嗜硫小红卵菌菌株、菌剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种嗜硫小红卵菌菌株、菌剂及其在提高油菜发芽率和油菜产量方面的应用，所述嗜硫小红卵菌菌株为嗜硫小红卵菌IV-1（Rhodovulum?sulfidophilum?IV-1），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?No：M2012369，本发明的菌剂生产成本低，可以极大的促进油菜生长且高效、无毒、环保，另外本发明提供一种菌剂在提高油菜种子发芽率和油菜产量方面的应用。
【专利说明】嗜硫小红卵菌菌株、菌剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细菌、菌剂及其在促进油菜生长发育方面的应用，具体是涉及一种嗜硫小红卵菌菌株、菌剂及其在提高油菜发芽率和油菜产量方面的应用。
【背景技术】
[0002]农用化学品，包括化学杀虫剂、化学除草剂和化肥的大量投入，降低了农业生产的劳动强度，提升了农业生产的效率，极大的促进了现代农业生产的发展。然而，农用化学品的投入，影响了农田生态系统的结构，破坏了农田生态系统平衡，从而影响农田生产的可持续性，降低了农产品的质量。如化肥的不合理投入，导致土壤板结，降低土壤生物多样性，影响作物产量和品质；化学农药的不合理投入，对非靶标毒害及农产品残留超标，越来越受到人们关注。
[0003]微生物制剂是部分解决该问题的有效方法。然而，本领域的技术难题是，筛选环境友好型、高活性的微生物资源，微生物菌剂的高效发酵工艺，微生物菌剂的田间应用技术等等。目前还没有嗜硫小红卵菌在促进油菜生长发育方面的文献报道。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低，促进油菜生长且高效、无毒、环保的嗜硫小红卵菌菌株，另外提供一种利用嗜硫小红卵菌制成的菌剂，及其在提高油菜种子发芽率和油菜产量方面的应用。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供一种嗜硫小红卵菌IV-1 (RhodovulumsulfidophilumIV-1)菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2012369，保`藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月20日，该菌株被命名为嗜硫小红卵菌 IV-1 (Rhodovulum sulfidophilum IV-1)0
[0006]本发明的嗜硫小红卵菌菌株是通过以下方法筛选得到:将采自海南省的海水样品加入MSYN液体培养基(MSYN液体培养基组分:0.2g/L K2HPO4,0.8g/L KH2PO4,0.2g/LMgSO4, 0.lg/LCaS04.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2H20, 0.005g/L FeSO4.7H20,1.5g/L 酵母膏和3g/L NaCl, pH7.0-7.2)，光照培养后，取菌液稀释涂布到MSYN固体培养基(MSYN固体培养基成分:0.2g/LK2HP04, 0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/LNaMoO4.2H20，0.005g/LFeS04.7H20，1.5g/L 酵母膏，3g/L NaCl，15g/L 琼脂，pH 值为 7.0 ~7.2)，光照培养至菌落出现，挑取菌落形态不同的菌，分别接种到含MSYN液体培养基中，筛选得到嗜硫小红卵菌IV-1。
[0007]所述嗜硫小红卵菌菌株IV-1，具有以下主要特征:
[0008]G-，个体形态为卵杆状，V-P反应阳性，甲基红反应阴性，H2S阳性，吲哚反应和过氧化氢酶反应阳性，质量浓度为3%NaCl中能生长，最适生长温度为30~35°C，最适生长pH值为6.5~7.5,菌体的特征吸收峰为385nm、525nm、585nm、805nm和865nm, 16S rDNA序列长度为1338bp，在Genbank中的登录号为KF682218。[0009]本发明还提供一种利用嗜硫小红卵菌IV-1制成的菌液。制备方法是将该菌株接种于液体培养基中培养制得，菌浓度优选为108-101(lCfu/mL，最优选为109cfu/mL。
[0010]具体的制备方法优选包括以下步骤:
[0011]a.将嗜硫小红卵菌菌株IV-1的超低温保存种按平板培养法进行培养，培养至红色菌落出现；平板培养法优选是采用双层MSYN固体培养基进行培养，pH值优选为7.0~7.2，培养温度优选为30°C~35°C，光照条件优选为2000~3000Lx。
[0012]b.将所述红色菌落中的单菌落接入血清瓶，用嗜硫小红卵菌菌株IV-1种子培养基培养至对数生长期；种子培养基优选为MSYN液体培养基，pH值优选为7.0~7.2，培养温度优选为30~35°C，光照条件优选为2000~3000Lx。
[0013]c.将步骤b培养后得到的菌液按不少于嗜硫小红卵菌菌株IV-1生产培养基总体积1%的接种量，优选I~5%，接种到生产瓶中，用嗜硫小红卵菌菌株IV-1生产培养基培养至对数生长期；生产培养基优选为MSYN液体培养基，pH值优选为7.0~7.2，培养温度优选为30~35°C，光照条件优选为2000~3000Lx。
[0014]d.分装制得细菌菌剂。
[0015]上述制备方法的全流程时间一般为16-20天左右，培养结束后，菌体数量可达到5亿个/ml以上。
[0016]本发明还提供一种上述嗜硫小红卵菌菌株IV-1在提高油菜种子发芽率或油菜产量方面的应用。
[0017]提高油菜种子发芽率的应用方法是，将菌剂按一定比例稀释，润湿滤纸，然后将油菜种子均匀撒在润湿滤纸上，光照培养一段时间。
[0018]提高油菜产量的应用方法是，油菜定植缓苗后5-15天后开始喷菌液，每隔7-10d喷一次，共喷菌液2-3次。三次施菌液当天最好为阴天或晴天，施菌液后24小时内均未降雨。
[0019]本发明的有益效果是，本发明提供的嗜硫小红卵菌菌株IV-1，生产成本低、生长速度快，高效、无毒、环保，可通过简单、快捷的操作方法制备得到细菌菌剂，使用本发明菌株制备得到的细菌菌剂具有生产成本低、使用方便，对油菜促生效果好等优点，能够有效用于农业生产中油菜的安全生产。本发明的菌株可用于田间油菜的生产，可部分的替代农用化学品投入。本发明的菌株本身具有多种营养成分及活性物质，能够有效促进油菜生长、提供油菜籽的品质，兼具防治油菜病害的作用，具有安全、无毒、环保的特点。
[0020]本发明的嗜硫小红卵菌IV-1 (Rhodovulum sulf idophilum IV-1),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012369，保藏日期为2012年9月20日。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明菌株的电子显微镜扫描图。
[0022]图2为不同浓度的菌剂对油菜发芽率的柱状图。
[0023]图3为不同浓度的菌剂对油菜增产率的柱状图。
【具体实施方式】
[0024]实施例1[0025]本发明的菌株的制备方法包括如下步骤:
[0026]将采自海南省的海水样品2.0mL加入120mL MSYN液体培养基，MSYN液体培养基组分:0.2g/L K2HPO4,0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4, 0.lg/L CaSO4.2H20，0.0033g/LNaMoO4.2H20, 0.005g/L FeSO4.7H20,1.5g/L 酵母膏和 3g/L NaCl，ρΗ7.0-7.2，光照培养 7d后，取300 μ L菌液稀释涂布到MSYN固体培养基，MSYN固体培养基为MSYN液体培养基添加15g/L琼脂，光照培养至菌落出现，挑取菌落形态不同的菌，分别接种到含MSYN液体培养基中，筛选得到嗜硫小红卵菌菌株IV-1 (Rhodovulum sulf idophilum IV-1),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2012369，本发明菌株的电子显微镜扫描图如图1所示。
[0027]实施例2
[0028]用嗜硫小红卵菌菌株IV-1 (Rhodovulum sulf idophilum IV-1)制备细菌菌剂,具体包括以下步骤:
[0029](I)活化:将嗜硫小红卵菌菌株IV-1的超低温保存种按双层平板培养法进行培养，该双层平板培养法具体是用双层MSYN固体培养基进行培养，其主要成分包括0.2g/LK2HPO4, 0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2Η20，0.005g/LFeSO4.7H20,1.5g/L酵母膏，3g/L NaCl，15g/L琼脂，培养时的pH值为7.0~7.2，温度为30°C，光照条件为3000Lx，培养至红色菌落出现；
[0030](2)种子培养:将步骤(1)培养出的红色菌落中的单菌落接入血清瓶，用MSYN液体培养基培养，其主要组分包括 0.2g/L K2HPO4, 0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/LCaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2Η20，0.005g/L FeSO4.7H20,1.5g/L 酵母膏，3g/L NaCl，培养时的pH值为7.0~7.2，温度为35°C，光照条件为2000Lx，培养至对数生长期；
[0031](3)生产培养:将步骤(2)培养后得到的菌液按嗜硫小红卵菌菌株IV-1生产培养基总体积的5%的接种量接种到生产瓶中，用MSYN液体培养，培养基组分和培养条件同步骤(2)，培养至对数生长期；
[0032](4)出瓶分装制得细菌菌剂。
[0033]本实施例方法的全流程培养时间为20天，培养结束后，菌体数量达到5亿个/ml以上。
[0034]实施例3
[0035]将实施例2制得的嗜硫小红卵菌菌株IV-1菌剂和油菜种子混匀，嗜硫小红卵菌菌株IV-1菌剂和油菜种子的重量比为1:100，光照强度25±2°C培养72h。油菜发芽率相比没有混匀嗜硫小红卵菌菌株IV-1菌剂相比，油菜发芽率提高15-20%。
[0036]实施例4
[0037]油菜定植缓苗后10天后开始喷实施例2制得的菌剂，喷液量150mL/亩，每隔7d喷一次，共喷菌液3次。三次施菌液当天为阴天或晴天，施菌液后24小时内均未降雨。相比未喷洒菌剂的油菜，油菜产率提高3-15%。
[0038]不同浓度菌剂对提高油菜种子发芽率的分析
[0039]在直径15cm的培养皿中，放入滤纸，分别加入稀释的菌剂或稀释100倍的MSYN液体培养基，总体积为20mL。挑选大小一致的油菜种子，分别均匀的播入培养皿(10粒每皿)中，光照培养箱中25±2°C培养。72h后测定油菜发芽情况。[0040]结果如附图2所示，菌剂稀释100倍和200倍，油菜发芽率分别为60.47%和49.40%，均高于稀释100倍的MSYN液体培养基对照(油菜发芽率为48.30%)。
[0041]不同浓度菌剂对提高油菜产量的分析
[0042]试验地设在湖南省常德市。试验地地势平坦，面积约1250m2，土壤pH值6.8，土壤有机质含量1.82%。试验地不再施用其它微生物菌剂，其他田间管理按常规进行。
[0043]试验共设4个处理:菌剂稀释100X、200X，稀释100倍的MYSN液体培养基，清水。采用的喷施方法为:油菜定植缓苗后IOd后开始喷菌液，每隔7-10d喷一次，共喷菌液3次。三次施菌液当天均为阴或晴天，施菌液后24小时内均未降雨；田间试验期间日平均温度25.2。。。
[0044]收获时测量各小区产量，计算折合产量与增产率。
[0045]结果如附图3所示，菌剂稀释100倍和200倍，油菜增产率分别为10.68%和7.79%，均高于稀释100倍的MYSN液体培养基对照(油菜增产率为3.63%)，油菜增产率的计算方法为:菌剂稀释100倍、200倍或培养基稀释100倍喷施油菜得到的油菜产量减去以清水喷施得到的油菜产量，除清水喷施得到的油菜产量，乘以100%。
[0046]以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种嗜硫小红卵菌菌株，其特征在于，所述嗜硫小红卵菌菌株为嗜硫小红卵菌IV-1(Rhodovulum sulfidophilum IV-1),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:M2012369o
2.一种如权利要求1所述嗜硫小红卵菌菌株制成的菌剂。
3.根据权利要求2的嗜硫小红卵菌菌株制成的菌剂，其特征是，菌浓度为IO8-1OltlCfu/ Π?Τ, η
4.一种如权利要求1所述嗜硫小红卵菌菌株或权利要求2所述菌剂在提高油菜种子发芽率方面的应用。
5.一种如权利要求1所述嗜硫小红卵菌菌株或权利要求2所述菌剂在提高油菜产量方面的应用。
【文档编号】A01N63/02GK103525729SQ201310475494
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】刘勇, 张松柏, 张德咏, 罗香文, 彭静, 谭新球, 成飞雪, 程菊娥, 朱春晖, 杨春晓, 张卓 申请人:湖南省植物保护研究所