粉葛组织培养快速育苗方法
【专利摘要】本发明涉及植物组织培养繁殖【技术领域】，一种粉葛组织培养快速育苗方法，包括如下步骤：（1）预处理；（2）无菌材料体系的建立；（3）诱导培养；（4）芽的增殖；（5）生根培养；（6）炼苗移栽；本发明的粉葛组织培养快速育苗方法，应用组织培养方法，可以有效的保持优良母本的稳定性状。与常规的扦插和压条繁殖相比，组织培养能够用较少的优良母本，繁殖出大批量的种苗。在同一时间段内（60d），扦插每个母本只能繁殖出一个有效苗，组织培养的繁殖系数是扦插的的20～30倍。
【专利说明】粉葛组织培养快速育苗方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物组织培养繁殖【技术领域】，一种粉葛组织培养快速育苗方法。
【背景技术】
[0002]粉葛(Puerariaelobata var.Thomsonii),为豆科(Leguminosae)葛属(Pueraria)植物。在我国有8种及2变种，主要分布于西南部、中南部至东南部，长江以北少见。粉葛的食用部分为块根，俗称“葛根”。
[0003]葛根是我国卫生部认定的药食两用的山地植物。葛根味甘，辛，性平，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻之功；葛根素(异黄酮类化合物)含量高，具有降低血压、降低心肌耗氧量、减慢心率、扩张冠血状管改善正常和缺血心肌的代谢，改善脑循环和外周循环等作用。随着现代医药、食品科技的不断发展，葛根的药理、药化、临床应用、食品开发研究等发面的不断深入，其使用价值越来越引起人们的关注，被誉为“亚洲人参”。世界粮农组织等权威机构预测，全球葛根需求量将至5000万吨/年(折合2000万亩)。
[0004]此外，粉葛淀粉含量高，一些优良品种淀粉含量可高达25%，7.5kg鲜粉葛即可生产燃料乙醇1kg。单位面积土地的乙醇生产率粉葛高于玉米、甘薯等粮食作物，而且粉葛生物固氮效率高，耐贫瘠，具有充分挖掘土地潜力的优势。粉葛作为非粮食生物质新材料，避免了 “与民争粮，与粮争地”的瓶颈，具有巨大的开发利用价值。
[0005]大巴山粉葛(Pueraria lobata (wild) Ohwi' Dabashan')是由达州市林业科技推广站从野生葛品种中驯化的 良种，2010年通过四川省林木品种审定委员会审定(登记编号为:川R-WTS-PL-023-2009)，成为秦巴山区发展粉葛产业主推的主导品种，发展面积增长迅速，
对种苗需求量大。
[0006]目前大巴山粉葛的繁殖主要以压条和扦插繁殖传统方法为主，繁殖系数低，获得的种苗数量有限，无法满足当前农业生产上的需求，如何提供大量优质的种苗成为当前亟待解决的问题。
[0007]植物组织培养快速繁殖是当代农业生物技术在生产上应用最广泛、产生经济效益最大的一个领域。组织培养快速繁殖种苗具有其独特的优越性，首先繁殖系数大，能以比常规方法快数千到数百万倍的速度进行扩大繁殖，及时提供大量优质种苗，使一个新的品种能够在短时间内满足生产的需要，加速引种和良种的推广进程；使用的繁殖材料小和少；繁殖苗木整齐一致，商品性高，能够保持原品种的优良特性；可进行周年工厂化育苗，生产效率高。对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖(无种子或种子繁殖后代出现种性的衰退)的植物品种的繁殖，利用组织培养快速繁殖更为重要。
[0008]目前，虽然已有葛属京西葛、粉葛、美国葛藤、泰国葛和野葛几个品种的组织培养育苗技术专利与报道发表，但不同物种，甚至同一物种、不同品种之间，其组织培养方法也有很大的差异性。大巴山粉葛是一个新品种，还尚无组织培养快速育苗的报道。而且，粉葛组织培养还存在这一些问题:野外取材很难保证母本的遗传品质；粉葛葛藤上绒毛多，污染率高，难以建立无菌体系；增殖率低。因此，寻求并探索大巴山粉葛组织培养快速繁殖育苗技术，是扩大大巴山粉葛种源生产,解决生产中种苗需求的迫切任务。
【发明内容】
[0009]本发明目的是提供一种粉葛组织培养育苗方法，利用组织培养技术，提高粉葛的繁殖系数，培育出遗传性状稳定的粉葛无性系。
[0010]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种粉葛组织培养快速育苗方法，包括如下步骤:
[0011](I)预处理将优株块根进行盆栽，放置在温室大棚中，待其发出芽藤蔓长至20cm，开始喷洒1%多菌灵溶液，每周一次，持续一个半月，藤蔓长至Irn时开始取材；
[0012](2)无菌材料体系的建立选取当年生粉葛葛藤，剪去叶片和叶柄，切割成1.0~
1.5cm长带有腋芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，然后用洗衣粉液浸泡10~30min，用软刷刷洗茎段后再置流水下冲洗I~2h，在超净工作台上，将洗涤好的茎段用质量浓度为75%酒精浸泡15~20s，无菌水冲洗2~4次，然后用0.1 %的氯化汞浸泡3~5min,无菌水冲洗4~6次再用2%次氯酸钠处理8~IOmin,无菌水冲洗4~6次,用滤纸吸干带芽茎段获得无菌材料；
[0013](3)诱导培养将上述步骤获得的无菌带芽茎段先接种到1/2MS培养基上，黑暗条件下培养10~15d，减少褐化发生，然后转入芽诱导培养基上促进腋芽的萌发和生长，按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养；
[0014](4)芽的增殖芽诱导培养25±2d，腋芽萌发生长至I~1.5cm，将其全部转入增殖培养基进行反复增殖，获得大量的增殖苗后转入生根培养；
[0015](5)生根培养从增`殖培养中选取2~3cm的芽进行生根培养；
[0016](6)炼苗移栽将生根培养的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶练苗6~8d，然后打开瓶口，在瓶内加入PP333与多菌灵混合液，防止细菌污染以及促进壮苗，再放置7~10d，炼苗完成后，用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
[0017]进一步的:所述粉葛选自大巴山粉葛。
[0018]进一步的:所述步骤(2)的诱导培养条件为:温度24~26°C、光强25001x、湿度70%。
[0019]进一步的:所述步骤(2)的诱导培养基含有MS基础培养基+0.5~l.0mg/L6-BA+0.1 ~0.3mg/L IBA+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7.0g/L。
[0020]进一步的:所述步骤(3)的增殖培养基含有MS基础培养基+0.3~0.5mg/L6-BA+0 ~0.lmg/L IBA+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7.0g/L。
[0021]进一步的:所述步骤(4)的生根培养基含有1/2MS基础培养基+0~0.lmg/LIBA+鹿糖 30g/L+ 琼脂 7.0g/L。
[0022]进一步的:所述培养基的pH为5.8~6.0。
[0023]进一步的:所述步骤(5)炼苗移栽时空气温度为20~25°C，湿度为85%。
[0024]本发明中，1/2MS指MS培养基中的大量元素减半，其他均保持不变。
[0025]本发明的有益技术效果是:本发明的粉葛组织培养快速育苗方法，应用组织培养方法，可以有效的保持了优良母本的稳定性状。与常规的扦插和压条繁殖相比，组织培养能够用较少的优良母本，繁殖出大批量的种苗。在同一时间段内(60d)，扦插每个母本只能繁殖出一个有效苗，组织培养的繁殖系数是扦插的的20~30倍。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明；
[0027]实施实例一
[0028]一种粉葛组织培养快速育苗方法，包括如下步骤:
[0029](I)预处理将大巴山粉葛优株块根进行盆栽，放置在温室大棚中，待其发出芽藤蔓长至20cm，开始喷洒1%多菌灵溶液，每周一次，持续一个半月，藤蔓长至Im时开始取材；
[0030](2)无菌材料体系的建立选取当年生粉葛葛藤，剪去叶片和叶柄，切割成1.0cm长带有腋芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，然后用洗衣粉液浸泡lOmin，用软刷刷洗茎段后再置流水下冲洗lh，在超净工作台上，将洗涤好的茎段用质量浓度为75%酒精浸泡150s,无菌水冲洗2次,然后用0.1 %的氯化萊浸泡3min,无菌水冲洗4次再用2%次氯酸钠处理8min，无菌水冲洗4次，用滤纸吸干带芽茎段获得无菌材料；
[0031](3)诱导培养将上述步骤获得的无菌带芽茎段先接种到1/2MS培养基上，黑暗条件下培养10d，减少褐化发生，然后转入芽诱导培养基(诱导培养基含有MS基础培养基+0.5mg/L6-BA+0.lmg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)上促进腋芽的萌发和生长，按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养，培养温度24°C、光强25001x、湿度70% ；
[0032](4)芽的增殖在芽诱导培养23d，腋芽萌发生长至1cm，将其全部转入增殖培养基(增殖培养基含有MS基础培养基+0.3mg/L6-BA+0.lmg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)进行反复增殖培养，获得大量的增殖苗后转入生根培养；
[0033](5)生根培养从增殖培养中选取2cm的芽进行生根培养(生根培养基含有1/2MS基础培养基 +0.lmg/L IBA+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7.0g/L)；
[0034](6)炼苗移栽将生根培养的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶练苗6d，然后打开瓶口，再放置3d，炼苗完成后，用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物，空气温度控制在20°C，湿度为85%，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
[0035]上述所用的培养基均采用lmol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8~6.0。
[0036]实施实例二
[0037]一种粉葛组织培养快速育苗方法，包括如下步骤:
[0038](I)预处理将大巴山粉葛优株块根进行盆栽，放置在温室大棚中，待其发出芽藤蔓长至20cm，开始喷洒1%多菌灵溶液，每周一次，持续一个半月，藤蔓长至Im时开始取材；
[0039](2)无菌材料体系的建立选取当年生粉葛葛藤，剪去叶片和叶柄，切割成1.3cm长带有腋芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，然后用洗衣粉液浸泡20min，用软刷刷洗茎段后再置流水下冲洗1.5h，在超净工作台上，将洗涤好的茎段用质量浓度为75%酒精浸泡18s,无菌水冲洗3次,然后用0.1 %的氯化萊浸泡4min,无菌水冲洗5次再用2%次氯酸钠处理9min，无菌水冲洗5次，用滤纸吸干带芽茎段获得无菌材料；[0040](3)诱导培养将上述步骤获得的无菌带芽茎段先接种到1/2MS培养基上，黑暗条件下培养13d，减少褐化发生，然后转入芽诱导培养基(诱导培养基含有MS基础培养基+0.7mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)上促进腋芽的萌发和生长，按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养，培养温度25°C、光强25001x、湿度70% ；
[0041](4)芽的增殖在芽诱导培养25d，腋芽萌发生长至1.2cm，将其全部转入增殖培养基(增殖培养基含有MS基础培养基+0.4mg/L6-BA+0.lmg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)进行反复增殖培养，获得大量的增殖苗后转入生根培养；
[0042](5)生根培养从增殖培养中选取2.5cm的芽进行生根培养(生根培养基含有1/2MS基础培养基+0.lmg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)；
[0043](6)炼苗移栽将生根培养的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶练苗7d，然后打开瓶口，再放置5d，炼苗完成后，用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物，空气温度控制在20°C，湿度为85%，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
[0044]上述所用的培养基均采用lmol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8~6.0。
[0045]实施实例三
[0046]—种粉葛组织培养快速育苗方法，包括如下步骤:
[0047](I)预处理将大巴山粉葛优株块根进行盆栽，放置在温室大棚中，待其发出芽藤蔓长至20cm，开始喷洒1%多菌灵溶液，每周一次，持续一个半月，藤蔓长至Im时开始取材；
[0048](2)无菌材料体系`的建立选取当年生粉葛葛藤，剪去叶片和叶柄，切割成1.5cm长带有腋芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，然后用洗衣粉液浸泡30min，用软刷刷洗茎段后再置流水下冲洗2h，在超净工作台上，将洗涤好的茎段用质量浓度为75%酒精浸泡20s,无菌水冲洗4次,然后用0.1 %的氯化萊浸泡5min,无菌水冲洗6次再用2%次氯酸钠处理lOmin，无菌水冲洗6次，用滤纸吸干带芽茎段获得无菌材料；
[0049](3)诱导培养将上述步骤获得的无菌带芽茎段先接种到1/2MS培养基上，黑暗条件下培养15d，减少褐化发生，然后转入芽诱导培养基(诱导培养基含有MS基础培养基+1.0mg/L6-BA+0.3mg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)上促进腋芽的萌发和生长，按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养，培养温度24°C、光强25001x、湿度70% ；
[0050](4)芽的增殖在芽诱导培养27d，腋芽萌发生长至1.5cm,将其全部转入增殖培养基(增殖培养基含有MS基础培养基+0.5mg/L6-BA+0.lmg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L)进行反复增殖培养，获得大量的增殖苗后转入生根培养；
[0051](5)生根培养从增殖培养中选取3cm的芽进行生根培养(生根培养基含有1/2MS基础培养基 +0.lmg/L IBA+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7.0g/L)；
[0052](6)炼苗移栽将生根培养的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶练苗8d，遮阴度为70%，然后打开瓶口，再放置7d，炼苗完成后，用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物，空气温度控制在20°C，湿度为85%，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
[0053]上述所用的培养基均采用lmol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8~6.0。[0054]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作 的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于:包括如下步骤: (O预处理将优株块根进行盆栽，放置在温室大棚中，待其发出芽藤蔓长至20cm，开始喷洒1%多菌灵溶液，每周一次，持续一个半月，藤蔓长至Im时开始取材； (2)无菌材料体系的建立选取当年生粉葛葛藤，剪去叶片和叶柄，切割成1.0~1.5cm长带有腋芽的茎段，将带芽茎段置于自来水下冲洗30min，然后用洗衣粉液浸泡10~30min，用软刷刷洗茎段后再置流水下冲洗I~2h，在超净工作台上，将洗涤好的茎段用质量浓度为75%酒精浸泡15~20s，无菌水冲洗2~4次，然后用0.1 %的氯化汞浸泡3~5min,无菌水冲洗4~6次再用2%次氯酸钠处理8~IOmin,无菌水冲洗4~6次,用滤纸吸干带芽茎段获得无菌材料； (3)诱导培养将上述步骤获得的无菌带芽茎段先接种到1/2MS培养基上，黑暗条件下培养10~15d，减少褐化发生，然后转入芽诱导培养基上促进腋芽的萌发和生长，按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养； (4)芽的增殖芽诱导培养25±2d，腋芽萌发生长至I~1.5cm，将其全部转入增殖培养基进行反复增殖，获得大量的增殖苗后转入生根培养； (5)生根培养从增殖培养中选取2~3cm的芽进行生根培养； (6)炼苗移栽将生根培养的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶练苗6~8d，然后打开瓶口，在瓶内加入PP333与多菌灵混合液，防止细菌污染以及促进壮苗，再放置7~10d，炼苗完成后，用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，用多菌灵处理后移栽至营养土中，营养土上层为2cm河沙，下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混 合物，待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
2.根据权利要求1所述粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于:所述粉葛选自大巴山粉葛。
3.根据权利要求1所述粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于:所述步骤(3)的诱导培养条件为--温度24~26°C、光强25001x、湿度70%。
4.根据权利要求1所述粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于:所述步骤(3)的诱导培养基含有MS基础培养基+0.5~1.0mg/L6-BA+0.1~0.3mg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。
5.根据权利要求1所述粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于:所述步骤(4)的增殖培养基含有MS基础培养基+0.3~0.5mg/L6-BA+0~0.lmg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。
6.根据权利要求1所述粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于:所述步骤(5)的生根培养基含有1/2MS基础培养基+0~0.lmg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。
7.根据权利要求4~6任一项所述粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于:所述培养基的pH为5.8~6.0。
8.根据权利要求1所述粉葛组织培养快速育苗方法，其特征在于:所述步骤(5)炼苗移栽时空气温度为20~25°C，湿度为85%。
【文档编号】A01G31/00GK103598098SQ201310585519
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】钟宇, 张鲁, 余长春, 郑阳霞, 万学琴, 张健, 李贤伟, 冯茂松 申请人:四川农业大学