本发明属于锌铁强化方法领域，具体涉及一种谷氨酰硫化物的芽苗菜锌铁强化方法。
背景技术：
芽苗菜，通常指利用植物种子在黑暗或光照条件下经萌发形成直接可供食用的嫩芽、幼苗或幼茎，被誉为“餐桌上的一抹嫩绿”，深受人们喜爱。芽苗菜在浸泡发芽的过程中，高分子储备物转化为可溶性小分子化合物，更利于人体吸收，且种子萌发使植酸含量大幅度降低，更利于提高矿质的生物利用。
锌铁是人体必需的微量元素。据统计，全球20-50％的人口面临锌铁缺乏引起的疾病威胁。在我国，长期的饮食习惯使得锌铁主要通过植物性食物进入人体。由于植源性锌铁会受到存在于食物中的草酸、多酚、肌醇六磷酸、膳食纤维甚至钙离子等抑制剂的影响，机体对锌铁的生物利用率极低。目前，解决人体矿质元素缺乏问题的途径通常有以下弊端，常规植物育种耗时费钱，生物技术费用高昂且伴有生物安全问题，长期高锌铁农艺种植也会带来土壤有效锌铁衰竭，传统补锌铁制剂易导致过量，进而产生自由基破坏机体和增加癌症的风险。大量研究表明，对粮食作物矿质元素的生物强化是解决人体微量元素缺乏的最有前景途径之一。因此，找到安全高效的矿质元素强化方法提高粮食锌铁生物有效性以满足亟待解决的锌铁缺乏问题是十分必要的。
技术实现要素：
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够提高锌铁生物利用率的谷氨酰硫化物的芽苗菜锌铁强化方法。
一种谷氨酰硫化物的芽苗菜锌铁强化方法，包括以下步骤：将待发芽芽苗菜试材用蒸馏水清洗阴干，在乙酸锌溶液(0-100μg/mL，以纯锌计)或硫酸亚铁溶液(0-50μg/mL，以纯铁计)中浸泡12h，期间以锌铁等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养5-7天。
前述谷氨酰硫化物可以为γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸、大蒜提取物、蒜泥中的任意一种。
前述谷氨酰硫化物可以为γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸、大蒜提取物、蒜泥中的任意两种、三种、四种、五种或六种的混合物。
前述芽苗菜试材可以为绿豆芽、红豆芽、黄豆芽、玉米芽或大蒜苗。
本发明的有益之处在于：
(一)研究发现随着锌铁培养液浓度的升高，添加谷氨酰硫化物的各种芽苗菜中锌铁总量均出现增加的情况。但是，过高浓度的锌铁培养液可能会导致芽苗菜表现出中毒症状，轻者抑制生根发芽，重者萎蔫死亡，虽然也能测出生长抑制的芽苗菜锌铁总含量在增加，但已失去食用和经济价值。本发明一种谷氨酰硫化物的芽苗菜锌铁强化方法是利用了谷氨酰半胱氨酸硫化物为类植物螯合肽具有羧基和巯基的化学本质，其具备较好的矿质元素螯合能力，其不仅仅可以改善环境锌铁的溶解状态，辅助锌铁跨膜运输，还可以在外界锌铁浓度过高时增强植物解毒排毒能力。因此添加谷氨酰硫化物不但可以减弱减缓芽苗中毒症状的出现，既不会抑制芽苗菜的生根发芽，更不会出现萎蔫死亡的现象，相反还会促进芽苗的生长，改善芽苗生长状态；更重要的是本方法可以不同程度提高芽苗菜对环境中锌铁吸收和转运各个环节的效率，从而增加不同部位锌铁含量，使得添加谷氨酰硫化物的芽苗菜比直接添加锌铁的芽苗菜的不同部位锌铁含量增加幅度在0-1074％范围内，该方法还能起到减少芽苗菜生长生产时间，有利于芽苗菜作为锌铁强化食材的推广和应用。
(二)本发明一种谷氨酰硫化物的芽苗菜锌铁强化方法具有很强的锌强化作用：
①采用适宜绿豆芽生长的锌浓度5μg/mL，强化培养绿豆芽时，使用本发明的方法添加大蒜提取物可以使胚根的锌含量提高35.34％(从45.70μg/g鲜重提高到61.85μg/g鲜重)；添加γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸可以使胚轴的锌含量提高83.44％(从26.14μg/g鲜重提高到47.95μg/g鲜重)；添加γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸可以使子叶的锌含量提高46.99％(从17.96μg/g鲜重提高到26.40μg/g鲜重)；
②采用适宜红豆芽生长的锌浓度10μg/mL，强化培养红豆芽时，使用本发明的方法添加大蒜提取物可以使胚根的锌含量提高83.62％(从86.28μg/g鲜重提高到158.43μg/g鲜重)；胚轴的锌含量提高19.56％(从48.68μg/g鲜重提高到58.20μg/g鲜重)；
③采用适宜黄豆芽生长的锌浓度50μg/mL，强化培养黄豆芽时，使用本发明的方法添加大蒜提取物可以使胚根的锌含量提高39.71％(从83.73μg/g鲜重提高到116.98μg/g鲜重)；胚轴的锌含量提高98.70％(从27.83μg/g鲜重提高到55.30μg/g鲜重)；子叶的锌含量提高126.79％(从19.93μg/g鲜重提高到45.20μg/g鲜重)；
④采用适宜玉米芽生长的锌浓度10μg/mL，强化培养玉米芽时，使用本发明的方法添加γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸可以使胚根的锌含量提高106.64％(从17.33μg/g鲜重提高到35.81μg/g鲜重)；添加γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸可以使胚轴的锌含量提高98.01％(从13.07μg/g鲜重提高到25.88μg/g鲜重)；添加γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸可以使子叶的锌含量提高86.90％(从11.83μg/g鲜重提高到22.11μg/g鲜重)；
⑤采用适宜大蒜芽生长的锌浓度5μg/mL，强化培养大蒜芽时，使用本发明的方法添加γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸可以使根的锌含量提高66.76％(从150.38μg/g鲜重提高到250.78μg/g鲜重)；添加γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸可以苗使的锌含量提高46.46％(从18.08μg/g鲜重提高到26.48μg/g鲜重)；添加γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸可以瓣的锌含量提高352.41％(从3.11μg/g鲜重提高到14.07μg/g鲜重)。
(三)本发明一种谷氨酰硫化物的芽苗菜锌铁强化方法具有很强的铁强化作用：
①采用适宜绿豆芽生长的铁浓度5μg/mL，强化培养绿豆芽时，使用本发明的方法添加γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸可以使胚根的铁含量提高29.55％(从15.67μg/g鲜重提高到20.30μg/g鲜重)；
②采用适宜红豆芽生长的铁浓度10μg/mL，强化培养红豆芽时，使用本发明的方法添加γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸可以使胚根的铁含量提高1074.44％(从3.60μg/g鲜重提高到42.28μg/g鲜重)；添加蒜泥可以使胚轴的铁含量提高292.45％(从7.95μg/g鲜重提高到31.20μg/g鲜重)；子叶的铁含量提高113.70％(从3.65μg/g鲜重提高到7.80μg/g鲜重)
③采用适宜黄豆芽生长的铁浓度10μg/mL，强化培养黄豆芽时，使用本发明的方法添加γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸可以使胚根的铁含量提高149.48％(从4.85μg/g鲜重提高到12.10μg/g鲜重)；胚轴的铁含量提高47.57％(从6.58μg/g鲜重提高到9.71μg/g鲜重)；
④采用适宜玉米芽生长的铁浓度5μg/mL，强化培养玉米芽时，使用本发明的方法添加γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸可以使胚根的铁含量提高194.93％(从4.34μg/g鲜重提高到12.80μg/g鲜重)；胚轴的铁含量提高221.39％(从3.46μg/g鲜重提高到11.12μg/g鲜重)；子叶的铁含量提高37.90％(从2.19μg/g鲜重提高到3.02μg/g鲜重)；
⑤采用适宜大蒜芽生长的铁浓度2.5μg/mL，强化培养大蒜芽时，使用本发明的方法添加γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸可以使根的铁含量提高50.32％(从36.47μg/g鲜重提高到54.82μg/g鲜重)；添加蒜泥可以使苗的铁含量提高37.09％(从12.16μg/g鲜重提高到16.67μg/g鲜重)。
附图说明
图1：添加谷氨酰硫化物对铁强化前后绿豆芽生长状态对比图。其中，a，蒸馏水；b，GSAC+5μg/mL Fe；c，GSAC+10μg/mL Fe；d，GSAC+50μg/mL Fe；e，5μg/mL Fe；f，10μg/mL Fe；g，50μg/mL Fe。
具体实施方式
1.大蒜提取物制备
鲜蒜1kg去皮洗净切块，加入1L乙醇，经灭酶、匀浆、过滤后，将粗提液浓缩至300mL，调至pH 2.0，上Dowex 50×4-400柱(5.0cm×60cm)，依次用去离子水和氨水(1mol/L)淋洗，目标组分浓缩，调至pH 7.0，上Dowex 2×8-200柱(5.0cm×40cm)，依次用去离子水和10％冰乙酸淋洗，含有大蒜提取物的组分冻干，主要为γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丙烯基-L-半胱氨酸等混合物，存于-80℃冰箱备用，进一步制备液相分离。
2.富锌铁芽苗菜培育
将待发芽试材用蒸馏水清洗阴干，每组30g，在乙酸锌溶液(0-100μg/mL，以纯锌计)或硫酸亚铁溶液(0-50μg/mL，以纯铁计)中浸泡12h，期间以锌铁等摩尔添加γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸、大蒜提取物、蒜泥的一种或任意几种的混合物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养。绿豆培养5d，其它7d。
3.锌铁含量测定
芽苗菜胚根(根)、胚轴(瓣)、子叶(苗)60℃干燥后磨粉并炭化，300℃预灰化1h，550℃灰化11h。0.5％硝酸将灰分定容至25mL，0.45μm膜过滤，火焰原子吸收分光光度计测定锌铁含量。
4.实验结果
4.1锌铁浓度对芽苗菜中锌铁总含量的影响
表1锌铁浓度对芽苗菜锌铁总含量影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
随着培养液中锌铁浓度的升高，各种芽苗菜中锌铁总量均出现增加的情况，并且添加谷氨酰硫化物后还会促进芽苗的生长，以绿豆芽为例，如图1a-d；但在不添加谷氨酰硫化物的条件下，当铁浓度超过10μg/mL多数芽苗会出现中毒现象，导致萎蔫甚至枯死，如图1f-g；而添加谷氨酰硫化物会减轻或减缓这一中毒现象，如图1c-d；若锌铁浓度进一步升高(＞50μg/mL)，具体情况请参考图1：添加谷氨酰硫化物对铁强化前后绿豆芽生长状态对比图。其中，a，蒸馏水；b，GSAC+5μg/mL Fe；c，GSAC+10μg/mL Fe；d，GSAC+50μg/mL Fe；e，5μg/mL Fe；f，10μg/mL Fe；g，50μg/mL Fe。
谷氨酰硫化物仍有助于芽苗菜对锌铁的富集，但过高浓度的锌铁会影响芽苗的生长，不利于其感官及商品价值。对于试验中的豆芽、玉米芽和大蒜苗来说，由于自身性质不同，它们耐受锌的最高浓度也不同，根据其生长状态可以看出，对于绿豆芽、红豆芽和大蒜苗，低于50μg/mL的锌溶液促进芽的生长，但当锌浓度高于50μg/mL时，它们生长明显受到抑制；而对于黄豆芽和玉米芽，0-100μg/mL浓度的锌溶液对其生长均表现为促进作用；根据其生长状态可以看出，对于绿豆芽、红豆芽、玉米芽、黄豆芽，低于50μg/mL的铁溶液促进芽的生长，但当铁浓度高于50μg/mL时，它们生长明显受到抑制。
4.2锌铁浓度对芽苗菜各部位锌铁含量的影响
表2锌铁浓度对芽苗菜各部位锌铁含量的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
4.3谷氨酰硫化物对芽苗菜各部位锌分布的影响
4.3.1不同硫化物对绿豆芽各部位中锌的分布规律的影响
将待发芽绿豆试材用蒸馏水清洗阴干，在适宜绿豆生长的锌浓度中，选取5μg/mL乙酸锌溶液(以纯锌计)中浸泡12h，期间以锌等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养5天。检测锌含量，结果见表3。
表3不同硫化物对绿豆芽各部位中锌的分布规律的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
4.3.2不同硫化物对红豆芽各部位中锌分布的影响
将待发芽红豆试材用蒸馏水清洗阴干，在适宜红豆生长的锌浓度中，选取10μg/mL乙酸锌溶液(以纯锌计)中浸泡12h，期间以锌等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养7天。检测锌含量，结果见表4。
表4不同硫化物对红豆芽各部位中锌的分布规律的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
4.3.3不同硫化物对黄豆芽各部位中锌的分布的影响
将待发芽黄豆试材用蒸馏水清洗阴干，在适宜黄豆生长的锌浓度中，选取50μg/mL乙酸锌溶液(以纯锌计)中浸泡12h，期间以锌等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养7天。检测锌含量，结果见表5。
表5不同硫化物对黄豆芽各部位中锌的分布规律的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
4.3.4不同硫化物对玉米芽各部位中锌的分布的影响
将待发芽玉米试材用蒸馏水清洗阴干，在适宜玉米生长的锌浓度中，选取10μg/mL乙酸锌溶液(以纯锌计)中浸泡12h，期间以锌等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养7天。检测锌含量，结果见表6。
表6不同硫化物对玉米芽各部位中锌的分布规律的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
4.3.5不同硫化物对大蒜苗各部位中锌的分布的影响
将待发芽大蒜试材用蒸馏水清洗阴干，在适宜大蒜生长的锌浓度中，选取5μg/mL乙酸锌溶液(以纯锌计)中浸泡12h，期间以锌等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养7天。检测锌含量，结果见表7。
表7不同硫化物对大蒜苗各部位中锌的分布规律的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
4.4谷氨酰硫化物对芽苗菜各部位铁分布的影响
4.4.1不同硫化物对绿豆芽各部位中铁的分布的影响
将待发芽绿豆试材用蒸馏水清洗阴干，在适宜绿豆生长的锌浓度中，选取5μg/mL硫酸亚铁溶液(以纯铁计)中浸泡12h，期间以铁等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养5天。检测铁含量，结果见表8。
表8不同硫化物对绿豆芽中铁的分布规律的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
4.4.2不同硫化物对红豆芽各部位中铁的分布的影响
将待发芽红豆试材用蒸馏水清洗阴干，在适宜红豆生长的锌浓度中，选取10μg/mL硫酸亚铁溶液(以纯铁计)中浸泡12h，期间以铁等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养7天。检测铁含量，结果见表9。
表9不同硫化物对红豆芽中铁的分布规律的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
4.4.3不同硫化物对黄豆芽各部位中铁的分布的影响
将待发芽黄豆试材用蒸馏水清洗阴干，在适宜黄豆生长的锌浓度中，选取10μg/mL硫酸亚铁溶液(以纯铁计)中浸泡12h，期间以铁等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养7天。检测铁含量，结果见表10。
表10不同硫化物对黄豆芽中铁的分布规律的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
4.4.4不同硫化物对玉米芽各部位中铁的分布的影响
将待发芽玉米试材用蒸馏水清洗阴干，在适宜玉米生长的锌浓度中，选取5μg/mL硫酸亚铁溶液(以纯铁计)中浸泡12h，期间以铁等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养7天。检测铁含量，结果见表11。
表11不同硫化物对玉米芽中铁的分布规律的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
4.4.5不同硫化物对大蒜苗各部位中铁的分布的影响
将待发芽大蒜试材用蒸馏水清洗阴干，在适宜大蒜生长的锌浓度中，选取2.5μg/mL硫酸亚铁溶液(以纯铁计)中浸泡12h，期间以铁等摩尔添加谷氨酰硫化物，之后将试材转移到恒温恒湿培养盒中，23℃培养7天。检测铁含量，结果见表12。
表12不同硫化物对大蒜苗中铁的分布规律的影响
a平均值±标准偏差，n＝3，*和**表示显著性差异，p＜0.05和p＜0.01
应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。