一种茴茴蒜愈伤组织培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种植物愈伤组织培养方法，特别是一种茴茴蒜愈伤组织培养方法。本发明茴茴蒜愈伤组织培养方法包括外植体选择与灭菌，愈伤组织诱导，愈伤组织扩大繁殖三个步骤。本发明可在较短时间内获得大量茴茴蒜愈伤组织，实现了对茴茴蒜愈伤组织的有效诱导和快速增殖，解决了茴茴蒜资源需求问题，具有生产周期短、增殖速度快的特点，能够用于茴茴蒜有效成分的提取和制药工业。
【专利说明】一种茴茴蒜愈伤组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物愈伤组织培养方法，特别是一种茴茴蒜愈伤组织培养方法。【背景技术】
[0002]茴茴蒜(Ranunculuschinensis Bunge)为毛茛科(Ranunculaceae)毛莫属(Ranunculus)植物，具有较高的药用价值。全草入药，药用范围广泛，有消炎、止痛、截疟、杀虫等功效，常用来治疗肝炎、肝硬化、疟疾、胃炎、溃疡哮喘、风湿关节痛等疾病。目前，虽然茴茴蒜已在临床有所应用，但其植物资源基本来源于野生采挖，难以形成规模化生产，同时，也将会对采集地生态环境及野生茴茴蒜资源造成了极大的损害。利用组织培养技术生产药用植物具有生长周期短、繁殖率高、可不受季节限制周年培养等特点。目前文献中还未见有关于利用愈伤组织培养技术大规模生产茴茴蒜有效成分的研究报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种茴茴蒜愈伤组织培养方法，该方法能够在较短时间内获得大量茴茴蒜愈伤组织，通过生物技术手段解决茴茴蒜植物资源需求问题，为提取茴茴蒜有效成分提供充足原料。
[0004]本发明采用如下技术方案:
[0005](I)外植体的选择与灭菌:以茴茴蒜茎为外植体。采集健康无病害的茴茴蒜茎，无菌水清洗3遍，在70%~75%乙醇中浸泡25~45s，随后放入0.1%~0.15%的HgC12溶液中浸泡5~15min，随后用无菌水清洗3遍。
[0006](2)愈伤组织诱导:取灭菌后的茴茴蒜茎用无菌手术刀切成长度5~IOmm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为:MS+6-BA0.3~Img/L+NAA0.1~lmg/L+蔗糖20~40g/L+琼脂5~8g/L，PH值为5.6~6.0。培养温度为20~30°C，每天光照0~16h，光照强度1000~30001x。
[0007](3)愈伤组织扩大繁殖:无菌条件下，选取绿色或淡黄色无褐变、质地致密的愈伤组织，将其切成边长为3~8mm的立方体后，转接入愈伤组织增殖培养基中。愈伤组织增殖培养基的配方为:M\+6_BA0.5~1.2mg/L+NAA0.1~lmg/L+鹿糖20~40g/L+琼脂5~8g/L，PH值为5.6~6.0。培养温度为20~30°C，每天光照0~16h，光照强度1000~30001x。
[0008]采用本发明培养茴茴蒜愈伤组织，生产周期短、增值速度快、产量大、能耗少，且能够实现大规模生产，有效的解决了茴茴蒜临床应用需求与野生资源保护之间的矛盾。
【具体实施方式】
[0009]实施例一:
[0010](I)外植体的选择与灭菌:以茴茴蒜茎为外植体。采集健康无病害的茴茴蒜茎，无菌水清洗3遍，在75%乙醇中浸泡40s，随后放入0.1 %的HgCl2溶液中浸泡lOmin，随后用无菌水清洗3遍。[0011](2)愈伤组织诱导:取灭菌后的茴茴蒜茎用无菌手术刀切成长度8mm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH值为5.8。培养温度为25°C，每天光照12h，光照强度20001x。培养30d后，愈伤组织诱导率为90%。
[0012](3)愈伤组织扩大繁殖:无菌条件下，选取绿色或淡黄色无褐变、质地致密的愈伤组织，将其切成边长为5mm的立方体后，转接入愈伤组织增殖培养基中。愈伤组织增殖培养基的配方为:MS+6-BAl.0mg/L+NAA0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，PH值为5.8。培养温度为25V，每天光照12h，光照强度20001x。培养30d后，愈伤组织增殖6倍。
[0013]实施例二:
[0014](1)外植体的选择与灭菌:以茴茴蒜茎为外植体。采集健康无病害的茴茴蒜茎，无菌水清洗3遍，在70% 7醇中浸泡45s，随后放入0.15%的HgC12溶液中浸泡5min，随后用无菌水清洗3遍。
[0015](2)愈伤组织诱导:取灭菌后的茴茴蒜茎用无菌手术刀切成长度IOmm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为:MS+6-BAlmg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，PH值为5.8。培养温度为30'每天光照6h，光照强度30001x。培养30d后，愈伤组织诱导率为80%。
[0016](3)愈伤组织扩大繁殖:无菌条件下，选取绿色或淡黄色无褐变、质地致密的愈伤组织，将其切成边长为8mm的立方体后，转接入愈伤组织增殖培养基中。愈伤组织增殖培养基的配方为:MS+6-BAl.2mg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，PH值为5.6。培养温度为20~30°C，每天光照6h，光照强度30001x。培养30d后，愈伤组织增殖2.2倍。
[0017]实施例三:
[0018](1)外植体的选择与灭菌:以茴茴蒜茎为外植体。采集健康无病害的茴茴蒜茎，无菌水清洗3遍，在75%乙醇中浸泡25s，随后放入0.1 %的HgCl2溶液中浸泡15min，随后用无菌水清洗3遍。
[0019](2)愈伤组织诱导:取灭菌后的茴茴蒜茎用无菌手术刀切成长度5mm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为:MS+6-BA0.3mg/L+NAAlmg/L+蔗糖40g/L+琼脂8g/L，PH值为6.0。培养温度为20°C，每天光照16h，光照强度lOOOlx。培养30d后，愈伤组织诱导率为84%。
[0020](3)愈伤组织扩大繁殖:无菌条件下，选取绿色或淡黄色无褐变、质地致密的愈伤组织，将其切成边长为3mm的立方体后，转接入愈伤组织增殖培养基中。愈伤组织增殖培养基的配方为:MS+6-BAl.2mg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖40g/L+琼脂8g/L，PH值为6.0。培养温度为20~30°C，每天光照16h，光照强度lOOOlx。培养30d后，愈伤组织增殖2.5倍。
【权利要求】
1.一种茴茴蒜愈伤组织培养方法，其特征在于按照如下步骤进行: (1)外植体的选择与灭菌:以茴茴蒜茎为外植体。采集健康无病害的茴茴蒜茎，无菌水清洗3遍，在70%~75%乙醇中浸泡25~45s，随后放入0.1%~0.15%的HgCl2溶液中浸泡5~15min，随后用无菌水清洗3遍。 (2)愈伤组织诱导:取灭菌后的茴茴蒜茎用无菌手术刀切成长度5~IOmm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上，培养温度为20~30°C，每天光照0~16h，光照强度1000~30001x。 (3)愈伤组织扩大繁殖:无菌条件下，选取绿色或淡黄色无褐变、质地致密的愈伤组织，将其切成边长为3~8mm的立方体后，转接入愈伤组织增殖培养基中，培养温度为20~.30°C，每天光照0~16h，光照强度1000~30001x。
2.如权利要求1所述的一种茴茴蒜组织培养方法，其特征在于步骤(1)中外植体为健康舞病害的茴茴蒜茎，外植体的清洗过程为无菌水清洗3遍，在70%乙醇中浸泡25~45s，随后放入0.1 %~0.15%的HgCl2溶液中浸泡5~15min，随后用无菌水清洗3遍。
3.如权利要求1所述的一种茴茴蒜组织培养方法，其特征在于步骤(2)中愈伤组织诱导培养基配方为:MS+6_BA0.3~lmg/L+NAA0.1~lmg/L+鹿糖20~40g/L+琼脂5~8g/L, PH 值为 5.6 ~6.0。
4.如权利要求1所述的一种茴茴蒜组织培养方法，其特征在于步骤(3)中愈伤组织增殖培养基配方为:MS+6-BA0.5~1.2mg/L+NAA0.1~lmg/L+蔗糖20~40g/L+琼脂5~8g/L, PH 值为 5.6 ~6.0。
【文档编号】A01H4/00GK103798148SQ201410080666
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】程玉鹏, 高宁, 刘博
申请人:程玉鹏