用于运输和保存离体生物样品的装置及其相应的方法与流程

本发明涉及用于运输和保存离体生物样品的装置和用于保存生物样品的相应方法，所述装置包括用于容纳所述生物样品的腔室和用于保持腔室内温度低于装置外温度的冷却装置，所述腔室由绝热材料制成的壁界定。

本发明还涉及根据本发明的装置用于运输和保存离体生物样品，并随后在活的人或动物中移植或用于随后实验室研究的用途。

背景技术：

在本发明中，“离体生物样品”的概念涉及可以被运输用于随后在活的人或动物中进行移植或用于随后实验室研究的器官或组织。

例如，在移植领域，已知缺血/再灌注(i/r)综合征是原发性移植物功能障碍(pgd)和原发性移植物衰竭(pgf)的主要原因之一，在后一种情况中需要再一次的移植。尽管在过去几十年在外科技术上取得进展，供体器官在运输直到植入接受者期间(冷缺血时间)，移植物经受的损伤仍然是尚待解决的主要社会和临床相关问题。在移植的器官中，pgf的发生率为5-10％，pgd的发生率为20-30％。这一切都不利地导致患者的生活质量差、再次移植的需要以及移植器官的可用性方面的更多问题。

从供体取出到植入接受者的时间内，有不同的方法存储移植物。在动态正常体温保存的情况下，在整个保持期间尽可能最大程度模拟移植物的体内环境。为此，避免了体温过低，并且提供氧气进入移植物以防止缺氧的入口，和用于废物出口的储存器。

在静态正常体温保存中(这是常规的保存方法)，在供体移植物植入接受者之前，供体的一种或多种器官和组织受到固有缺血时间的影响。这种情况下，用于保存器官和组织的方法必须满足以下要求：从移植物中去除血液并通过在4℃下用溶液灌注移植物的方式快速冷却移植物，用冰覆盖移植物以确保冷条件(2-6℃)和缺血条件。因此，在冷缺血期间，即由于在冷条件下缺乏供血和氧气输送而导致的移植物经受的损伤降低。

从器官从供体中取出时，将移植物置于冷却器中，浸入保存溶液中，通常保持在4℃，直到植入接受者。现有技术中最广泛使用的溶液是威斯康星大学的溶液，以下称uw溶液。

在冷却器运输期间直到植入接受者(冷缺血时间，通常不会少于6小时)，移植物经受的损伤是关键因素。该因素是造成pgd和pgf的原因，并对术后结果、患者的生活质量和生存产生负面影响。已知器官在冷却器中的时间越长，将被移植的移植物的活力越低。移植物的冷缺血阶段经受的损失是大量器官(35％)鉴于其病理状况被认为不适合移植的主要原因(来自老年人的肾移植物、糖尿病和/或高血压供体、脂肪肝移植物等)。这些器官在被植入接受者之前非常容易经受运输期间的损伤，并且具有较高的经历pgd和pgf的风险。因此，它们不适于移植。这些观察结果表明，需要找到替代方案来减少移植物在植入接受者之前在冷缺血期间经受的损伤。

在保存溶液中存在的大多数成分的目的是为了在植入接受者之前，在运输期间的冷却器中的冷缺血条件下保护移植物，而并不进入移植物，如果进入移植物，它们不会以最佳浓度达到作用位点以保护移植物。实际上，已经发现，当从这种保存溶液中去除一些成分时，术后和移植后结果与没有去除它们时一样。

专利文件wo2007/143715a2涉及应用超声波以允许向伤口递送氧气并帮助伤口愈合。例如，该专利文件非常简要地公开了在从供体取出器官后保存器官的装置。为此，将器官置于供应有氧气过饱和的气体或液体的容器中。这是动态保存系统，因为其中包含的氧气或用氧气饱和的液体溶液以受控的流动从氧气储存器逐渐进入容器，并且逐渐去除废物。将器官容器置于半刚性容器内。外部的容器进一步在容器上包含用于引导超声波的超声波系统。在内部容器和外部容器之间没有传递超声波的装置，因此该系统不能像为伤口愈合的目的而在伤口上直接应用超声波这样有效。

还已知表明应用超声波有助于通过组织例如皮肤将药物和物质递送至血液的研究。然而，在所述研究中，超声波是在体内应用的，即在血液存在下。专利文件4,767,402a涉及通过应用超声波的方式进行透皮药物递送的领域，也涉及与该用途有关的风险。该专利文件特别建议由于与皮肤温度升高相关的风险以及该技术可能引起的损害而不要长期使用超声波。同一专利文件还公开了超声波通过空气传播差，因此其优选的应用需要液体介质。因此，由于以下提及的因素，不建议对器官和组织保存应用超声波：组织的局部加热、难以渗透相当的组织或器官厚度，以及在气体介质中的传播困难。

专利文件us5,267,985a公开了通过以两个或更多不同频率的超声波的方式促进物质扩散至材料或组织的局部区域的方法和仪器。该专利文件还公开了当应用超声波时，局部温度升高对于帮助增加待扩散物质的渗透是有利的。

文章(senwang等，medialhypothesis，74，2010；147-149)建议在体内以中等强度(0.3-1.2w/cm²)应用超声波以破坏供体器官的特定区域，使得仅有干细胞被激活且器官可以再生，形成可以与接受者更加相容的杂合器官。

专利文件wo2005/013799a1公开了在缺血时间之后，基于再灌注期间在体内应用超声波，即血液供应进入组织的方法。仅在短时间间隔内(不超过15分钟)应用超声波以有利于血液和氧气进入组织，并减少由再灌注引起的微循环障碍。

因此，从现有技术可以推断，在水性介质和组织中应用超声波产生热。单独地以本领域常规的频率和强度应用超声波仅1-10分钟(大多数医疗应用中使用的时间)导致组织的加热，这被解释为适当储存离体生物样品的不利因素。当温度超过38℃，通常会中断超声波暴露，因为它会损伤组织。例如，专利文件us5,267,985公开了使用超声波15-30分钟以实现1-2cm的组织渗透的可能性。

实际上，在临床实践中经常准确地应用超声波作为治疗以引起组织加热。除了仅由超声波引起的加热之外，陶瓷换能器倾向于随着振动而变热，甚至进一步增加对组织的热效应(watsont等，2008，48：321-329；bakerkg等，2001；81：1351-1358；legay等；2011，id670108；1-17)。

发明简述

本发明的目的是提供用于运输和保存离体生物样品的装置和上述类型的方法，其与可以用已知装置获得的相比，降低对生物样品的损伤，因而增加其活力。在移植物的情况下，本发明还考虑提高移植患者的生活质量的问题，最坏情况下显著降低再次移植的需要。

该目的通过上述类型的用于离体运输的装置来实现，其特征在于，它进一步包括至少一个适于对所述生物样品产生并应用超声波的超声波系统。因此，可以进行应用超声波结合内部腔室的冷却，从而防止生物样品的局部加热以及可能造成损伤的随后的温度升高。特别地，装置还包括含有保存溶液的辅助容器，其没有外部的氧气递送且用于容纳浸渍在所述保存溶液中的所述生物样品。

因此，与预期的不同，本发明已经证实应用超声波(应用超声波使得不在样品中产生局部加热)不会对冷却生物样品的积极效果产生不利影响，因此也不会损伤样品。此外，然而，出乎意料地证实用超声波取得了非常显著的改进，如将在以下描述中可见，可以证实在装置的腔室内应用冷环境和应用超声波之间的协同作用。为此，有很多可能的构型，例如以低强度在靠近生物样品处应用超声波，或将换能器以较高强度置于远离样品并与包含样品的保存溶液接触。

此外，还与预期的不同，本发明没有发现应用超声波的持续时间的问题。换言之，已知在器官运输中需要将样品保持在冷缺血条件下几个小时。根据本发明，可以合适的强度持续应用超声波，除了可以预期的之外，它也不会损伤生物样品。

因此，通过应用超声波和防止样本的局部加热，已经证实细胞损伤的显著降低。此外，基于进行的试验，已经证实通过同时应用两种处理对器官不受冷缺血诱导的损伤的保护出乎意料地比通过单独的处理获得的所有保护的总和更好。

此外，本发明还涵盖作为从属权利要求主题的一系列优选特征，其用途将在本发明的实施方案的详细描述中突出。

优选所述辅助容器是可关闭的。

在一个优选的实施方案中，已经证实所述超声波系统适用于发射频率为25khz-1mhz、声音强度为0.01-2w/cm²，优选为0.02-1w/cm²，尤其优选为0.02-0.1w/cm²的超声波。已经证实这些频率和强度对于降低细胞损伤尤其有利。尤其以较低的强度可以获得更好的结果，相对于生物样品所需要的样品冷却和/或换能器的隔离更少，允许装置更紧凑。

还可以优选的考虑，以连续方式或以脉冲方式应用超声波。此外，本发明不排除通过相应的单独控制装置的各个换能器同时应用不同频率的超声波。

还已经证实，温度越低，超声波获得的协同作用越好。因此，在一个特别优选的方式中，冷却装置适于将所述腔室内的温度保持为0-15℃，优选2-10℃，尤其优选2-6℃。如此证实，冷条件和超声波组合在一起的结果比单独的冷条件和超声波在最好情况下可以预期的效果总和更好。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的装置在所述腔室内包含适于支持生物样品的片状支持物，当应用所述超声波时，所述片状支持物能够自由振动，超声波系统包括至少一个安装在所述片状支持物的至少一个壁上的换能器。因此，支持物的阻尼效应被最小化，并且超声波以更有效的方式被引入生物样品，提高其在较大生物样品中的效果，条件是防止了生物样品中过量的局部加热。

在一个特别优选的实施方案中，所述至少一个换能器安装在与所述生物样品的支持表面相对的所述片状支持物的表面上，以将所述超声波应用到所述支持表面。从而获得更均匀的超声场，甚至进一步有利于冷条件和超声波对生物样品的组合效果。片状支持物为托盘可能是合适的，并且这种托盘允许容纳诸如水的流体以改善所应用的超声波的传播。流体的功能一方面用作冷却剂，同时有利于将超声波传输到生物样品。

在一个特别优选的实施方案中，所述片状支持物由金属制成以增加其刚性并最大程度防止阻尼，并且实现生物样品上超声波更直接的传递。

在一个特别优选的实施方案中，装置包括容纳保存溶液的可关闭辅助容器。再一次，已经证实在降低对生物样品的损伤方面，冷条件和超声波的组合加上将生物样品浸渍在保存溶液中提供的结果比它们单独的效果的总和更好。

在根据本发明的装置的一个实施方案中，片状支持物是适于容纳流体的托盘。

在另一个优选的实施方案中，片状支持物是容纳水的托盘。

在另一个实施方案中，辅助容器包括远离所述辅助容器的底部的假底部，并且所述假底部与所述辅助容器的其余部分流体连通。

还在一个特别优选的方式中，辅助容器可以包括用于保持生物样品远离容器的支持表面的假底部，所述假底部与所述辅助容器的其余部分流体连通。因此，样品可以放置在辅助容器中，就好像它悬浮在保存溶液中一样。因此，样品不会受到超声波的这种直接作用并且可在较高强度下工作。

此外，本发明还考虑用于运输和保存离体可移植生物样品的方法，其特征在于，它包括以下步骤：从生物样品中去除并洗出血液，将生物样品置于由绝热材料制成的壁界定的腔室中而不需要外部氧气递送，并用超声波照射样品。更具体地，在根据本发明的方法中，通过将所述生物样品置于由绝热材料制成的壁界定的腔室中使生物样品保持浸渍在保存溶液中而不需要外部氧气递送。

优选地，所述生物样品浸渍在辅助容器中，所述辅助容器优选可关闭，包含所述保存溶液，并且所述辅助容器置于所述腔室中。

在方法的一个实施方案中，在照射所述生物样品的照射步骤中，超声波的频率为25khz-1mhz，声波强度为0.01-2w/cm²，优选为0.02-1w/cm²，尤其优选为0.02-0.1w/cm²。

在另一个实施方案中，方法包括用于将腔室中的温度冷却至0-15℃，优选2-10℃，尤其优选2-6℃的温度的冷却步骤。

在另一个实施方案中，方法进一步包括保持所述生物样品浸渍在保存溶液中的步骤。

最后，方法进一步包括将所述辅助容器置于片状支持物上的步骤，所述支持物是适于容纳流体的托盘，且当应用所述超声波时，所述托盘能够自由振动。

本发明还涉及用于运输和保存离体生物样品的装置的用途。使用该装置，生物样品保持浸渍在保存溶液中而在低温条件下不需要氧气递送，并且用超声波照射所述样品，使得对于待用于随后的实验室研究的生物样品，保存所述生物样品的不同细胞之间的活力、功能性和相互作用。

此外，本发明还涵盖在本发明实施方案的详细描述和附图中阐明的其他细节特征。

附图说明

本发明的其它优点和特征将从没有任何限制特征的以下描述中变得显而易见，参照附图公开了本发明的优选实施例。

图1显示了用于运输离体生物样品的装置的第一个实施方案的分解透视图。

图2显示了图4装置的纵剖面正视图。

图3显示了图1装置的生物样品的支持托盘的第一个实施方案的顶视图。

图4显示了图3托盘的侧视图。

图5显示了用于生物样品的支持托盘的第二个实施方案。

图6显示了根据本发明用于运输的装置的第二个实施方案。

图7a显示了根据本发明用于运输的装置的第三个实施方案。

图7b显示了图7a装置的辅助容器的替代实施方案。

图8a-13显示了相对于现有技术的条件，肝脏和肾脏生物样品的保护百分比。

发明详述

图1和2显示根据本发明的用于运输和保存离体可移植生物样品100的装置1的第一个实施方案。在一个特别优选的方式中，根据本发明的装置是便携式冷却器。

如之前所述，生物样品100包括器官和组织两者，所述器官可以在供体和接受者(可以是人或动物)之间移植。此外，生物样品也可以意欲用于研究而不需要移植。

根据本发明的用于运输和保存的装置1具有在上表面开口的平行六面体形主等温容器16。主容器16的由绝热材料制成的壁4(包括其上盖)界定了用于容纳生物样品100的腔室2。

在主容器16内提供冷却装置6，用于将腔室2内的温度保持低于所述装置1外的温度。这些冷却装置6可以包括不同的溶液、冰块、冷却凝胶包或包括压缩机和热交换器的复合溶液。装置1也可以由带或不带外部电源的可运输冷却器组成。然而，期望溶液尽可能轻，从而不影响组装物的可运输性。冷却装置6允许将腔室2内的温度保持在0-15℃。在另一个优选的实施方案中，腔室2内的温度保持为2-10℃，尤其优选2-6℃。

装置1通过支持在腔室2内的金属托盘在中央部分包括片状支持物10，使得其可以自由振动。该第一实施方案的托盘的细节如图3和4所示。在该实施方案中使用小于1mm，优选0.5mm厚的铝盘。

此外，装置包括适用于对生物样品100产生并应用超声波的超声波系统。为此，根据附图的超声波系统具有电信号发生器20、放大器22、电池24、和在这种情况下的四个压电换能器8。

通过四个换能器8，通过铝盘向片状支持物10施加振动。所述换能器8安装在托盘的下表面。这个结构的结果是，换能器和生物样品100之间的传输更直接，因为振动直接在生物样品下部的下面产生。在一个特别优选的方式中，如图6所示，托盘可以额外地包含水，但为了改进超声波的传输，考虑生物样品100容纳于填充了保存溶液的袋子或容器中。本文提及的保存溶液例如是lactatedringer溶液、celsior溶液或威斯康星大学溶液。

在图5所示的替代实施方案中，托盘可以在侧壁上具有换能器8，以产生侧向的振动场。或者换能器8也可以位于托盘的侧壁和底部。

在所述生物样品100的运输期间，超声波换能器8将机械波传输至所述腔室2，所述机械波的频率为25khz-1mhz，声音强度为0.01-2w/cm²。强度优选为0.02-1w/cm²，仍然更优选为0.02-0.1w/cm²。使用的声音强度越高，换能器8将会越远和/或置于装置1中的保存溶液流体或冷却剂的量越大，以满足防止生物样品100的局部加热的目的。此外，根据本发明，可以连续应用超声波。或者，也可以间歇地应用超声波，即，它不在运输持续的整个时间内应用。或者，它也可以持续或间歇地以脉冲方式和/或以不同频率应用。

在一个特别优选的实施方案中，生物样品容纳于含有保存溶液的贮藏器中，其改善应用超声波的结果。

以下示出在前述段落中描述的具有很多相同特征的根据本发明的用于运输的装置1的其他实施方案。因此，以下将仅描述这些实施方案中不同的要素，对于共同的要素，参考第一个实施方案的描述。

图6的装置1的实施方案的区别主要在于，片状支持物10直接整合在主容器16的壁4上。

最后，在图7a的装置的实施方案中，在主容器16内提供具有保存溶液的辅助容器14。在一个特别优选的方式中，辅助容器14可关闭，具有刚性壁和铰接在其壁之一上的盖。在一个特别优选的方式中，当换能器位于托盘的下部时，辅助容器14的尺寸意欲占据换能器8的整个发射表面。辅助容器14填充保存溶液的结果是，超声波以更有效的方式到达生物样品100。在一个特别优选的实施方案中，辅助容器14通过使用可成形塑料(例如高密度聚乙烯，聚丙烯，聚对苯二甲酸乙二醇酯等)进行热成形来制造。还在一个特别优选的方式中，材料是透明的以使能够看见生物样品100而不需要打开辅助容器14。

图7a显示辅助容器14的替代实施方案。在这种情况下，辅助容器14包括远离所述辅助容器14底部的假底部18，并且所述假底部18与所述辅助容器14的其余部分流体连通。因此，假底部使生物样品100远离辅助容器14的支持表面放置。这种情况下，假底部18由支持在辅助容器14的侧壁上的刚性塑料片组成。然后，为了实现适当的流体连通，这种情况下提供允许保存溶液通过的多个开口20，使得所述溶液接受来自下部换能器8的超声波的直接作用。

最后，在一个特别优选的实施方式中，辅助容器14包含在无菌条件下的保存溶液，所述保存溶液选自lactatedringer保存溶液、celsior保存溶液或威斯康星大学保存溶液。这允许在用于其适当保存的更合适的条件下卫生得多地处理生物样品。

目前描述的实施方案代表非限制性的实施例，本领域技术人员将理解，在示出的实施例之外，要求保护的特征的大量组合也可能在本发明的范围内。

具体实施方式

以下对根据本发明的方法进行的不同试验进行说明。

方法

实验方案在兰德斯猪的肝脏和肾脏上进行。于4℃用保存溶液灌注肾脏和肝脏以去除器官中含有的血液，将器官保持在冷条件下，冰浴，直至将器官浸渍在不同保存溶液中。然后，将生物样品置于冷却器中，并在有或没有超声波下将冷却器放置8小时(肝脏)和24小时(肾脏)。所有程序均在麻醉下进行，研究依据欧盟有关使用动物实验的规定(86/609/eec指令)。

实验设计

方案1

形成的实验组如下：

第1组：在具有保存溶液的常规运输系统中的冷缺血组。该组根据所用的保存溶液分为不同的亚组。

1.1)于4℃下用lactatedringer溶液灌注肝脏移植物(n＝10)和肾脏移植物(n＝10)，并于2-6℃下将这些器官用lactatedringer溶液分别保存在常规运输系统中8小时(肝脏)和24小时(肾脏)；

1.2)与1.1相同，但使用celsior溶液洗涤和保存器官；

1.3)与1.1相同，但使用uw(威斯康星大学)溶液洗涤和保存器官。

第2组：在具有超声波(25khz，0.04w/cm²)且不含保存溶液的系统中的冷缺血组：于4℃下用lactatedringer溶液灌注肝脏移植物(n＝10)和肾脏移植物(n＝10)来洗涤器官以除去其中含有的血液。洗涤后，于2-6℃下分别将器官储存在具有超声波(25khz，0.04w/cm²)且不含保存溶液的系统中8小时(肝脏)和24小时(肾脏)。

第3组：在具有超声波(25khz，0.04w/cm²)且含有保存溶液的系统中的冷缺血组。该组根据所用的保存溶液分为不同的亚组。

3.1)于4℃下用lactatedringer溶液灌注肝脏移植物(n＝10)和肾脏移植物(n＝10)，并于2-6℃的温度下将这些器官用lactatedringer溶液分别储存在具有超声波的运输系统中8小时(肝脏)和24小时(肾脏)；

3.2)与3.1相同，但使用celsior溶液洗涤和保存器官；

3.3)与3.1相同，但使用uw溶液洗涤和保存器官。

还进行实验以评估其他频率和/或强度是否能提供比25khz的频率和0.04w/cm²的强度实现的保护更多的保护。为此，进行以下实验。

第4组：在具有超声波(40、80、200、580khz和1mhz)和强度为0.04w/cm²且含有保存溶液的系统中的冷缺血组。该组根据所用的频率分为不同的亚组。

4.1)于4℃下用uw溶液灌注肝脏移植物(n＝10)和肾脏移植物(n＝10)，并于2-6℃的温度下将器官用uw溶液分别储存在具有40khz且强度为0.04w/cm²的超声波的运输系统中8小时(肝脏)和24小时(肾脏)；

4.2)与4.1相同，但使用80khz，强度为0.04w/cm²，2-6℃；

4.3)与4.1相同，但使用200khz，强度为0.04w/cm²，2-6℃；

4.4)与4.1相同，但使用580khz，强度为0.04w/cm²，2-6℃；

4.5)与4.1相同，但使用1mhz，强度为0.04w/cm²，2-6℃。

还进行实验以验证强度大于0.04的超声波的效果。为此目的进行以下实验。

第5组：在具有超声波(25khz，强度为0.1w/cm²且含有保存溶液)的系统中的冷缺血组。于4℃下用uw溶液灌注肝脏移植物(n＝10)和肾脏移植物(n＝10)，并于2-6℃的温度下将器官分别储存在具有25khz且强度为0.1w/cm²的超声波的运输系统中8小时(肝脏)和24小时(肾脏)。

进一步增加以下实验以评估保存溶液和冷条件的作用。

第6组：在不含保存溶液的常规运输系统中的冷缺血组。于4℃下用lactatedringer溶液灌注肝脏移植物(n＝10)和肾脏移植物(n＝10)来洗涤器官以去除其中含有的血液。洗涤后，于2-6℃下分别将器官储存在不含保存溶液的常规冷却器(不含超声波)中8小时(肝脏)和24小时(肾脏)。

第7组：非冷条件缺血组和超声波(25khz，强度为0.04w/cm²)组合或不与超声波组合。该组分为两个亚组。

7.1)于20-25℃的温度下用uw溶液灌注肝脏移植物(n＝10)和肾脏移植物(n＝10)。然后在20-25℃的温度下分别将器官储存8小时(肝脏)和24小时(肾脏)；

7.2)于20-25℃的温度下用uw溶液灌注肝脏移植物(n＝10)和肾脏移植物(n＝10)。然后在20-25℃的温度和25khz且强度为0.04w/cm²的超声波下分别将器官储存8小时(肝脏)和24小时(肾脏)。

收集和处理样品

在缺血结束时，收集所有实验组和亚组中的肝脏和肾脏灌注液样品以用广泛标准化的技术分析由缺血诱导的肝脏和肾脏损伤。通过测定灌注液中的转氨酶水平和通过测定肝组织中的半胱天冬酶3活性来评估肝脏损伤。通过测定灌注液中的乳酸脱氢酶和肾组织的半胱天冬酶3活性来评估肾脏损伤。在肝脏和肾脏组织样品中测定mda(丙二醛)水平作为氧化应激指数，并测定atp(三磷酸腺苷)水平作为器官能量代谢保存指数(salahudeenak等，amjtranspl2003；3：273-280；omarr等，gut1989；30：510-514；peralta等，amjphysiol.2000；279：g163-71)。

通过方差分析(anova)进行统计学研究，然后用student-newman-kels检验测定统计学显著性水平。

下面详细解释获得的并在附图中示意性地示出的结果。

图8a-8e：示出了当在8小时的冷缺血结束时评估指示肝脏损伤的参数(即ast(天冬氨酸氨基转移酶)、alt(丙氨酸氨基转移酶)、半胱天冬酶3活性、mda(丙二醛)和atp(三磷酸腺苷))时，相对于由以下条件诱导的损伤：uw溶液+冷条件(2-6℃)，在下述条件1-6下由肝脏移植物组成的生物样品中的保护百分比，或者换言之，肝脏损伤减少的百分比。

条件(1-6)：

1：uw溶液，超声波频率为25khz和冷条件(2-6℃)；

2：uw溶液，超声波频率为40khz和冷条件(2-6℃)；

3：uw溶液，超声波频率为80khz和冷条件(2-6℃)；

4：uw溶液，超声波频率为200khz和冷条件(2-6℃)；

5：uw溶液，超声波频率为580khz和冷条件(2-6℃)；

6：uw溶液，超声波频率为1mhz和冷条件(2-6℃)。

在所有情况1-6中，施加的超声波强度为0.04w/cm²。

图9a-9d：示出了当在24小时的冷缺血结束时评估指示肾脏损伤的参数(ldh(乳酸脱氢酶)、半胱天冬酶3活性、mda和atp)时，相对于由以下条件诱导的损伤：uw溶液+冷条件(2-6℃)，在下述条件1-6下由肾脏移植物组成的生物样品中的保护百分比。

1：uw溶液，超声波频率为25khz和冷条件(2-6℃)；

2：uw溶液，超声波频率为40khz和冷条件(2-6℃)；

3：uw溶液，超声波频率为80khz和冷条件(2-6℃)；

4：uw溶液，超声波频率为200khz和冷条件(2-6℃)；

5：uw溶液，超声波频率为580khz和冷条件(2-6℃)；

6：uw溶液，超声波频率为1mhz和冷条件(2-6℃)。

在所有情况1-6中，施加的超声波强度为0.04w/cm²。

图10：示出了当在8小时的冷缺血结束时评估指示肝脏损伤的参数ast时，相对于由以下条件诱导的损伤：不使用保存溶液+冷条件(2-6℃)+没有超声波，肝脏中的保护百分比。

1：lactatedringer溶液，没有超声波和具有冷条件(2-6℃)；

2：celsior溶液，没有超声波和具有冷条件(2-6℃)；

3：uw溶液，没有超声波和具有冷条件(2-6℃)；

4：lactatedringer溶液，有超声波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷条件(2-6℃)；

5：celsior溶液，有超声波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷条件(2-6℃)；

6：uw溶液，有超声波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷条件(2-6℃)。

注意：在所用的保存溶液中，临床实践中的标准溶液是uw(威斯康星大学)保存溶液。lactatedringer溶液不含药物，仅包含矿物盐。celsior溶液含有谷胱甘肽，且uw溶液含有更多的药物，如腺苷、谷胱甘肽和别嘌呤醇。

图11：示出了当在24小时的冷缺血结束时评估指示肾脏损伤的参数ldh时，相对于由以下条件诱导的损伤：不使用保存溶液+冷条件(2-6℃)+没有超声波，肾脏中的保护百分比。

1：lactatedringer溶液，没有超声波和具有冷条件(2-6℃)；

2：celsior溶液，没有超声波和具有冷条件(2-6℃)；

3：uw溶液，没有超声波和具有冷条件(2-6℃)；

4：lactatedringer溶液，有超声波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷条件(2-6℃)；

5：celsior溶液，有超声波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷条件(2-6℃)；

6：uw溶液，有超声波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷条件(2-6℃)。

图12：示出了当在8小时的冷缺血结束时评估指示肝脏损伤的参数ast时，相对于由以下条件诱导的损伤：uw保存溶液+没有冷条件(20-25℃)+没有超声波，肝脏中的保护百分比。

1：uw溶液，没有超声波和具有冷条件(2-6℃)；

2：uw溶液，有超声波和没有冷条件(20-25℃)；

3：没有保存溶液，有超声波和具有冷条件(2-6℃)；

4：uw溶液，有超声波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷条件(2-6℃)。预期结果：保护1+保护2＝保护(1+2)。

5：uw溶液，有超声波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷条件(2-6℃)。实际观察到的结果：保护1+保护2＜保护(1+2)。

图13：示出了当在24小时的冷缺血结束时评估指示肾脏损伤的参数ldh，相对于由以下条件诱导的损伤：uw保存溶液+没有冷条件(20-25℃)+没有超声波，肾脏中的保护百分比。

1：uw溶液，没有超声波和具有冷条件(2-6℃)；

2：uw溶液，有超声波和没有冷条件(20-25℃)；

3：没有保存溶液，有超声波和具有冷条件(2-6℃)；

4：uw溶液，有超声波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷条件(2-6℃)。预期结果：保护1+保护2＝保护(1+2)。

5：uw溶液，有超声波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷条件(2-6℃)。实际观察到的结果：保护1+保护2＜保护(1+2)。

实验结果的讨论

重要的是要指出，如预期的那样，不使用超声波，在冷却器内，保存流体和器官中温度范围为2-6℃。此外，在冷条件(2-6℃)下应用超声波没有改变冷却器内的温度(所有实验中为2-6℃)；但失去了器官和保存溶液冷却。

当应用超声波时，冷却器内的温度为2-6℃，保存溶液的温度为14-16℃，器官的温度为16-18℃。

根据感兴趣的文件的背景，由超声波引起的加热作用是预期的结果。然而，与预期的相反，考虑到冷却器官(4℃)和将保存液和器官的温度保持在2-6℃之间以在低温缺血条件下储存器官的至关重要性，结果表明应用超声波不会对生物样品的冷却效果产生不利影响，因此不会损伤它。

然而，此外，出乎意料地，已经证实取得非常显著的改进，使得可以确定在装置的腔室内应用冷条件和应用超声波之间的协同效应。

图8a-8e：如这些附图中所示，在所有情况下(在不同的频率和相同的0.04w/cm²强度)，应用超声波在冷缺血条件下保护肝脏移植物，所述保护作用在条件1(即，频率为25khz)下更明显。图中没有示出的其他结果表明，在高强度下(如0.1w/cm²情况下)，也获得对肝脏移植物的保护。例如，当在8小时的冷缺血结束时评估指示肝脏损伤的参数ast时，相对于由以下条件诱导的损伤：uw溶液+冷条件(2-6℃)，在频率25khz和强度0.1w/cm²下获得的保护百分比或损伤减少55％。

图9a-9d：示出了与图8a-8e的肝脏所示的相同模式的肾脏保护。

图10：如预期的，观察到在没有应用超声波的情况下保存溶液提供对肝脏的保护(条件1-3)；相对于两种溶液(ringer或celsior)，如果用uw保存溶液，对肝脏移植物的保护更好，且celsior溶液获得的保护比lactatedringer溶液获得的更好。此外，当观察在超声波存在下由保存溶液提供的保护时(条件4-6)，获得出乎意料的结果，表明超声波的更好保护，但这种保护在所有条件(4-6)下类似。换言之，与所用的保存溶液是lactatedringer溶液、celsior溶液或uw溶液无关，获得相同程度的保护。

图11：示出了与图10的肝脏所示的相同模式的肾脏保护。

图12：如预期的，与用uw在4℃和在室温(20-25℃)下保存相比，没有应用超声波的冷条件(条件1)且使用uw溶液将肝脏移植物的保护增加了约30％。出乎意料地，条件2(uw溶液，在超声波存在下且在室温下)获得的保护比条件1(uw溶液和冷，没有超声波)更好。换言之，在4℃保存溶液的存在下，在室温下的腔室中应用超声波比在低温条件下(温度为2-6℃的腔室)不用超声波更好。结果表明，条件3(没有保存溶液、在冷条件下且有超声波)获得的保护比在条件1和2下获得的更好，这也是出乎意料的。这些结果表明，与存在保存溶液和冷条件(条件1)或超声波(条件2)的组合相比，超声波和冷条件(即使不存在保存溶液)的组合更好。条件4和5分别示出了当使用uw溶液、超声波和冷条件时，预期的和观察到的保护。预期的保护，在最好情况下是条件1获得的保护和条件2获得的保护的总和。换言之，由于超声波诱导的热效应，预期保护1+2不会等于单独考虑的条件1和2的总和。然而，这并不是观察到的结果。所得结果表明当组合两种处理(冷条件和超声波)时具有协同作用，因为当组合两种处理时获得的保护比单独应用两种处理时获得的保护的总和好得多。此外，当组合两种处理且在保存溶液存在下获得的保护比当组合两种处理但没有保存溶液(条件3)获得的结果好得多。

图13：示出了与图5的肝脏所示的相同模式的肾脏保护。

因此，考虑所有结果，保存溶液、超声波和冷条件的组合对于冷缺血期间器官的运输和保存可以是极其有效的策略。

提供了在比目前可获得的条件更好的条件下，在低温条件下运输和储存生物样品并且没有氧气递送的方法和设备，其能有效地将超声波传输到腔室内的器官或组织。所有这些都可以减少冷缺血的有害影响，并且在移植物植入接受者之前增加移植物的活力，从而防止进行再一次移植。

用于保存的设备和方法也可用于二次器官；可用于移植的器官数量可能相应增加，从而减少等待名单。此外，由于在器官的保存和运输期间由冷缺血诱导的损伤减少，因此可以延长器官在冷却器中运输到植入接受者之前的时间。此外，设备易于运输，以防止除了其他因素外，由器官的动态保存引起的物流并发症。