专利名称：一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌及构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，更具体涉及一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌，同时还涉及一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌的构建方法和该基因工程菌的用途。不仅适合多种核糖体失活蛋白工程菌的构建，也有利于具活性的核糖体失活蛋白的简易化、规模化生产。该方法也为Alpha-苦瓜素蛋白及其他核糖体失活蛋白在体外的抑菌应用奠定了理论基础。
背景技术：
植物在生长过程中会受到环境中各种细菌、真菌、病毒等各种病原菌的侵染。真菌和细菌病害是植物病害中最为严重的一类，占据总数的80%以上，几乎所有的高等生物都受到病原菌的危害。病原菌侵入到植物体内能够引起植物病害，往往导致农作物遭受重大的损失，甚至颗粒无收，因此病原菌对农业生产有着重要的影响。传统的化学药剂的应用常常导致农作物上有药物残留，同时也加剧了病原菌的变异速率和耐药性，因此在植物体中特别是食用植物中寻找广谱、高效、低毒、不耐药的的病原菌抑制剂已经成为国内外研究的热门领域之一。其中，克隆具有广谱抗菌活性的蛋白质基因，并利用基因工程的手段将其导入到植物中培育抗病品种，或者转入大肠杆菌或酵母细胞内生产抗微生物药物，已成为近几年的研究热点。此外，一些多肽抗生素在植物抗病原菌实验中取得了较好的效果。在长期的进化过程中，植物自身抵抗病原菌的防御体系会合成一些相应的生物分子以拮抗外源侵袭物，而其中能够抑制病原菌生长或杀死病原菌的抗菌蛋白就是最为重要的一类。目前，已经从70多种植物中发现了 170多种抗菌蛋白。随着对抗菌蛋白作用机制研究的深入，多个抗菌蛋白基因被鉴定出来，根据植物抗菌蛋白的作用机制、结构和序列特性，可将其大体分为以下几类:病程相关蛋白(pathogenesis-relatedproteins, PRs)、防御素(defensins)、类亲环素蛋白(cyclophilin-like proteins)、核糖体失活蛋白(ribosome-1nactivating proteins, RI Ps)、月旨质转运蛋白(lipid-transferproteins, LTPs)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitors)、2S 清蛋白类(2S albuminproteins)及其他蛋白。其中，核糖体失活蛋白的研究历史比较久远，距今已经有一百多年的历史。核糖体失活蛋白起初分别是从蓖麻中提取了蓖麻毒蛋白(ricin)和从相思子(Abrusprecatorius)中提取的相思子毒蛋白(abrin)。除了几个真菌和细菌来源的RIPs外,几乎所有的RIPs都来自于高等植物。迄今已经发现了百余种RIPs，其抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤等活性引起了人们的广泛关注。RIPs分为三类:1型RIPs，由相对分子质量为30kDa左右的单肽链组成；11型RIPs，由具有酶活性的RTA链和凝集素活性的RTB链构成；111型RIPs目前只在玉米(Zea mays)和大麦(Hordeum vulgare)中发现，分别为b_32、JIP60,它们在移除了内部的一个短肽片段后，才具有酶活性。起初RIPs的酶活研究主要集中在RNAN-糖苷酶活性上,Endo等人(1988 )首先检测到ricin作用在大鼠28S rRNA的a -sarcin/ricin区域(SRL)的GA4324GA序列，通过脱去A4324从而阻止延长因子EF-2与核糖体的结合，进而抑制蛋白质的生物合成。这个结论得到Stirpe等人的推广，认为所有具有RNA N-糖苷酶活性的RIPs都有类似的作用。此外，RIPs还被检测到具有脂肪酶活性、几丁质酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、磷酸酶活性、DNA糖基化酶活性，以及超螺旋DNA的解旋酶等活性。在20世纪20年代,人们将美洲商陆(Phytolacca heterotepala)叶子的粗提物擦拭在植物的表面作为抑制病毒的试剂进行检测。实验成功后，大量的生物技术试验证明了RIPs是植物防御病原菌的重要工具。目前，所有已发现的I型RIPs对植物、真菌、动物病毒均显示出广谱的抗菌活性，部分II型RIPs亦表现出此性质。RIPs的转基因植物(烟草、小麦、水稻、玉米等)均表现出较强的抗病毒活性。此外，部分RIPs在抗肿瘤细胞、HIV感染细胞、骨髓瘤细胞、破骨细胞分化、骨免疫学方面均显示出广范的应用前景。Alpha-苦瓜素蛋白是从葫芦科植物苦瓜的籽内分离出来的I型RIP，具有广谱的抗肿瘤、抗病毒、抗菌作用，也可以抑制肿瘤细胞的增长并诱发肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无不良反应。传统的Alpha-苦瓜素蛋白分离技术依赖于硫酸铵沉淀、离子交换层析、分子筛层析、亲和层析、凝胶过滤等多种技术的综合，纯化步骤繁琐、周期长、成本较高，并且该方法受制于苦瓜种子的产量和季节的限制。此外，繁琐的纯化步骤容易导致蛋白质的大量损失，同时也会影响到Alpha-苦瓜素蛋白的酶活性。改进的提取方法包括HPLC层析和离子交换柱层析相结合，但是对高端的HPLC仪器设备要求比较高。Jesada Pitipanapong等人在2007年采用HPLC泵、高温烤箱、不锈钢抽提管、压力表和压力调节器等系统组合，在400°C高温高压下提取苦瓜素，虽然得到了较高的提取率，但产生了大量的环境污染物，而且对仪器要求更为严格，不利于大规模的提取。传统的蛋白质提取方法限制了 Alpha-苦瓜素蛋白在科学研究和农业上的大规模应用。原核表达技术不仅能够大量合成目的蛋白，也能通过密码子优化得到多种修饰蛋白，生产周期短，并且价格低廉，适合大规模工业化生产。MAP30、curcin2、luffin_a等多种RIPs已经被克隆和表达,其活性实验显示原核系统重组表达的RIPs与天然来源的RIPs活性基本上一致，这就为多功能性RIPs的原核重组表达奠定了理论基础。大肠杆菌不同株系的分离纯化以及如PET载体在内的多种表达载体的构建为RIPs的原核表达提供了技术基础。RIPs原核工程菌的构建不仅利于蛋白的规模化生产，也将进一步拓展其在科学研究和农业生产上的应用。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌，该菌能够在优化出来的诱导条件下大量表达具有活性的Alpha-苦瓜素蛋白，并且绝大部分表达蛋白在菌体的细胞质内积累。该菌已于2013年5月6日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:大肠杆菌 Escherichia coli Rosetta (DE3)/pET_28a_ a MC，CCTCCN0.M2013174，地址:中国武汉武汉大学。表达的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示，其核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。本发明还有一个目的是在于提供了一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌的构建方法，方法简单，易行，适于大规模生产。
本发明最后一个目的是在于提供了一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌的应用。利用该菌大量表达具有活性的Alpha-苦瓜素蛋白，该重组的Alpha-苦瓜素蛋白能够显著抑制真菌爺病镰刀菌(Fusarium solani L.)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumL.),以及细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa L.)的生长和增殖。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案:本发明构建了 Alpha-苦瓜素蛋白的原核工程菌株并检测重组Alpha-苦瓜素蛋白的抗菌活性。通过分子克隆技术构建了 Alpha-苦瓜素蛋白的工程菌株，并优化了重组蛋白的表达条件，得到了可以使蛋白以可溶的形式在菌体细胞质内积累的条件。本工程菌不仅适合大规模纯化Alpha-苦瓜素蛋白，也利于对Alpha-苦瓜素蛋白的深入研究以及应用，同时也为其他核糖体失活蛋白的合成以及研究提供了技术参考。依据NCBI数据库内关于Alpha-苦瓜素蛋白的序列信息，采用Primer5.0软件设计引物，从苦瓜基因组DNA内扩增出Alpha-苦瓜素蛋白的开放读码框，经过双酶酶切后与pET-28 (a)载体连接构成重组载体pET-MC ;用密码子软件分析Alpha-苦瓜素蛋白基因的密码子特征，并挑选出适合度比较高的菌株Rosetta(DE3)pLysS进行转化以构建工程菌株；Blast序列比对后挑选出正确的重组子克隆；单因素分析法设置菌体生长的条件梯度，筛选出最优化的蛋白质诱导条件；扩大培养体积，按照优化的条件组合诱导蛋白质的合成，经亲和层析纯化后冷冻干燥保存；检测蛋白质的抑菌活性。一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌的构建方法，其步骤是:第一部分:Alpha_苦瓜素蛋白工程菌的构建:(I)Alpha-苦瓜素蛋白的引物合成。从NCBI数据库内下载由Ho等人于 1991 年上传的 et -苦瓜素 cDNA 序列(http:1 Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/19527),分析其成熟肽片段，并采用Primer5.0设计扩增Alpha-苦瓜素蛋白的引物:上游引物 MCF: 5 -CCG^GAAfT^-GA TGTTAGCTTTCGTTTG-3，下游引物 MCR:
5,-CCG^CTCG.^-TTAGGGCATTCIAGTAGC TC.3，，其中加框的分别是限制性内切酶 EcoR 1、
Xho I的酶切位点，酶切位点上游是3个酶切位点保护碱基，有下划线且加粗的位点分别表示第一个密码子和终止密码子。(2) Alpha-苦瓜素蛋白成熟肽基因片段的获得。15iiL的PCR体系包括:50ng基因组DNA、1.5 ii LlOXpfu buffer、0.4iiM引物组合、1.5mM MgCl2,250 u L dNTPs，以及0.5Upfu DNA聚合酶；PCR反应条件为:95° C预变性5min，30个PCR循环(94° C变性lmin，51° C退火lmin，72° C延伸lmin)，最后72° C条件下延伸7min ;PCR产物用l%(w/v)琼脂糖凝胶检测(
图1)，并且采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。(3)重组质粒的构建。采用EcoR 1、Xho I双酶切:18u L PCR产物或pET_28a (+)质粒(30ii g/ml)、l ii L EcoR I (2.5U/u L,NEB)U U L Xho I (2.5U/u L, NEB),2 u LlOXHbuffer，混匀后于37° C条件下温育6h ;0.8% (w/v)的琼脂糖检测后回收目的片段。将回收的基因片段与pET-28a (+)经T4DNA连接酶连接，连接体系为:luL酶切回收DNA 片段(5 nmol)、8ii L 酶切的 pET-28a(+)载体(30nmol)、l y L T4DNA 连接酶(20U)、luL10XT4Ligase Buffer，于16° C低温恒温槽内处理6h，构建重组表达质粒pET_MC(图2)。(4)阳性克隆子的构建。用密码子分析软件(https://www.genscript.com/CR1-bin/tools/rare codon analysis)分析Alpha-苦瓜素蛋白的序列信息(图3),确定苦瓜素基因适合的表达菌株为Rosetta (DE3) pLysS ;将重组质粒pET_MC转化到Rosetta (DE3)pLysS感受态细胞中，在含有Kanamycin和Chloromycetin的筛选培养基上筛选阳性克隆子，经菌液PCR扩增检测以及质粒提取后酶切验证，筛选出阳性重组子，进一步测序验证得到含有正确读码框的克隆子。至此得到了一种能高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的的基因工程菌，该细菌已于2013年5月6日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:大肠杆菌Escherichiacoli Roset ta(DE3)/pET-28a-aMC，CCTCC N0.M2013174。该菌株是好氧及兼性厌氧型的，两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌，周身鞭毛、能运动且不具有芽孢。该工程菌可以用富含50 ii g/mL Kanamycin的LB固体和液体培养基进行培养，并且能够在37° C条件下快速生长，而在28° C条件下高效表达出积累在菌体细胞质内的重组Alpha-苦瓜素蛋白。(5)蛋白诱导表达培养条件的优化。通过设置不同的培养时间(6、8、10、12、14、18h)、诱导剂加入后的培养温度(22° C、25。C、28。C、30。C、35。C、37。C)、诱导剂IPTG的浓度(0.5、0.75,1.0、1.25,1.5mM)、诱导时 OD6tltl 值(0.5、0.6、0.7、0.8)等培养条件梯度，并收集不同诱导条件下的菌体溶液。SDS-PAGE分析各种条件下培养的菌体内Alpha-苦瓜素蛋白的表达情况以确定最优的表达条件。(6)蛋白质分离和纯化。扩大菌体培养体积至1L，在最优的表达条件下(当0D_为0.6时加入0.75mM IPTG，在28° C培养条件下培养IOh)诱导Alpha-苦瓜素蛋白的表达，12，OOOg离心IOmin收集菌体，并用50mL预冷的PBS重悬。在-78° C (30min)和37° C (30min)两个温度条件下反复冻融菌体细胞5次，恒功率超声破碎细胞(IOmL/次，45W, 15min,间隔10s)，12，OOOg再次离心IOmin收集包含目的重组蛋白的菌体上清液，此时得到的蛋白浓度为115mg/L。经N1-NTA亲和层析纯化蛋白:按每40mg重组Alpha-苦瓜素采用ImL的N1-NTA树脂的比例取适量的树 脂进行装柱；用6倍N1-NTA树脂柱体积的结合缓冲液(20mM PBS,0.5M NaCl，pH7.8)平衡N1-NTA柱子后将菌体上清液反复过柱3次；先用6倍树脂柱体积的结合缓冲液和4倍树脂柱体积的洗脱缓冲液(20mM PBS，0.5M NaCl，pH6.0)分别洗脱未结合的杂蛋白；再用5倍树脂柱体积浓度逐渐增加的咪唑洗脱缓冲液(10mM、25mM、50mM、75mM、100mM、150mM)逐次洗脱结合程度较低的杂蛋白；最后用5倍树脂柱体积富含175mM、200mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱重组的Alpha-苦瓜素蛋白。将目的蛋白组分装入到处理过的透析袋(直径22mm，分子截留量14kDa)内用去离子水透析除去盐离子和小分子咪唑，4° C条件下每4h换一次水，共透析24h。透析过的蛋白质溶液用PEG20000进行浓缩至水分减少至原体积的10%左右。收集透析袋内的高浓度蛋白质溶液，分装至灭菌的1.5mL EP管内冷冻干燥除去剩余的水分，得到Alpha-苦瓜素蛋白干粉，于-78° C保存备用。一种利用高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌制得的蛋白在抗菌中的应用，其过程是:(I)抗真菌活性检测。将真菌菌种茄病镰刀菌(F.solani，CCTCC，AF93239)和尖孢镰刀菌(F.0xysporum，CCTCC，AF93230)在PDA斜面培养基上复苏48h，然后从斜面培养基的边缘挑取健壮的菌丝块接种在PDA平板培养基上进行继代培养。待真菌菌斑面积占据平板的50%时,在菌斑外边缘0.5cm的位置放置含有0 ii g、0.1 u g、0.2 u g、0.4 u gAIpha-苦瓜素蛋白的滤纸片(直径为1cm)，继续培养24h后观察抑菌圈的形成(图4)。在PDA培养基上培养F.solani和F.0xysporum真菌5_7天,然后用灭菌水收集孢子并调整至浓度为2 X IO4孢子/mL的菌悬液；用F1D液体培养基培养F.solani和F.0xysporum的孢子至对数生长期，然后加入Alpha-苦瓜素蛋白至终浓度为O μ g/mL、20 μ g/mL、40 μ g/mL, 37° C条件下温育30min ;分别取5 μ L不同浓度的Alpha-苦瓜素蛋白处理过的F.sol ani菌液取接种在PDA平板中央，于28° C条件下进行培养并观察蛋白对真菌的生长抑制情况(24h、48h、72h)。(2)抗细菌活性检测。在无抗生素的LB固体平板上活化铜绿假单胞菌(P.aeruginosa细菌菌株)12h，挑取单克隆并用无抗生素的LB液体培养基在37° C条件下培养6h得到长势旺盛的对数期菌体细胞，然后调整浓度得到1.0-2.0X IO5细胞/mL的细菌悬液。制备含有不同浓度Alpha-苦瓜素蛋白(O μ g/mL、10 μ g/mL、50 μ g/mL)的LB平板，然后将2μ L活化的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌悬液(1.0-2.0 X IO5细胞/mL)涂布在平板上，37° C培养12h后统计菌落形成单位(colony-forming units, CFUs);观察α_苦瓜素蛋白的抑菌效果，结果见表I。表IAlpha-苦瓜素蛋白对细菌P.aeruginosa的抑制效果。
权利要求
1.一种基因工程菌，其特征在于大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3) /pET-28a- a MC, CCTCC NO. M2013174。
2.权利要求I所述的一种基因工程菌表达的蛋白，其序列为SEQID NO. I所示。
3.权利要求2所述的一种蛋白的制备方法，其步骤是 1)液体培养细菌体积至IL，当0D600为0. 6时加入0. 75 mM IPTG，在28° C培养条件下培养10 h诱导Alpha-苦瓜素蛋白的表达，12，OOOg离心10 min收集菌体,并用50 mL预冷的PBS重悬； 所述的细菌为:大肠杆菌 Escherichia coli Rosetta (DE3) / pET_28a_aMC，CCTCCNO. M2013174 ;培养基为含50 u g/mL Kanamycin的LB液体培养基； 2)在-78°C 30 min和37° C 30 min两个温度条件下反复冻融菌体细胞5次，按照10 mL/次，45 W，15 min，间隔10 s的条件对菌体进行超声破碎，12，OOOg再次离心10 min,收集包含115 mg/L的Alpha-苦瓜素蛋白的菌体上清液； 3)经Ni-NTA亲和层析纯化蛋白按照每40mg重组Alpha-苦瓜素蛋白使用I mL的Ni-NTA树脂的比例取适量的树脂进行装柱；用含20 mM PBS, 0.5 M NaCl,pH 7. 8的结合缓冲液平衡Ni-NTA柱子后将菌体上清液反复过柱3次；先用6倍柱体积的结合缓冲液和4倍柱体积的含20 mM PBS, 0. 5 M NaCl，pH 6. 0的洗脱缓冲液分别洗脱未结合的杂蛋白；再用5倍体积浓度逐渐增加的咪唑洗脱缓冲液逐次洗脱结合程度较低的杂蛋白；最后用5倍体积含175 mM、200 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱与Ni-NTA树脂结合的Alpha-苦瓜素蛋白； 所述的浓度逐渐增加的咪唑洗脱缓冲液其浓度分别为10 mM；25 mM；50 mM ；75 mM ；100 mM ;和 150 mM ； 4)将洗脱下来的目的蛋白装入到直径22mm，分子截留量14 kDa的透析袋内，在4° C条件下用去离子水透析除去盐离子和小分子咪唑，每4 h换一次水，透析24 h； 5)透析过的蛋白质溶液用PEG20000进行浓缩至水分减少至原体积的10%，收集透析袋内的高浓度蛋白质溶液，分装至灭菌的I. 5 mL EP管内冷冻干燥法除去剩余的水分，得到Alpha-苦瓜素蛋白干粉，于-78° C保存备用。
4.权利要求2所述的一种蛋白在体外抑制茄病镰刀菌生长中的应用。
5.权利要求2所述的一种蛋白在体外抑制尖孢镰刀菌生长中的应用。
6.权利要求2所述的一种蛋白在体外抑制铜绿假单胞菌生长中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌及构建方法和应用，通过将重组质粒pET-28a-αMC转化到Escherichiacoli的Rosetta(DE3)pLys，可得到一种重组菌株，CCTCC NO.M2013174。该菌株耐Kanamycin和Chloromycetin，在LB液体培养基中生长良好，可以在低浓度IPTG诱导剂诱导的条件下大量合成活性蛋白并积累在细胞质中。本发明的重复性好，可操作性强，价格低廉，因此适合Alpha-苦瓜素蛋白的工业化生产和应用。本工程菌株所表达的Alpha-苦瓜素的产量为115mg/L，经下游纯化后得率为85mg/L，纯度为94.7%，回收率为73.9%。
文档编号A01N47/44GK103255096SQ20131018333
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月17日 优先权日2013年5月17日
发明者丁毅, 王书珍 申请人:武汉大学