一种胚乳特异表达启动子的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种胚乳特异表达启动子。本发明所提供的启动子为如下1)-3)中任一DNA分子：1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。实验证明，本发明所提供的启动子可以驱动目的基因在植物的胚乳中特异性高表达。本发明为人们研究植物基因在籽粒的表达、调控和利用基因工程方法改良作物提供了有用的核心元件；对于专一特异地改良和改造作物籽粒，从而培育新的作物品种具有重要意义。
【专利说明】一种胚乳特异表达启动子
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种胚乳特异表达启动子。
【背景技术】
[0002]在基因表达调控的多级层次中，转录水平的调控对于植物体是非常经济有效的调控方式，各种调控因子通过与启动子结合，开启或关闭基因的表达而达到调控的目的。启动子是基因转录中最主要的一种调节方式，由于基因在不同层次上受不同的调节因子控制，这种控制机制不仅决定基因表达的水平，也决定基因表达的时空顺序，在转录环节中占有十分重要的地位。启动子是基因工程表达载体的重要元件，研究启动子对于基因表达调控机制，改善作物的生产性状，如高产、优质、抗逆等性状具有十分重要的意义。[0003]目前，基因工程中广泛应用的植物组成型启动子逐渐暴露出一些问题，这类启动子驱动的基因在植物不同组织器官中均有不同程度的表达，而多数情况下，人们并不希望外源基因在转基因植物整个植株、整个生育期中广泛表达，因为一方面会增加植株的代谢负担，另一方面，有些外源蛋白对植物并非必需甚至有毒，不利于植物正常生长(Kasuga M, Liu Q, Miura S，et al.1mproving plant drought, salt, and freezingtolerance by gene transfer of a single stress—inducible transcription factor.Nat Biotechnol, 1999，17:287-291.)。因此，研究和利用组织器官特异性启动子显得尤为重要，不仅可以实现对外源基因表达施行时、空、量的三维调控，同时具有经济、环保及生物安全等多方面的潜在价值(Venter M.Synthetic promoters:genetic control throughcis engineering.Trends Plant Sci,2007，12:118-124.)。
[0004]谷类作物的籽粒(即种子)是人类最重要的食物来源之一，同时在基因工程中，人们也将谷类作物的籽粒作为重组蛋白和新陈代谢产物的生物反应器，将营养物质导入作物杆粒已获得成功(Paine JA, Shipton CA, Chaggar S，et al.1mproving thenutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content.NatBiotechnol, 2005, 23:482-487.)。发育成熟的作物籽粒中，绝大部分是胚乳，大约能占到籽粒的 90%左右(Zhou SR, Yin LL, Xue HW.Funtional genomics based understanding ofrice endosperm development.Curr Opin Plant Biol, 2013，16:236-246.)。专一特异地改良和改造作物籽粒，迫切需要利用具有高表达活性的胚乳特异性启动子。因此，寻找新的高表达活性的胚乳特异性启动子具有重要的科学意义和应用价值，可以为研究植物基因在籽粒的表达、调控和利用基因工程方法改良作物提供有用的核心元件。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。
[0006]本发明所提供的具有启动子功能的DNA分子,来源于小麦(Triticum aestivumL.)品种云麦33号,具体可为如下I)-3)中任一种:
[0007]I)序列表中序列I所示的DNA分子；[0008] 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
[0009]3)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
[0010]上述严格条件可为在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。
[0011]序列表中序列I由2276个核苷酸组成。
[0012]含有所述DNA分子(启动子)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0013]在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为在PCAMBIA1391Z载体的多克隆位点插入所述DNA分子(启动子)得到的重组质粒；所述多克隆位点具体为BamH I和HindIII。
[0014]在本发明的另一个实施例中，所述重组载体具体为在载体A的多克隆位点插入所述DNA分子(启动子)得到的重组质粒；所述载体A为EcoR I不完全酶切pAHC25载体后得到的6800bp片段自连环化而成的载体；所述多克隆位点具体为BamH I和Hind III。
[0015]所述表达盒可以由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。
[0016]在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因(来源于所述PCAMBIA1391Z载体或所述载体A);所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于所述PCAMBIA1391Z载体或所述载体A)。
[0017]所述DNA分子(启动子)在启动目的基因在植物表达中的应用也属于本发明的保护范围。
[0018]在所述应用中，所述表达为胚乳特异性表达。
[0019]利用所述DNA分子(启动子)培育转基因植物的方法也属于本发明的保护范围。
[0020]本发明所提供的利用所述DNA分子(启动子)培育转基因植物的方法，具体可包括如下步骤:
[0021]a)将目的基因插入所述重组载体，使所述DNA分子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；
[0022]b)将步骤a)构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，得到在胚乳特异性表达所述目的基因的转基因植物。
[0023]将所述目的基因重组表达载体导入所述目的植物的方法可为农杆菌介导法、Ti质粒法、Ri质粒法、植物病毒载体法、直接DNA转化法、显微注射法、电导法等。在本发明的一个实施例中具体采用的为农杆菌介导法；在本发明的另一个实施例中具体采用的为基因枪转化法。
[0024]本发明的另一个目的是提供一种具有增强子功能的DNA分子。
[0025]本发明所提供的具有增强子功能的DNA分子,来源于小麦(Triticum aestivumL.)品种云麦33号,具体可为如下4)-6)中任一种:
[0026]4)序列表中序列4所示的DNA分子；
[0027]5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且具有增强子功能的DNA分子；[0028]6)与4)或5)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有增强子功能的DNA分子。
[0029]上述严格条件可为在6X SSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2X SSC，0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。
[0030]序列表中序列4由43个核苷酸组成。
[0031]含有所述DNA分子(增强子)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0032]所述DNA分子(增强子)在增强目的基因在植物表达中的应用也属于本发明的保护范围。
[0033]扩增所述DNA分子(所述启动子或所述增强子)全长或任一片段的引物也属于本发明的保护范围。
[0034]在以上各应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。
[0035]在本发明中，所述植物为单子叶植物，如小麦或水稻，具体如小麦(Triticumaestivum L.)品种小偃 54 或水稻(Oryza sativa L.)品种 Kitaake。
[0036]本发明提供的启动子可以驱动目的基因在植物的胚乳中特异性高表达。本发明为人们研究植物基 因在籽粒的表达、调控和利用基因工程方法改良作物提供了有用的核心元件；对于专一特异地改良和改造作物籽粒，从而培育新的作物品种具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为3种IBx基因启动子的PCR扩增。M:DNA分子量标准；1:1Βχ7启动子(Pro-lBx7) ；2:1Βχ7°Ε 启动子(Pro-lBx70E) ；3:1Βχ13 启动子(Pro_lBxl3)。
[0038]图2为3种IBx基因启动子的比较分析。3种IBx基因启动子的主要差异在于存在序列插入和缺失。插入序列以方框表示，具体的插入序列及其长度在图中相应位置展示。
[0039]图3为实施例2中载体A的质粒图谱以及载体A的酶切鉴定图。其中，A为载体A的质粒图谱；B为载体A的BamH I和Hind III双酶切图谱，M =DNA分子量标准，Pl-PlO:10个待鉴定质粒。
[0040]图4为实施例2中瞬时表达⑶S染色结果和定量结果。其中，A和B为瞬时转化后胚乳的⑶S染色结果(A对应1Βχ13启动子；B对应1Βχ7启动子);C为通过⑶S点数目比较3种IBx启动子强弱，其中川口㈨启动子显著高于另两种IBx启动子(星号表示统计分析有显著差异，P值小于0.01)。
[0041]图5为实施例3中转基因水稻中⑶S染色结果和基因表达定量结果。其中，A为4种不同启动子转基因水稻籽粒、茎和叶GUS染色结果；B为4种不同启动子转基因水稻花后不同时间的籽粒中GUS基因相对表达量。
【具体实施方式】
[0042]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044]小麦(Triticum aestivum L.)品种云麦33号:记载于“黄学源.抗锈高产小麦新品种一云麦33号.农业科技通讯，1985年07期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0045]小麦(Triticumaestivum L.)品种中国春:记载于‘?.R.Sears, Τ.Ε.Miller,邹裕春.“中国春”小麦历史.麦类作物学报，1989年02期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0046]小麦(Triticum aestivum L.)品种济麦20:记载于“王小燕，张永丽，于振文.水氮互作对济麦20籽粒蛋白质品质及氮素和水分利用效率的影响.麦类作物学报，2010年02期” 一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。 [0047]小麦(Triticumaestivum L.)品种 Atlas66:记载于“王洪政.小麦(Triticumaestivum L.)铝毒害以及钙对铝毒害的调控作用.南京农业大学，2006年，博士论文”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0048]小麦(Triticum aestivum L.)品种小偃54记载于“程建峰，马为民，陈根云等.小偃54和京411及其杂交后代稳定优选株系光合特性的动态变化.作物学报，2009年06期” 一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0049]水稻(Oryza sativa L.)品种Kitaake:记载于“向询朝，何立斌，孙建明等.玉米PEPC基因在籼型水稻保持系不同遗传背景下的效应及转PEPC基因后代的耐光氧化特性.中国水稻科学，2009年03期” 一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0050]pAHC25载体:记载于“霍楠.转基因小麦B73_6_l品系特异性检测技术研究.东北农业大学，2012年，硕士论文” 一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0051]pCAMBIA1391Z载体:可从商业途径购买，购自澳大利亚CAMBIA公司。记载于“王光达.小麦果聚糖合成酶基因启动子的克隆与功能分析.山西农业大学，2013年，硕士论文” 一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0052]农杆菌EHA105:记载于“高世武，郭晋隆，闕友雄.影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究.热带生物学报，2012年01期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0053]实施例1、启动子序列的克隆
[0054]一、小麦基因组DNA提取
[0055]供试小麦品种:云麦33号、中国春、济麦20和Atlas66。
[0056]将4个供试小麦品种的种子萌发7-10天后，取新鲜叶片液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取基因组DNA。
[0057]CTAB提取缓冲液:0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0),20mM EDTA(ρΗ8.0)，1.4Μ NaCl,2% (w/v)CTAB,2% (w/v)PVP40 和 3% (v/v) β-巯基乙醇(临用前加入)。
[0058]提取步骤:
[0059]1.取适量材料(5g)在液氮中充分研磨，磨好的粉末转入预冷的50ml离心管中，加入20ml CTAB提取缓冲液，迅速涡旋混匀，在65°C水浴中裂解45分钟；
[0060]2.加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)，充分颠倒混匀后，室温SOOOg离心20分钟，将上清转入新的离心管后，再用等体积的氯仿:异戊醇(24:l，v/v)重复抽提一次，将上清转入新的离心管；
[0061]3.加入1/10体积的醋酸钠(pH5.2)和2/3体积的异丙醇，颠倒混匀，直至出现絮状沉淀；[0062]4.将DNA挑出转入2ml离心管，4°C 8000g离心2分钟，小心弃去上清；
[0063]5.加入70%乙醇小心重悬洗涤，4°C 8000g离心2分钟，小心弃去上清；
[0064]6.重复步骤5 一次；
[0065]7.沉淀自然晾干，加入500 μ I TE溶液，待DNA完全溶解后再加入RNaseA溶液至终浓度20 μ g/ml，37°C温浴I小时；
[0066]8.用等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)抽提一次，除去其中的RNA酶；
[0067]9.按照步骤3沉淀DNA ；
[0068]10.重复步骤4和5，最后将干燥的DNA溶于ddH20中，测定浓度后保存于_70°C备用。
[0069]二、IBx基因启动子的获得
[0070]以步骤一获 得的4个小麦品种DNA为模板，使用引物IBx-PFl和ΙΒχ-PRl进行PCR扩增，引物序列如下:
[0071]IBx-PFl:5，-TGATGTGCCCTTGCTTGATTT-3，(序列 I 的第 1-21 位)；
[0072]IBx-PRl:5’ -CTCAGTGAACTGTCAGTGAATTG-3’ (序列 I 的第 2254_2276 位的反向互补序列)。
[0073]反应体系:2X Easypfu PCR Supermix7.5 μ I ； ΙΒχ-PFl (10μΜ)1μ I ；IBx-PRl(IOyM)Iy I ;模板适量；ddH20 补足至 15 μ I。其中，2 XEasypfu PCR Supermix 为北京全式金生物技术有限公司产品，其产品目录号为AS211-01。
[0074]反应程序:94°C5min ；94°C 30sec, 58°C 30sec, 72V 2min, 33 个循环；72°C IOmin0
[0075]反应结束后，PCR扩增产物在I %琼脂糖胶上120伏恒压电泳30min后，获得扩增片段长度约为2.3kb的条带(见图1)，用刀片切下目的条带，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收DNA。回收的DNA与pEASY-Blunt载体(北京全式金生物技术有限公司)进行平端连接，连接产物热击法转化大肠杆菌Trans-Tl感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)。挑取大肠杆菌单克隆后测序(上海生工生物工程股份有限公司)，获得IBx基因全长启动子序列。
[0076]经过测序共发现4种全长IBx启动子序列,对应于小麦(Triticum aestivum L.)品种云麦33号的PCR产物的序列为序列表中序列1，将其命名为Pro-lBx7°E ;对应于小麦(Triticum aestivum L.)品种中国春的PCR产物的序列为序列表中序列2，将其命名为Pro-lBx7 ;对应于小麦(Triticum aestivum L.)品种济麦20和Atlas66的PCR产物的序列为序列表中序列3，将其命名为Pro-lBxl3。
[0077]三、IBx基因启动子比较分析
[0078]比较4种启动子序列，除了一些单碱基互换或小片段DNA的缺失，主要差异是存在大片段的缺失和插入。以Pro_lBx7启动子序列(序列2)为对照，与之相比，Pro-lBxl3启动子序列(序列3)在起始密码子上游_400bp处存在一个54bp片段缺失(54bp重复区域)，Pro-lBx7°E启动子序列(序列I)在起始密码子上游_1047bp存在一个43bp片段插入(见图2)。
[0079]实施例2、瞬时表达实验检测启动子活性
[0080]一、瞬时表达载体的构建
[0081]将pAHC25载体用EcoR I不完全酶切，从产物中选择6800bp的片段回收，回收片断加入DNA连接酶进行自连接，连接体系:T4DNA连接酶1μ I ;2 X T4DNA连接酶缓冲液
2.5μ I;回收片断^800bp)l.5μ I。连接后转化即改造成可用的载体，记为载体Α，载体A上携带有GUS基因，其质粒图谱如图3中A所示。
[0082]用BamH I和Hind III完全酶切该载体A，从载体图上明显可以看出，酶切后的片段大小应该为2000bp和4800bp，而酶切电泳结果显示两个片段的大小正好与之吻合(图3中B)，说明该载体A构建成功。
[0083]分别以实施例1获得Pro-lBx7°E启动子序列(序列I)、Pro_lBx7启动子序列(序列2)和Pro-lBxl3启动子序列(序列3)为模板，通过引物lBx_PF2和lBx_PR2进行PCR扩增。
[0084]1BX-PF2: 5，-TACAAGCTTTGATGTGCCCTTGCTTGATTT-3 ’(下划线部分为酶切位点Hind III的识别序列，其前的序列为保护碱基，其后的序列为序列I的第1-21位)；
[0085]lBx-PR2:5’ ~TCGGGATCCCTCAGTGAACTGTCAGTGAATTG~3?(下划线部分为酶切位点BamH I的识别序列，其前的序列为保护碱基，其后的序列为序列I的第2254-2276位的反向互补序列)。
[0086]反应体系和反应程序参照实施例1步骤二进行。
[0087]反应结束后，用BamH I和Hind III双酶切各PCR产物，胶回收后与经过同样双酶切的以上构建得到的载体A的骨架大片段(约4800bp的片段)相连，得到重组质粒。连接体系:T4DNA连接酶1 μ I ;2XT4DNA连接酶缓冲液2.5μ I ;载体A骨架片段1μ I ;酶切后PCR 产物 0.5 μ I。
[0088]对连接所得重组质粒进行测序，将经测序表明将载体A的BamH I和Hind III之间的小片段(约2000bp的片段)替换为序列I所示的Pro-lBx7°E启动子序列的重组质粒命名为Pro-lBx70E::GUS ;将经测序表明将载体A的BamH I和Hind III之间的小片段(约2000bp的片段)替换为序列2所示的Pro-lBx7启动子序列的重组质粒命名为Pro-lBx7::⑶S ;将经测序表明将载体A的BamH I和Hind III之间的小片段(约2000bp的片段)替换为序列3所示的Pro-lBxl3启动子序列的重组质粒命名为Pro_lBxl3::⑶S。
[0089]在重组表达载体Pro_lBx7°E::⑶S中，Pro_lBx7°E启动子序列(序列I)位于⑶S基因上游，启动GUS基因的转录，而在GUS基因下游连接有用于终止其转录的NOS转录终止子。
[0090]通过高纯度质粒小提中量试剂盒(北京天根生化科技有限公司)分别提取以上获得的3种重组表达载体，确保浓度在0.5 μ g/μ I以上。提取好的质粒用于后续的基因枪瞬时转化实验。
[0091]二、小麦胚乳的瞬时转化及转化效果检测
[0092]1、小麦胚乳的准备
[0093]将授粉后14天的小麦(Triticum aestivum L.)品种小偃54的种子用酒精浸泡lmin，倒掉酒精，用浓度为5% (体积分数)的次氯酸钠的水溶液浸泡lOmin，倒掉次氯酸钠，用灭菌过的ddH20洗三次。去胚、拨去外表皮仅留下白色的胚乳，把胚乳放在MS固体培养基(配方如表1所示)的中央，30粒胚乳/皿，准备轰击。
[0094]表1MS固体培养基配方
【权利要求】
1.DNA分子,为如下1)-3)中任一种: 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子； 3)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因在植物表达中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述表达为胚乳特异性表达。
5.利用权利要求1所述的DNA分子培育转基因植物的方法，包括如下步骤: a)将目的基因插入权利要求2所述重组载体，使权利要求1所述的DNA分子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体； b)将步骤a)构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，得到在胚乳特异性表达所述目的基因的转基因植物。
6.DNA分子,为如下4) -6)中任一种: 4)序列表中序列4所示的DNA分子； 5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且具有增强子功能的DNA分子； 6)与4)或5)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有增强子功能的DNA分子。
7.含有权利要求6所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
8.权利要求6所述DNA分子在增强目的基因在植物表达中的应用。
9.扩增权利要求1或权利要求6所述DNA分子全长或任一片段的引物。
10.根据权利要求3或4所述的应用，或权利要求5所述的方法，或权利要求8所述的应用，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
【文档编号】A01H5/00GK103937799SQ201410181361
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】庞斌双, 耿玉珂, 李甜, 郝晨阳, 张学勇 申请人:中国农业科学院作物科学研究所