氢钠和磷酸氢二钠并以足够使组合物的PH为约8到约9的量存在。该组合物能保持红细胞(RBC)悬液的pH，其中该组合物以在贮存期间足够在红细胞中建立并保持反应平衡的量被加入到悬液中，这种平衡是一种抑制从1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有助于糖酵解的平衡，由此在贮存期间的反应平衡中产生了三磷酸腺苷(ATP)的净收益。还提供了更具体的实施方案。还提供了另外的实施方案，它是针对使用本发明组合物以在贮存期改进红细胞(RBC)的膜维持和抑制RBC凋亡的方法，以降低贮存期红细胞(RBC)的脆弱性并抑制RBC溶血，以及提高随后进入贮存期和输注到需要这种输注的患者体内后红细胞(RBC)的存活力，并降低患者输注后对RBC的清除率。
根据本发明生成的组合物和RBC悬液为RBCs提供了这样一种贮存期，即在整个贮存期内，有充足治疗量的RBCs是可复原的并且能直接输注到患者体内而无需用建立和验证RBCs输注的已知标准方法进行处理。本发明的这些和其它实施方案以及各个方面将通过参考附图简述、对以下提供的优选实施方案和实施例的详述而得到更充分的理解。附图筒沭
图1:是表示RBCs贮存效果的混合(pooling)研究结果的图解表示，以时间(星期)为函数，涉及4个不同的添加溶液组合物:l)AS-3，体积IlOmL, (- O -) ;EAS_61，体积170mL(- -) ；EAS-78,170mL, (-.-);和 EAS-81，IlOmL,(-〇-)。含有碳酸氢盐的组合物，以圆圈表示，与不含碳酸氢盐的等体积组合物(以菱形表示)相比，产生了较高的ATP浓度，如图A所示。这些组合物还涉及较高的乳酸盐浓度(图D)，较高的胞外和胞内pH(图E和F)，以及较高的碳酸氢盐和PCO2浓度(图E和F)。体积较大的组合物，以实心图表示，说明溶血降低和贮存的红细胞比容降低，这分别在图B和C中予以说明。图2:说明将贮存在EAS-81中6周(n = 6), EAS-81中8周(η = 6)的RBCs再输注到受试者体内后24小时取样的红细胞在体内的复原性，与以往的对照进行比较，对AS-3的许可实验由Simon等在1985年公布。这两个研究均使用了 51Cr单-标签法(single-labelmethod)。 Licensure study优选实施方案的描述本发明涉及与红细胞(RBC)贮存有关的组合物和方法。特别涉及新的的添加溶液组合物和与贮存RBCs相关的方法，其中RBCs已经从全血中分离出来，其中全血在柠檬酸盐磷酸盐右旋糖(CPD)溶液中，其变体，柠檬酸磷酸盐双重右旋糖(CP2D)溶液中收集，或在酸性柠檬酸盐右旋糖(ACD )或类似溶液中通过提取(Aphaeresis)(从患者或供体中除去全血)收集。 就本发明的目的来说，在此使用的术语“复原”指在再灌注到最初的人供体后，在循环中保留24小时的贮存RBCs部分。在此使用的“氯化物”指的是阴离子氯化物。因此，术语“氯化物”包括阴离子氯化物及其盐形式，例如可以由氯化物阴离子和生理上可接受的阳离子形成。术语“氯化物”不包括其中氯原子是以共价键联接到例如有机分子中碳原子上的化合物。在此使用的短语“生理上可接受的缓冲剂”指的是能产生阳离子和阴离子的缓冲齐U，其中该离子一般可见于人的血、血浆或血清中，或当引入人体时能被耐受。适宜的阳离子包括质子、铵阳离子和金属阳离子。适宜的金属阳离子包括但不限于钠、钾、钙和镁阳离子形式，其中优选钠和钾，更优选钠。铵阳离子，即式R4N+化合物，其中R是氢或有机基团，只要是生理上可接受的就能被使用。在优选的实施方案中，阳离子选自氢(即质子)、钠、钾、钙、镁及其组合。在此使用的“缓冲剂”指的是能调整和调节组合物PH的试剂。在此公开的本发明组合物是含水的，即它们在水中形成。本发明优选的水是被处理的以便基本上不含热原(即灭菌)。在此使用的“mEq/L”指的是与水存在量成比例存在的特定成分(溶质)的浓度。更具体为，mEq/L指的是每升水中溶质的毫当量数。每升的毫当量通过以下方法计算，将溶质的每升摩尔数与每分子溶质的电荷种类(组)数相乘，然后乘以因子1，000。
本发明的一个实施方案提供了用于在约I到约6°C下贮存红细胞的含水组合物。该组合物主要由以下物质组成:腺嘌呤；右旋糖；至少一个不可代谢的膜保护剂糖，和PH缓冲系统。该PH缓冲系统含有生理上可接受缓冲剂的组合物，并且必须包括至少一个能提供碳酸氢根阴离子的试剂，至少一个能提供磷酸根阴离子的试剂和至少一个能提供钠阳离子的试剂。本发明预期，单个缓冲盐可以满足这些要求中的一个以上。已知在红细胞的保存领域中，红细胞悬液系统中的ATP浓度是与身体健康最相关的。红细胞经糖酵解通过d-葡萄糖(右旋糖)的糖分解转化最终产生乳酸盐，由此产生ATP。因此，乳酸盐的浓度曲线也就是ATP合成的良好指示剂。不管系统的保存力如何，红细胞的寿命都是有限的而且收集的红细胞包括红细胞年龄的正态分布并接近于自然死亡。由于没有新的RBCs进入保存系统，因此对最大贮存期就产生了限制，其中该最大贮存期将提供再灌注后必要的复原百分比。因此，尽管系统在整体上产生ATP的能力将随时间下降；但是一般能看到加入添加液体后最初是升高的因为它提供了比自然浓度高的营养素，而且RBC最初经历了 “溶胀”，这也与ATP利用下降有关。不囿于任何理论，我们发现，当贮存在根据本发明的添加溶液中时，营养素溶液的体积增加能使底物数量增加以便能以可接受的浓度被输送，而且提供了用于稀释代谢废物的溶质由此降低了葡萄糖代谢的反馈抑制。更进一步假定，本发明添加溶液的另一个特征是它们最初能产生溶胀的RBCs随后在贮存期间红细胞体积逐渐降低。这个过程已经被称为“调节性体积降低”。假定在这个过程中，RBC中酪氨酸磷酸酶的活性被抑制，或者酪氨酸激酶被激活。已证明这两个酶在这些细胞的膜中是很大量的(Zipser, Y.andKosower, N.S.(1996)Biochem.J.314:881 ；Mallozzi C.等(1997)FASEB J.11:1281)。预期RBC膜上带3蛋白的纯磷酸化将导致从其与带3的结合状态中释放细胞质内的磷酸果糖激酶、醛缩酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Harrison, M.L.等(1991) J.Biol.Chem.266:4106 ；Cossins, A.R.and Gibson J.S.(1997) J.Exper.Biol.200:343 ；Low, P.S.等(1993)J.Biol.Chem.268:14627 ；Low,P.S.等(1995) Protoplasmal84:1961)。糖酵解途途径中这三个酶的有效性将预期能提高RBC的葡萄糖代谢，由此促进了 ATP的合成水平和RBCs中ATP的浓度。因此，制备添加溶液组合物的目的是将ATP的合成在尽可能长的时间内保持在较高的速率上。本发明的发明人发现，将系统的ATP合成保持在最大化的关键是将胞内RBC的pH保持在尽可能接近7.2的水平上，尽可能达到而不必完全达到。在贮存期间，ATP浓度的特点是保持在一定水平上或甚至是在贮存的早期升高然后下降。当RBC ATP浓度下降到2 μ mol/g Hb以下时，RBC的复原一般就低于75%。RBC在贮存早期损失2，3-DPG。起始浓度的特点是为约15ymol/g Hb或约1.1 μ mol/g Hb。在7到10天内，浓度一般下降到起始量的十分之一。2，3-DPG的合成速率是pH的函数，在pH大于7.2时出现但在低于这个pH时就下降。通过增加贮存系统的PH来提高2，3-DPG合成的尝试已经被限制了，因为伴随每个2，3-DPG分子的形成都会一摩尔一摩尔地损失ATP的合成。因此，增加RBC的2，3_DPG浓度，这在以前就被认为是所期望的，事实上是倾向于降低RBC的贮存时间。更偏酸性的环境降低了 RBC的代谢。7.2的pH是关键，其中触发了一种机理，其已知是Rappaport 旁路(参见Hess等"碱性CPD和红细胞2，3-DPG的保存"(2002)Transfusion, 42:747_752，在此通过参考全部引入)，其中2,3-DPG由1，3_DPG合成，消耗了合成ATP所需的磷酸盐，另外还有糖酵解步骤，该步骤生成了由糖酵解产生的两个ATPs。系统的纯作用是损耗ATP。如果胞内pH能保持在7.2以下，那么该旁路就被有效地关闭，ATP合成也就被最大化。在自然状态下，该旁路发挥了一定程度的作用，一些2，3-DPG的产生和保持相对于其它细胞事件是重要的。然而，本发明的发明人发现，在体内以外的环境中贮存时，出于对红细胞保护的目的，期望能将这种旁路作用最小化。因此，本发明组合物的实施方案就提供了以足够满足以下条件的量存在的pH缓冲系统:其中该组合物以在贮存期间足以在红细胞中建立并保持下述反应平衡的量被加入到悬液中，上述平衡是一种抑制从1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有助于糖酵解的平衡，由此在贮存期间的反应平衡中产生了三磷酸腺苷(ATP)的净收益。本发明组合物的具体实施方案提供了能保持RBC悬液pH的组合物，其中该组合物已经以约6.4到7.4的PH值被加入到悬液中。在更具体的实施方案中，该组合物能保持红细胞(RBC)悬液的pH值，其中该组合物已经以7.0到低于约7.2的pH被加入到悬液中。在更具体的实施方案中，该组合物能保持红细胞(RBC)悬液的pH值，其中该组合物已经以大于约7.1到小于7.2的pH被加入到悬液中。本发明的发明人已经制备了基本上不含氯化物的添加溶液组合物，其令人惊奇地没有对系统产生负性作用并允许额外增加缓冲系统的量以提供额外的PH缓冲。本发明的一个实施方案是针对用于在约I到约6°C下贮存红细胞的含水组合物。这个组合物包含:腺嘌呤；右旋糖；至少一个不可代谢的膜保护剂糖，和PH缓冲系统。该pH缓冲系统含有生理上可接受缓冲剂的组合，其中缓冲剂包括至少一个能提供碳酸氢根阴离子的试剂，至少一个能提供磷酸根阴离子的试剂，和至少一个能提供钠阳离子的试剂。其中，所述的PH缓冲系统以足以使有待加入上述组合物的红细胞(RBC)悬液的pH维持在下述水平的量存在，所述的水平足以在贮存期间，在所述红细胞中建立并维持一种抑制1，3-DPG合成2，3- 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反应平衡，由此在贮存期间的反应平衡中产生三磷酸腺苷(ATP)净收益。该组合物基本上不含外源性的氯离子。在此使用的“基本上不含外源性的氯离子”的定义是不论氯离子是否是被提供的，都没有氯离子被加入到组合物中。另外的实施方案是针对含有任何本发明组合物的红细胞悬液，以及其中悬液适于直接输注到需要这种输注的患者中的实施方案。本发明组合物的其它实施方案提供的是，至少一个能提供钠阳离子的试剂，其选自碳酸氢钠、磷酸氢二钠及其组合。在更具体的实施方案中，能提供碳酸氢根阴离子的至少一种试剂是碳酸氢钠。另外的实施方案提供了能提供磷酸根阴离子的至少一种试剂，其选自磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸钠及其组合。在更具体的实施方案中，能提供磷酸根阴离子的至少一种试剂是磷酸氢二钠。在本发明组合物的其它实施方案中，生理上可接受缓冲剂的组合还含有至少一个能提供生理上可接受阳离子的试剂，其中阳离子选自H+、钾、铵、镁及其组合。在本发明组合物的另一个实施方案中，至少一个非代谢的膜保护剂糖是甘露糖醇。一些糖醇，特别是衍生自单糖的糖醇(例如山梨醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇)，是能容易地扩散过一些类脂屏障并可能在细胞稳定性中发挥重要作用的亲水性小分子。特别是甘露糖醇，它是已知的在体内作为羟基清除剂的抗氧剂。它在维持细胞膜稳定性中发挥了主要作用并被认为是膜保护 剂糖。其它的小多元醇也可以作为膜保护剂糖。值得注意的是，葡萄糖和甘露糖醇有相同的分离量，即180g/摩尔。糖醇不会被红细胞代谢。在此使用的所谓摩尔渗透压浓度是来自经验的数值。摩尔渗透压浓度是穿过完全半透膜(允许水自游通过并完全阻断溶质转运的一种膜)的溶液产生的渗透压与纯水相比的测量值。摩尔渗透压浓度取决于溶液中的粒子数但不依赖于粒子的性质。单纯溶液的摩尔渗透压浓度等于摩尔浓度乘以每分子的粒子数。真溶液可能更加复杂。具有许多当量/L的蛋白质，可能对摩尔渗透压浓度仅有很小量的贡献，因为它们由少数非常大的“粒子”组成。不是所有的离子在溶液中都是游离的。阳离子可能与其它阴离子或蛋白质结合。不是所有的溶液容量都是含水的。真实准确地说，所有这些因素都应该被计算在内。张力，与摩尔渗透压浓度高度相关并且对描述生物细胞环境更加有用的值，是能通过细胞膜物质的渗透压与血浆相比的测量值。摩尔渗透压浓度衡量了水的有效梯度，假定所有的渗透性溶质都完全没有渗透。计算溶解的粒子数是很简单的。例如，300mM的葡萄糖溶液和150mM的NaCl溶液有相同的摩尔渗透压浓度。然而，置于任何这些溶液中的细胞其行为却是非常不同的。张力是描述溶液抵抗细胞内容量扩张趋势的功能性术语。其它实施方案提供的是具有约200到约310m0sm摩尔渗透压浓度的本发明组合物。在更具体的实施方案中，组合物具有约221到约280m0sm的摩尔渗透压浓度。在非常具体的实施方案中，摩尔渗透压浓度为约270m0sm。如所述的那样，RBCs将葡萄糖(d-葡萄糖=“右旋糖”)代谢为ATP。废物是乳酸盐和质子。质子堆积，压低了 PH并抑制进一步的代谢。碳酸氢盐已经被建议作为缓冲系统，其中它能与质子结合，在存在RBC碳酸酐酶的情况下转化为水和二氧化碳。在允许二氧化碳扩散的贮存容器中 ，逆反应被抑制了，该反应朝着生成CO2的方向进行。基于碳酸氢盐的缓冲系统已经具有相当可观的容量。添加溶液中生理浓度的碳酸氢盐能在溶液中产生PCO2,其驱使每周从600mL PVC袋中扩散高达I到2mmol的C02。然而，就增加ATP合成和延长有效的贮存期来说，先前尝试制备含有碳酸氢盐的RBC贮存添加溶液已经是失败的。例如，Beutler(BAG-PM)记载将碳酸氢盐加入到RBC贮存溶液中，但是没能控制较高的pH致使ATP被迅速耗尽。由于发现盐水不是RBC添加溶液组合物的必须成分，而且右旋糖的浓度能被降低而对ATP合成没有负面作用，因此本发明的发明人能利用溶液参数中所产生的增强“作用”去提高并调整PH缓冲系统。本发明公开的缓冲系统不仅对添加溶液组合物提供了最初的适宜pH，而且还能赋予RBC悬液一个pH，并依次将RBC的胞内pH调节到能最大化合成ATP的值。缓冲系统在贮存期内实现了这些PH调节目标。因此，pH缓冲系统的缓冲力或强度能被有意地控制。本发明组合物的一个实施方案提供了 PH为约8到约9的组合物。在更具体的实施方案中，pH为约8.2到约8.8。在更具体的实施方案中，组合物的pH为约8.4到约8.6，在非常具体的实施方案中，组合物的pH为约8.5。另一个实施方案针对的是这样的本发明组合物，其中缓冲系统在红细胞(RBC)中具有这样的缓冲力，组合物被加入后在6周的贮存期内提高到至少约2mEq且pH为6.5到7.2。本发明公开的缓冲系统应该提供至少为这个值的缓冲力，也应该能对RBC悬液提供更好的缓冲力由此使贮存期进一步延长。本发明的发明人确定了组合物所必须成分的范围，其中成分的优点随后公开。在本发明组合物的一个实施方案中，组合物包含约l_3mM的腺嘌呤，约20到约115mM的右旋糖，约15到约60mM的非可代谢膜保护剂糖，约20到约130mM的碳酸氢钠和约4到约20mM的磷酸氢二钠。在更具体的实施方案中，组合物包含约2mM的腺嘌呤，约60到约IOOmM的右旋糖，约40到约60mM的非可代谢膜保护剂糖，约22到约40mM的碳酸氢钠和约7到约15mM的磷酸氢二钠。在更具体的实施方案中，组合物包含约2mM的腺嘌呤，约80mM的右旋糖，约55mM的非可代谢膜保护剂糖，约26mM的碳酸氢钠和约12mM的磷酸氢二钠，组合物的pH为约 8.5。本发明还提供了方法实施方案。在一个这种实施方案中，提供了保存红细胞(RBCs)经过一段贮存期的方法。该方法包含:(a)将包含有待贮存的RBCs和血浆的经收集的全血样品与抗凝剂溶液混合，由此形成所收集的全血的悬液；(b)对收集的全血悬液经行处理以除去血浆并浓缩RBCs，由此形成浓缩的RBCs ； (c)将浓缩的RBCs与一定量的含水组合物混合以形成具有约35%到约70%体积的RBC的悬液；(d)冷却RBCs悬液至约1°C到6°C，以及(e)根据标准贮存步骤贮存冷却的RBCs悬液。含水组合物主要由以下物质组成:腺嘌呤；右旋糖；至少一种非可代谢膜保护剂糖，和PH缓冲系统。该pH缓冲系统含有生理上可接受缓冲剂的组合，其包括至少一个能提供碳酸氢根阴离子的试剂，至少一个能提供磷酸根阴离子的试剂，和至少一个能提供钠阳离子的试剂，其中，所述的PH缓冲系统以足以使有待加入上述组合物的红细胞(RBC)悬液的pH维持在下述水平的量存在，所述的水平足以在贮存期间，在所述红细胞中建立并维持一种抑制1，3-DPG合成2，3-二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反应平衡，由此在贮存期间的反应平衡中产生三磷酸腺苷(ATP)净收益。该溶液在制备时就被分开以便在加热灭菌期间使右旋糖和磷酸盐以及碳酸氢盐分隔开。用在本发明中的RBCs是在制备组份的正常过程中已经从血浆中分离并在抗凝剂溶液中重悬的RBCs。简言之，就是将包含RBCs和血浆的标准全血样品(450.+/-.45ml)与抗凝剂溶液(约63ml)混合以形成全血悬液。也可以成比例地增加或降低溶液体积以反映出不同供体血液的体积，例如400.+/-.40ml-500.+/-.50ml。然后将全血悬液离心以便从血浆中分离RBCs，由此形成浓缩的RBCs。整个过程的进行能使用常规技术通过减少白血球来改进。适宜的抗凝剂 包括已知用于贮存RBCs的常规抗凝剂。优选的抗凝剂包括pH为
5.5到8.0的柠檬酸盐抗凝剂，例如CPD，半浓度的CPD等。最优选的抗凝剂是CPD。然后通常使用标本袋或PVC转运包装将RBC悬液贮存在标准的聚氯乙烯(PVC)贮血袋中，其中转运包装的大小随被贮存部分的体积而变化。根据输血的临床实践记载的步骤，编者 Petz&Swisher, ChurchiI1-Livingston publishers, N.Y., 1981,将 RBC 悬液忙存在约1°C到6°C下。在此通过参考的方式将上下文中引用的所有文件引入本文。在本发明方法的一个具体实施方案中，RBCs的悬液适于直接输注到需要这种输注的患者体内。而PVC贮血袋是工业上认可的标准贮血袋；本发明预期能使用适于贮存RBC悬液的众多不同的袋子，例如包括所需的适宜plastisizers。与袋子有关或与RBC贮存技术的容器组份有关的成分没有在此进行讨论，但本领域技术人员将能很容易地使用许多容器技术来实现本发明。本发明的添加溶液还能用于使冻干的RBC再水合，或将在熔化中的贮存冷冻血或血成分例如RBC再水合。在本发明保存RBCs方法的具体实施方案中，至少一种非可代谢膜保护剂糖是来自糖醇的单糖，在更具体的实施方案中，非可代谢膜保护剂糖是甘露糖醇。在另外的方法实施方案中，能提供钠阳离子的至少一种试剂选自碳酸氢钠、磷酸氢二钠及其组合。在具体的实施方案中，能提供碳酸氢根阴离子的至少一种试剂是碳酸氢钠。进一步的实施方案是针对保护RBCs的本发明方法，其中能提供磷酸根阴离子的至少一种试剂选自磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸钠及其组合，在更具体的实施方案中，能提供磷酸根阴离子的至少一种试剂是磷酸氢二钠。在本发明方法的其它实施方案中，生理上可接受缓冲剂的组合含包含至少一个能提供生理上可接受阳离子的试剂，其中阳离子选自H\钾、铵、镁及其组合。进一步的实施方案针对的是本发明保存RBCs的方法，其中组合物的摩尔渗透压浓度为约200到约310m0sm。在具体的实施方案中，摩尔渗透压浓度为约221到约280m0sm，在非常具体的实施方案中，摩尔渗透压浓度为约270m0sm。在另一个实施方案中提供了本发明的方法，其中组合物的pH为约8到约9。在具体的实施方案中，pH为约8.2到约8.8，在更具体的实施方案中，组合物的PH为约8.4到约8.6。在非常具体的实施方案中，组合物的PH为约8.5。本发明保存RBCs方法的另一个实施方案提供的是，缓冲系统在红细胞(RBC)悬液中有这样的缓冲能力，其中在加入组合物后在6周的贮存内提高到2mEq，且pH在6.5到7.2之间。本发明还提供了保存RBCs的本发明方法，其中，所述的组合物可操作地保持加入了所述组合物的红细胞(RBC)悬液的pH为约6.4到约7.4。在具体的方法实施方案中，组合物能保持红细胞(RBC)悬液的pH，其中组合物在pH为约7.0到约小于7.2时被加入到悬液中，在更具体的方法实施方案中，组合物能保持红细胞(RBC)悬液的pH，其中组合物在pH为大于约7.1且小于7.2时被加入到悬液中。还提供了针对组合物必须组份具体范围的根据本发明的方法。在一个方法实施方案中，组合物包含约l_3mM的腺嘌呤，约20到约115mM的右旋糖，约15到约60mM的非可代谢膜保护剂糖，约20到约130mM的碳酸氢钠和约4到约20mM的磷酸氢二钠。在更具体的实施方案中，组合物包含约2mM的腺嘌呤，约60到约IOOmM的右旋糖，约40到约60mM的非可代谢膜保护剂糖，约22到约40mM的碳酸氢钠和约7到约15mM的磷酸氢二钠，在非常具体的实施方案中，组合物包含约 2mM的腺嘌呤，约80mM的右旋糖，约55mM的非可代谢膜保护剂糖,约26mM的碳酸氢钠和约12mM的磷酸氢二钠，更进一步地，其中组合物的pH为约8.5。在根据本发明的方法中，将添加溶液加入到浓缩的RBC悬液中，其量为在细胞悬液中能足以提供治疗有效量的可复原RBCs。优选的是，添加溶液的加入量为约60ml到约400mg，优选约100到约150ml，最优选约110ml。该溶液一般的用量是与收集全血的体积比为1: 4.5 (450mL收集全血对lOOmL，500mL收集全血对lllmL，或等量)。在保护RBCs的本发明方法的具体实施方案中，组合物与收集全血的体积比为约1: 4.5。在更具体的实施方案中，组合物的体积为约IlOmL,收集全血的体积为约500mL。细胞悬液中RBC的体积分数，即在加入添加溶液后，为总悬液的约27到70%。更优选的是，细胞悬液中RBC的体积分数为约35到约50%。最优选的是，细胞悬液中RBC的体积分数为总悬液的约43%。在贮存期间，本发明的发明人监测并收集了与红细胞健康有关的数据。如
图1和2所示，根据本发明进行的贮存使红细胞在小容量下和较长的贮存期内有更好的质量。如上所述，血贮存“损伤”是凋亡事件，红细胞膜经历了生理和形态改变，这相当于程序性细胞死亡。在贮存期间，已知红细胞膜的表面积在下降，由此其形状就变为双凹形，这能使每体积下的表面积最大，使气体和营养素容易扩散，以致到更加呈球型的形状，这是一种死亡特征。红细胞膜最初是柔软和可变形的，易于通过小毛细管。全部的形状变化伴随着挤压微泡(microvesicles)的膜,在红细胞外表面形成针突(spicules),由此,据观察,细胞在这个过程的末期就类似于刺状的刺猬(因此这个过程指的是棘状红细胞增多性变化，在细胞溶解前的最终形状被称为棘红细胞)。随之而来的脆弱最终导致细胞溶解和死亡。确定溶血速率能作为这个活动范围和严重度的指标。除在贮存期间引起无法接受的溶血水平外， 这些形态变化都在再灌注了被贮存红细胞的受体患者内触发了清除机制，这降低了输注后的复原并降低了输注效率。使用根据本发明的组合物和使用了该组合物的保存红细胞的方法，使得渗透脆性降低以及溶解速率降低。这相应地提高了细胞膜表面积的保持力和形态状况,并因此提高了活性红细胞的复原并降低了输注后被再灌注的红细胞从受体患者体内的清除。
本发明的一个实施方案提供了在贮存期间改善红细胞(RBC)膜的保持力和抑制 RBC凋亡的方法。该方法包含在贮存期间于悬液中贮存RBCs，其中悬液内已经加入了本发明的组合物。在具体的实施方案中，微泡的浓度，与在含有AS-3的RBC悬液中贮存相同时间的红细胞所观察到的浓度相比，降低了约75%。
本发明的另一个实施方案提供了在贮存期间降低红细胞(RBC)脆性并抑制RBC溶血的方法。该方法包含在贮存期间于悬液中贮存RBCs，其中悬液内已经加入了本发明的组合物。另一个实施方案针对的是在贮存后和输注到需要这种输注的患者体内后能提高红细胞(RBCs)的成活力，并降低患者RBCs输注后清除率的方法。该方法包含在贮存期间于悬液中贮存RBCs，其中悬液内已经加入了本发明的组合物。
本发明的添加溶液组合物与现有技术的添加溶液相比有几个优点。贮存在其中的红细胞可以贮存更长时间，至少为8周，与目前许可的溶液相比，在体内24小时复原中有更好的放射铬-标记的RBC。使用本发明的组合物能明显地减少贮存损伤的范围和严重度。 在贮存期间，红细胞出现了可接受的溶血范围:在6周时为0.2%，在8周时为0.4%，在许可的贮存末期所有的都在FDA限制的1%以下。贮存在本发明添加溶液中的红细胞在贮存期间表现出更少的膜损失，如膜微泡的浓度降低和渗透脆性降低所证明的那样。贮存期间对膜的保护预期能有助于贮存在溶液中的RBC以使其与失去更多膜的细胞相比具有更好的流动性。保持正常膜的生理性也抑制了存在于受体患者体内的机制，这个机制触发了循环中的选择性清除和红细胞的破坏。因此，受体患者中的再灌注红细胞就能维持更长时间， 并提高了再灌注红细胞的长期复原。此外，输注红细胞的存活时间提高应该会减少重复输注的需要由此对患者来说降低了与之相关的危险。本发明的溶液还能允许在贮存晚期有较高的RBC ATP浓度，这预期能使RBC ATP更好地分泌并因此在细胞被输注后改善其流动性和存活力。实际上，本发明的溶液能在与常规收集系统一起工作时被使用，其中该系统在 CPD或CP2D中收集全血以生成新鲜的冷冻血浆和随机的供体血小板，或在紧急关头收集新鲜的全血。
以下提供的实 施例仅用于说明目的，其不应该被解释为是对本发明范围的限制， 范围如权利要求所确定。实施例
表I
受试的添加溶液组合物
权利要求
1.在约l°c到约6°C下贮存红细胞的含水组合物，该组合物主要由以下物质组成 腺嘌呤； 右旋糖； 至少一种非可代谢膜保护剂糖和 pH缓冲系统， 其中PH缓冲系统含有生理上可接受的缓冲剂的组合，其中缓冲剂包括能提供碳酸氢根阴离子的至少一种试剂，能提供磷酸根阴离子的至少一种试剂和能提供钠阳离子的至少一种试剂，其中，所述的PH缓冲系统以足以使有待加入上述组合物的红细胞(RBC)悬液的PH维持在下述水平的量存在，所述的水平足以在贮存期间，在所述红细胞中建立并维持一种抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反应平衡，由此在贮存期间的所述反应平衡中产生三磷酸腺苷(ATP)净收益。
2.在约I到约6°C下贮存红细胞的含水组合物，该组合物包含 腺嘌呤； 右旋糖； 至少一种非可代谢膜保护剂糖和 pH缓冲系统， 其中PH缓冲系统含有生理上可接受的缓冲剂的组合，其中缓冲剂包括能提供碳酸氢根阴离子的至少一种试剂，能提供磷酸根阴离子的至少一种试剂和能提供钠阳离子的至少一种试剂，其中，所述的PH缓冲系统以足以使有待加入上述组合物的红细胞(RBC)悬液的PH维持在下述水平的量存在，所述的水平足以在贮存期间，在所述红细胞中建立并维持一种抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反应平衡，由此在贮存期间的所述反应平衡中产生三磷酸腺苷(ATP)净收益，其中，所述的组合物基本上不含外源的氯离子。
3.在贮存期间改善红细胞(RBC)膜的保持力和抑制RBC凋亡的方法，该方法包含在贮存期间将RBCs贮存在加入了如权利要求I所述的组合物的悬液中。
4.在贮存期间降低红细胞(RBC)脆性并抑制RBC溶血的方法，该方法包含在贮存期间将RBCs贮存在加入了如权利要求I所述的组合物的悬液中。
5.提高贮存后和输注到需要这种输注的患者体内后红细胞(RBCs)的成活力，降低患者RBCs输注后清除率的方法，该方法包含在贮存期间将RBCs贮存在加入了如权利要求I所述的组合物的悬液中。
6.保存红细胞(RBCs)经过一段贮存时间的方法，其包含 (a)将包含有待贮存的RBCs和血浆的经收集的全血样品与抗凝剂溶液混合形成所收集的全血的悬液； (b)对收集的全血悬液经行处理以除去血浆并浓缩RBCs，由此形成浓缩的RBCs； (c)将浓缩的RBCs与一定量的含水组合物混合，其中该量足以使RBCs悬液有约27%到约70%体积的RBCs ； (d)冷却RBCs悬液至约1°C到6°C，以及 (e)根据标准贮存步骤贮存冷却的RBCs悬液 其中含水组合物主要由以下物质组成腺嘌呤； 右旋糖； 至少一种非可代谢膜保护剂糖和 pH缓冲系统， 其中PH缓冲系统含有生理上可接受的缓冲剂的组合，其中缓冲剂包括能提供碳酸氢根阴离子的至少一种试剂，能提供磷酸根阴离子的至少一种试剂和能提供钠阳离子的至少一种试剂，其中，所述的PH缓冲系统以足以使有待加入上述组合物的红细胞(RBC)悬液的PH维持在下述水平的量存在，所述的水平足以在贮存期间，在所述红细胞中建立并维持一种抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反应平衡，由此在贮存期间的所述反应平衡中产生三磷酸腺苷(ATP)净收益。
7.保存红细胞(RBCs)经过一段贮存期间的方法，其包含 (a)将包含有待贮存的RBCs和血浆的经收集的全血样品与抗凝剂溶液混合，由此形成所收集的全血的悬液； (b)对收集的全血悬液经行处理以除去血浆并浓缩RBCs，由此形成浓缩的RBCs； (c)将浓缩的RBCs与一定量的含水组合物混合，其中该量足以使RBCs悬液具有标准血库操作规定范围内的RBCs体积百分比； (d)冷却RBCs悬液至约1°C到6°C，以及 (e)根据标准贮存步骤贮存冷却的RBCs悬液 其中含水组合物主要由以下物质组成 腺嘌呤； 右旋糖； 至少一种非可代谢膜保护剂糖和 pH缓冲系统， 其中PH缓冲系统含有生理上可接受的缓冲剂的组合，其中缓冲剂包括能提供碳酸氢根阴离子的至少一种试剂，能提供磷酸根阴离子的至少一种试剂和能提供钠阳离子的至少一种试剂，其中，所述的PH缓冲系统以足以使有待加入上述组合物的红细胞(RBC)悬液的PH维持在下述水平的量存在，所述的水平足以在贮存期间，在所述红细胞中建立并维持一种抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反应平衡，由此在贮存期间的所述反应平衡中产生三磷酸腺苷(ATP)净收益。
8.保存红细胞(RBCs)经过一段贮存时间的方法，其包含 (a)将包含有待贮存的RBCs和血浆的经收集的全血样品与抗凝剂溶液混合，由此形成所收集的全血的悬液； (b)对收集的全血悬液进行处理以除去血浆并浓缩RBCs，由此形成浓缩的RBCs； (c)将浓缩的RBCs与约60mL到约400mL的含水组合物混合； (d)冷却RBCs悬液至约1°C到6°C，以及 (e)根据标准贮存步骤贮存冷却的RBCs悬液 其中含水组合物主要由以下物质组成 腺嘌呤； 右旋糖；至少一种非可代谢膜保护剂糖和 pH缓冲系统， 其中PH缓冲系统含有生理上可接受的缓冲剂的组合，其中缓冲剂包括能提供碳酸氢根阴离子的至少一种试剂，能提供磷酸根阴离子的至少一种试剂和能提供钠阳离子的至少一种试剂，其中，所述的PH缓冲系统以足以使有待加入上述组合物的红细胞(RBC)悬液的PH维持在下述水平的量存在，所述的水平足以在贮存期间，在所述红细胞中建立并维持一种抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反应平衡，由此在贮存期间的所述反应平衡中产生三磷酸腺苷(ATP)净收益。
9.含有位于贮血袋中的权利要求I组合物的组合，其中该贮血袋有足够的容积以便能包含约60ml到约400ml体积的添加溶液和约270ml到约2250ml体积的全血。
10.摩尔渗透压浓度为270m0sm的含水组合物，其用于在约I到约6°C下贮存红细胞约8周，其中组合物主要由以下物质组成 2mM腺嘌呤； 80mM右旋糖； 55mM至少一种非可代谢膜保护剂糖例如甘露糖醇；和 pH缓冲系统， 其中PH缓冲系统含有生理上可接受的缓冲剂的组合，其中缓冲剂包括能提供碳酸氢根阴离子的至少一种试剂，能提供磷酸根阴离子的至少一种试剂和能提供钠阳离子的至少一种试剂，其中，所述的PH缓冲系统以足以使有待加入上述组合物的红细胞(RBC)悬液的PH维持在下述水平的量存在，所述的水平足以在贮存期间，在所述红细胞中建立并维持一种抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反应平衡，由此在贮存期间的所述反应平衡中产生三磷酸腺苷(ATP)净收益。
全文摘要
本发明提供了用于贮存红细胞的方法，其基本上由以下物质组成腺嘌呤；右旋糖；至少一种非可代谢膜保护剂糖和具体定义的pH缓冲系统。还提供了保存红细胞的改进方法和增加贮存红细胞存活力，膜保存力和复原性并抑制凋亡、溶血和再输注后清除率的方法，其中使用了新颖的组合物。
文档编号A01N1/02GK103250694SQ20131006911
公开日2013年8月21日 申请日期2005年2月17日 优先权日2005年2月17日
发明者J.R.赫斯, T.G.格林沃尔特 申请人:辛辛那提大学