一种单子叶植物的组织培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种单子叶植物的组织培养方法。该方法涉及一种包括如下步骤的获得单子叶植物II型愈伤组织的方法：1）以单子叶植物的成熟种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，25±2℃避光诱导培养4-6周，获得愈伤组织1；2）从步骤1）获得的愈伤组织1剥去最外层的白色愈伤组织，取内部黄色的胚性愈伤组织，接种于愈伤组织继代培养基上，25±2℃避光培养3周，获得愈伤组织2；3）从步骤2）获得的愈伤组织2中选取在继代培养的3周时间内体积增大60%以上的愈伤组织；即为II型愈伤组织。实验证明，本发明适用于不同生态型的枝稷，且可在较短时间内获得再生效率高的优良愈伤组织，节省时间及成本，加快柳枝稷基因改良的生物育种进程。
【专利说明】一种单子叶植物的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组培领域，涉及一种单子叶植物的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]单子叶植物的细胞再生多通过体细胞胚发生途径。高效、快速获得高频再生的胚性愈伤组织是单子叶植物进行生物技术育种的基础。但是对于大多数单子叶植物如柳枝稷、小麦、玉米的自交系要获得高效再生而且还可以进行遗传转化的胚性细胞系需要经过长时间的愈伤组织培养。
[0003]柳枝稷(Panicumvirgatum L.)属禾本科(Gramineae)黍亚科(Panicoideae)黍属，为多年生草本植物，原产于北美大陆，适应性强，对土壤环境要求低，生物量大，被作为新型的能源植物。但由于柳枝稷木质素含量高，抗逆性方面还有待提高，要获得更高的经济效益，有必要对柳枝稷进行相应性状的遗传育种改良。柳枝稷具自交不亲和性和异源多倍体的遗传特性，采用传统育种方法难度较大，为此，目前的研究多采用生物技术及基因工程的方法。基因工程育种的关键是建立闻效再生体系，以提供拟改良目标性状基因的受:体材料和遗传转化后受体细胞的培养系统。但已报道的柳枝稷植株再生成功方面的研究主要集中在低地型品种，且再生周期长、效率低，有必要优化柳枝稷的再生体系，以便对其进行高效率遗传改良。
[0004]在柳枝稷遗传转化体系的建立过程中，获得再生能力强，转化效率高的愈伤组织一直是研究的重点及难点。在优良愈伤组织获得方面，虽有多例报道，但因为挑选效率低或应用特殊的外植体材料等难以普遍应用，并且组培材料局限于低地型柳枝稷品种 Performer、Alamo 及 Alamo 衍生材料。2009 年 Burris 等(Burris J N, Mann D GJ, Joyce B L, et al.An improved tissue culture system for embryogenic callusproduction and plant regeneration in switchgrass(Panicum virgatum L.)[J].BioEnergy Research, 2009, 2(4): 267-274)以柳枝稷Alamo2花序为外植体进行再生研究时首次描述了柳枝稷优良愈伤的形态，表明此类愈伤与玉米的II型愈伤相似。但使用花序为外植体受季节限制，不能得到广泛应用。随后，2011年Li等(Li R Y，Qu R D.Highthroughput Agrobacterium-mediated switchgrass transformation[J].Biomass andBioenergy, 2011，35(3): 1046-1054)以成熟种子为外植体建立的遗传转化体系中再一次提到柳枝稷黄色、干燥、易碎的愈伤易于再生，此类愈伤的再生率达90%以上。但是，就其报道来看，获得此类愈伤组织比较困难，需经过长时间的愈伤培养(6个月以上)才可以挑选到约10%的胚性愈伤，期间有大量愈伤组织需要继代培养，工作量大，挑选效率低。并且，随着培养基组分的不同、柳枝稷品种的不同，优良愈伤的形态颜色也会发生变化。因此，仅根据对优良愈伤组织的描述很难挑出该类愈伤组织。为获得柳枝稷高效再生的材料，2011年 Xu 等(Xu B, Huang L k,Shen Z X,et al.Selection and characterization of a newswitchgrass(Panicum virgatum L.) line with high somatic embryogenic capacity forgenetic transformation [J].Scientia Horticulturae, 2011, 129(4):854-861)通过对500粒Alamo成熟种子的愈伤组织进行筛选，获得再生能力较高的愈伤组织细胞系，筛选出的愈伤再生获得苗结实后，对其种子再进行一次筛选，获得新种HR8，据报道84.9%的HR8成熟种子能产生胚性愈伤。筛选培育高再生能力的柳枝稷材料或许是一种有效的方法，但对于大多数柳枝稷品种要获得高再生的新品系难度大、工作量大、筛选周期长，至少需要2-3轮(年)选择才能可能获得高效再生的材料。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种单子叶植物的组织培养方法。
[0006]本发明所提供的单子叶植物的组织培养方法，涉及一种获得单子叶植物II型愈伤组织的方法，该方法也属于本发明的保护范围。
[0007]本发明所提供的获得单子叶植物II型愈伤组织的方法，具体可包括如下步骤:
[0008](I)以单子叶植物的成熟种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，25±2°C(如25°C )避光诱导培养4-6周(如6周)，获得愈伤组织I ;
[0009](2)从步骤(1)获得的愈伤组织I剥去最外层的白色愈伤组织，取内部黄色的胚性愈伤组织，接种于愈伤组织继代培养基上，25±2°C (如25°C )避光继代培养3周，获得愈伤组织2 ；
[0010]其中，所述最外层的白色愈伤组织结构疏松，含水量大呈棉花状，无硬核，生长快，不能分化成苗。所述内部黄色的胚性愈伤组织为一团表面多突起，色泽鲜亮的愈伤组织。
[0011](3)从步骤(2)获得的愈伤组织2中选取在继代培养的3周时间内体积增大60%以上(如60%)的愈伤组织；即为II型愈伤组织。
[0012]进一步，所述II型愈伤组织在解剖镜下有明显胚性化细胞，呈微黄色，结构松脆，生长旺盛，色泽鲜亮，增殖较快，容易分化成苗。
[0013]本发明所提供的单子叶植物的组织培养方法，具体可包括如下步骤:
[0014](I)以单子叶植物的成熟种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，25±2°C(如25°C )避光诱导培养4-6周(如6周)，获得愈伤组织I ;
[0015](2)将步骤(1)获得的愈伤组织I剥去最外层的白色愈伤组织，取内部黄色的胚性愈伤组织，接种于愈伤组织继代培养基上，25±2°C避光继代培养3周，获得愈伤组织2 ；
[0016]其中，所述最外层的白色愈伤组织结构疏松，含水量大呈棉花状，无硬核，生长快，不能分化成苗。所述内部黄色的胚性愈伤组织为一团表面多突起，色泽鲜亮的愈伤组织。
[0017](3)从步骤(2)获得的愈伤组织2中选取II型愈伤组织接种于分化培养基上，25±2°C光照培养4周，光照周期为1611/黑暗811，光照强度为20(^11101 IrT2iT1,获得再生芽；
[0018]所述II型愈伤组织为在所述继代培养的3周时间内体积增大60%以上(如60%)的愈伤组织；
[0019]进一步，所述II型愈伤组织在解剖镜下有明显胚性化细胞，呈微黄色，结构松脆，生长旺盛，色泽鲜亮，增殖较快，容易分化成苗。
[0020]在实际操作中，也可以将从步骤(2) —粒种子胚获得的愈伤组织2中选取的所述II型愈伤组织进行多次继代培养，形成细胞系，后再接种于所述分化培养基上。在此过程中，来源于同一个所述成熟单粒种子的II型愈伤组织单独培养，从而可消除同一品种间的遗传差异性。[0021](4)将步骤(3)获得的再生芽接种生根培养基上，25±2°C光照培养2周，光照周期为16h/黑暗8h，光照强度为200 μ mol π 1，获得再生苗。
[0022]在上述两个方法中，所述愈伤组织诱导培养基均具体可为MB固体培养基或MS7固体培养基或ΝΒ7固体培养基；所述愈伤组织继代培养基具体可为MP固体培养基；所述分化培养基具体可为REG固体培养基；所述生根培养基具体可为1/2MS固体培养基。
[0023]更加具体的，所述MB固体培养基是在MS固体培养基中加入麦芽糖、2，4_D和6-BA后得到的培养基；所述MB固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/L、2，4-D的终浓度为5mg/L、6-BA的终浓度为lmg/L ;所述MS7固体培养基是在MS固体培养基中加入麦芽糖和2，4-D后得到的培养基；所述MS7固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/L、2，4-D的终浓度为7mg/L ;所述NB7固体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下:硝酸钾2830mg/L，硫酸铵463mg/L, 二水合氯化韩166mg/L,七水合硫酸镁185mg/L,磷酸二氢钾400mg/L,七水合硫酸亚铁27.8mg/L,四水合硫酸猛4.4mg/L,七水合硫酸锌1.5mg/L,硼酸1.6mg/L,碘化钾0.8mg/L,Na2 *EDTA.2H2037.3mg/L,肌醇 lOOmg/L,烟酸 lmg/L,盐酸批卩多醇 lmg/L,盐酸硫胺素 IOmg/L,麦芽糖30g/l，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2，4_D7mg/L，植物凝胶4.0g/Ι ;所述MP固体培养基是在所述MB固体培养基中加入终浓度为2g/L的脯氨酸后得到的培养基；所述REG固体培养基是在MS固体培养基中加入NAA、GA、6-BA和麦芽糖后得到的培养基；所述REG固体培养基中NAA的终浓度为0.2mg/L、GA的终浓度为0.5mg/L、6_BA的终浓度为Img/L、麦芽糖的终浓度为30g/L ;所述1/2MS固体培养基为将MS固体培养基中的大量元素组分浓度减半其余组分浓度不变，再加入麦芽糖后得到的培养基；所述1/2MS固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/l。
[0024]在上述两种方法的步骤(1)中，将作为外植体的所述成熟种子接种于所述愈伤组织诱导培养基上，具体可为如下(al)或(a2):
[0025](al)将所述成熟种子直接接种于所述愈伤组织诱导培养基；
[0026](a2)将所述成熟种子的盾片纵切后接种于所述愈伤组织诱导培养基。
[0027]在上述方法的步骤(1)中，在将作为外植体的所述成熟种子接种于所述愈伤组织诱导培养基上之前，还包括对所述成熟种子按照如下方法进行消毒的步骤:将所述成熟种子在体积分数5%的次氯酸钠水溶液中浸泡1.5h，用无菌去离子水洗涤(如洗涤5次)后浸泡于无菌去离子水中放于4°C的培养箱内3天，3天之后再用体积分数5%的次氯酸钠水溶液处理30min，无菌去离子水洗涤(如洗涤5次)。
[0028]本发明的还一个目的是提供用于单子叶植物的组织培养的成套培养基。
[0029]本发明所提供的用于单子叶植物的组织培养的成套培养基，具体由独立包装的如下培养基中的全部或部分组成:
[0030](a)愈伤组织诱导培养基；
[0031]所述愈伤组织诱导培养基为以上所述MB固体培养基或所述MS7固体培养基或所述NB7固体培养基；
[0032](b)愈伤组织继代培养基；
[0033]所述愈伤组织继代培`养基为以上所述MP固体培养基；
[0034](C)分化培养基；
[0035]所述分化培养基为以上所述REG固体培养基；[0036](d)生根培养基
[0037]所述生根培养基为以上所述1/2MS固体培养基。
[0038]利用本发明所提供的获得单子叶植物II型愈伤组织的方法获得的II型愈伤组织在作为遗传转化材料中的应用也属于本发明的保护范围。
[0039]在所述方法中，来源于同一个所述成熟种子的II型愈伤组织单独培养，从而可消除同一品种间的遗传差异性。
[0040]在本发明中，以上所有的所述单子叶植物均可为柳枝稷。
[0041]进一步，所述柳枝稷可为低地型柳枝稷、过度型柳枝稷或高地型柳枝稷。
[0042]更加具体的,在本发明中，所述低地型柳枝稷为柳枝稷品种Alamo或Performer ；所述过度型柳枝稷为柳枝稷品种Carthage ;所述高地形柳枝稷为柳枝稷品种Blackwell或Dacotah0
[0043]本发明通过定向挑选由成熟种子胚的优良II型愈伤组织，建立了柳枝稷低地型和高地型品种的高频植株再生体系，遗传转化实验证明在该技术流程下所挑选的胚性愈伤组织适宜于进行遗传转化。本发明使多倍体作物应用生物技术育种方向更为明确、效率更高。适宜于快速挑选获得高频再生的单子叶植物的胚性愈伤组织。本发明的实施例中将柳枝稷成熟胚产生的愈 伤组织分为三种类型，并且明确指出各类型愈伤组织形态特征及在整体中的存在位置。借助显微镜通过两次挑选，轻松获得优良II型愈伤组织。本方法适用于各生态型柳枝稷，容易操作，只需9周时间即可获得由单粒种子产生的优良细胞系，消除同一品种间的遗传差异性。另外，为进一步降低挑选难度，借助显微镜将成熟胚纵切，可增加了优良愈伤的量。
[0044]本发明适用于不同生态型的柳枝稷品种，并且可使组培工作人员在较短的时间内获得再生效率高的优良愈伤组织，节省时间及成本，加快柳枝稷基因改良的生物技术育种进程。另外，本发明所述的方法也适用于其它单子叶植物的再生，遗传转化和生物技术育种。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1为实施例1中柳枝稷Alamo的II型愈伤组织的挑选、再生及转化。其中，A:愈伤组织诱导6周；B:体视显微镜下成熟种子诱导产生的愈伤组织；C:外层愈伤组织剖开后，可见内部紧实，黄色胚性愈伤组织(箭头指向处)；D:第一次挑选后，继代培养三周时愈伤组织形态(箭头指向处为II型愈伤组织)；E:继代培养一个月的II型愈伤组织；F:11型愈伤组织分化培养三周；G:农杆菌侵染II型愈伤组织后共培养；H:GUS基因瞬时表达(愈伤组织被染成蓝色)；1:未转化愈伤组织经过潮霉素筛选后，分化培养三周，筛选率为100% J:II型愈伤组织经农杆菌侵染后，分化培养三周；K:生根培养；L:分化苗移栽。
[0046]图2为实施例2中柳枝稷Performer的II型愈伤组织的挑选、再生及转化。其中，A:愈伤组织诱导6周；B:体视显微镜下成熟种子诱导产生的愈伤组织；C:外层愈伤组织剖开后，内部紧实胚性愈伤组织(箭头指向处)；D:第一次挑选后，继代培养三周时愈伤组织形态(箭头指向处为II型愈伤组织)；E: II型愈伤组织；F: II型愈伤组织分化培养三周；G: II型愈伤组织经农杆菌侵染后共培养:⑶S基因瞬时表达(愈伤组织被染成蓝色)；1:未转化愈伤组织经过潮霉素筛选后，分化培养三周，筛选率为100% J: II型愈伤组织经农杆菌侵染后，分化培养三周；κ:生根培养；L:分化苗移栽。
[0047]图3为实施例3中柳枝稷Carthage的II型愈伤组织的挑选及再生。其中，A:愈伤组织诱导6周；B:体视显微镜下成熟种子诱导产生的愈伤组织；C:外层愈伤组织剖开后，内部紧实的胚性愈伤组织(箭头指向处);D: II型愈伤组织分化三周；E:生根培养；F:分化苗移栽。
[0048]图4为实施例4中柳枝稷Blackwell的II型愈伤组织的挑选及再生。其中，A:愈伤组织诱导6周；B:体视显微镜下成熟种子诱导产生的愈伤组织；C:外层愈伤组织剖开后，内部紧实的胚性愈伤组织(箭头指向处);D: II型愈伤组织分化三周；E:生根培养；F:分化苗移栽。
[0049]图5为实施例5中柳枝稷Dacotah II的II型愈伤组织的挑选及再生。其中，A:愈伤组织诱导6周；B:体视显微镜下成熟种子诱导产生的愈伤组织；C:外层愈伤组织剖开后，内部紧实的胚性愈伤组织(箭头指向处);D: II型愈伤组织分化三周；E:生根培养；F:分化苗移栽。
【具体实施方式】
[0050]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0051]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052]柳枝稷品种Alamo、Performer、Carthage、Blackwell 和 Dacotah 成熟种子均来源于美国 Ernst Conservation Seeds 公司(详见 http://www.ernstseed.com/biomass/switchgrass-variety-zone-map-key/ ；8884Mercer Pike, Meadville PA16335.U.S.A),生产于2010 年。
`[0053]pCAMBIA1301 质粒为 Cambia 公司产品，货号为 VZC0324。
[0054]下述实施例中所涉及的MS液体培养基的pH为5.8-5.9，溶剂为水，溶质及其浓度如下:
[0055]a.大量=NH4NO3L 65g/L, KNO3L 9g/L, MgSO4.7Η200.37g/L, KH2PO40.17g/L,CaCl20.33g/L ；
[0056]b.微量:ΚΙ0.0083mg/L, H3B038mg/L, MnSO4.4H2022.3mg/L, ZnSO4.7H2010mg/L,Na2MoO4.2H200.25mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L ；
[0057]c.维生素:烟酸0.5mg/L,批唆醇0.5mg/L,硫胺素0.lmg/L,甘氨酸2mg/L ；
[0058]d.铁盐:FeS04.7Η2027.85mg/L, Na2EDTA37.25mg/L ；
[0059]e.肌醇 0.lg/L。
[0060]以上各浓度为相应组分在所述MS液体培养基中的终浓度。
[0061]MS固体培养基:均为在所述MS液体培养基中加入终浓度为4g/L的植物凝胶后得到的固体培养基。
[0062]相应的，下述实施例中所涉及的以下各培养基配方如下:
[0063]
【权利要求】
1.一种获得单子叶植物II型愈伤组织的方法，包括如下步骤: (1)以单子叶植物的成熟种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，25±2°c避光诱导培养4-6周，获得愈伤组织1; (2)从步骤(1)获得的愈伤组织1剥去最外层的白色愈伤组织，取内部黄色的胚性愈伤组织，接种于愈伤组织继代培养基上，25±2°C避光条件下继代培养3周，获得愈伤组织2 ； (3)从步骤(2)获得的愈伤组织2中选取在所述继代培养的3周时间内体积增大60%以上的愈伤组织；即为II型愈伤组织。
2.—种单子叶植物的组织培养方法，包括如下步骤: (1)以单子叶植物的成熟种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，25±2°C避光诱导培养4-6周，获得愈伤组织1 ; (2)将步骤(1)获得的愈伤组织1剥去最外层的白色愈伤组织，取内部黄色的胚性愈伤组织，接种于愈伤组织继代培养基上，25±2°C避光条件下继代培养3周，获得愈伤组织2 ； (3)从步骤(2)获得的愈伤组织2中选取II型愈伤组织接种于分化培养基上，25±2°C光照培养4周，光照周期为16h/黑暗8h，光照强度为200 μ mol M-2S-1,获得再生芽； 所述II型愈伤组织为在继代培养的3周时间内体积增大60%以上的愈伤组织； (4)将步骤(3)获得的再生芽接种生根培养基上，25±2°C生根培养2周，光照周期为16h/黑暗8h，光照强度为200 μ mol M-2S-1，获得再生苗。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述愈伤组织诱导培养基为MB固体培养基或MS7固体培养基或ΝΒ7固体培养基；或 所述愈伤组织继代培养基为固体MP培养基；或 所述分化培养基为REG固体培养基；或 所述生根培养基为1/2MS固体培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于: 所述MB固体培养基是在MS固体培养基中加入麦芽糖、2，4-D和6-ΒΑ后得到的培养基；所述MB固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/L、2，4-D的终浓度为5mg/L、6_BA的终浓度为 lmg/L ； 所述MS7固体培养基是在MS固体培养基中加入麦芽糖和2，4-D后得到的培养基；所述MS7固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/L、2，4-D的终浓度为7mg/L ； 所述NB7固体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下:硝酸钾2830mg/L，硫酸铵463mg/L, 二水合氯化韩166mg/L,七水合硫酸镁185mg/L,磷酸二氢钾400mg/L,七水合硫酸亚铁27.8mg/L,四水合硫酸猛4.4mg/L,七水合硫酸锌1.5mg/L,硼酸1.6mg/L,碘化钾0.8mg/L,Na2 *EDTA.2H2037.3mg/L,肌醇 l00mg/L,烟酸 lmg/L,盐酸批卩多醇 lmg/L,盐酸硫胺素 10mg/L,麦芽糖30g/L，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2，4_D7mg/L，植物凝胶4.0g/L ； 所述MP固体培养基是在所述MB固体培养基中加入终浓度为2g/L的脯氨酸后得到的培养基; 所述REG固体培养基是在MS固体培养基中加入NAA、GA、6_BA和麦芽糖后得到的培养基；所述REG固体培养基中NAA的终浓度为0.2mg/L、GA的终浓度为0.5mg/L、6_BA的终浓度为lmg/L、麦芽糖的终浓度为30g/L ； 所述1/2MS固体培养基为将MS固体培养基中的大量元素组分浓度减半其余组分浓度不变，再加入麦芽糖后得到的培养基；所述1/2MS固体培养基中麦芽糖的终浓度为30g/L。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，将作为外植体的所述成熟种子接种于所述愈伤组织诱导培养基上，为如下(al)或(a2): (al)将所述成熟种子直接接种于所述愈伤组织诱导培养基； (a2)将所述成熟种子的盾片纵切后接种于所述愈伤组织诱导培养基。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，在将作为外植体的所述成熟种子接种于所述愈伤组织诱导培养基上之前，还包括对所述成熟种子按照如下方法进行消毒的步骤:将所述成熟种子在体积分数5%的次氯酸钠水溶液中浸泡1.5h，用水洗涤后浸泡于水中放于4°C的培养箱内3天，3天之后再用体积分数5%的次氯酸钠水溶液处理30min,水洗漆。
7.用于单子叶植物的组织培养的成套培养基，由独立包装的如下培养基中的全部或部分组成: Ca)愈伤组织诱导培养基； 所述愈伤组织诱导培养基为权利要求3或4中的所述MB固体培养基或所述MS7固体培养基或所述NB7固体培养基； (b)愈伤组织继代培养基； 所述愈伤组织继代培养基为权利要求3或4中的所述MP固体培养基； (c)分化培养基； 所述分化培养基为权利要求3或4中的所述REG固体培养基； Cd)生根培养基 所述生根培养基为权利要求3或4中的所述1/2MS固体培养基。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法或成套培养基，其特征在于:所述单子叶植物为柳枝稷； 所述柳枝稷具体为低地型柳枝稷、过度型柳枝稷或高地型柳枝稷； 所述低地型柳枝稷具体为柳枝稷品种Alamo或Performer ;所述过度型柳枝稷具体为柳枝稷品种Carthage ;所述高地形柳枝稷具体为柳枝稷品种Blackwell或Dacotah。
9.利用权利要求1、3-6和8中任一所述的方法获得的II型愈伤组织在作为遗传转化材料中的应用。
10.根据权利要求1-6和8中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，来源于同一个所述成熟种子的所述II型愈伤组织单独培养。
【文档编号】A01H4/00GK103766221SQ201410046615
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月10日 优先权日:2014年2月10日
【发明者】张万军, 刘燕蓉, 马宁, 叶文兴, 张蕴薇 申请人:中国农业大学