一种红山樱粉彩组培快速繁殖方法与流程

本发明涉及植物无性繁殖技术领域，尤其涉及一种红山樱‘粉彩’组培快速繁殖方法。

背景技术：

带芽茎段是目前使用最多的离体快繁外植体，众多试验表明樱花以茎段或芽心为外植体时可成功的诱导出丛生芽。愈伤培养是组织培养中非常常见并且也是重要的环节。任何外植体均可以通过愈伤组织培养诱导出芽和根。当外植体为叶片、叶柄、花瓣、花柄、子房等只能通过愈伤组织途径培养，很难直接诱导出丛芽，这可能与外植体的基因型、生理状态、生长调节剂配比、培养条件、继代周期等方面有关，仍需要进一步深入研究。尤其是褐化、污染、玻璃化是组织培养再生体系建立过程中常见的问题。

‘粉彩’(Cerasus jamasakura‘Fencai’)为蔷薇科樱属红山樱种系的一个，具有极大的观赏价值，但目前存在繁殖障碍，市场无商品苗提供。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种红山樱‘粉彩’组培快速繁殖方法，建立‘粉彩’的再生体系，获得优质的‘粉彩’种苗。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

1、一种红山樱‘粉彩’组培快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)剪取春季‘粉彩’健壮嫩枝，去除叶片，剪成2～3cm带芽茎段，洗净消毒，放入配方为1/4MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.01mg/L+琼脂3.3g/L+蔗糖30g/L的培养基中，培养一周后诱导出丛芽；

2)将茎段基部不带愈伤组织的丛芽直接转移到MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+TDZ 0.5mg/L+琼脂3.3g/L+蔗糖30g/L的培养基中进行增殖；

3)丛芽茎段在配方为MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.05mg/L+GA 5～7mg/L+琼脂3.3g/L+蔗糖30g/L的培养基中进行壮苗，当不定芽长到2～3cm时，转入1/2MS+NAA 0.8mg/L+琼脂3.3g/L+蔗糖30g/L的培养基中生根，培养30d；

4)将生长健壮的幼苗在自然光下带盖炼苗3～4d，洗净培养基，移至细沙：珍珠岩：蛭石(1:1:1)的基质中，保持稳定的温湿度和透气性，每隔7d对幼苗进行一次1000倍多菌灵喷雾消毒。

2、一种红山樱‘粉彩’组培快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)摘取春季‘粉彩’展叶期鲜嫩叶片，洗净消毒，无菌条件下剪去叶脉及叶柄，在叶背划出2～3处创伤，接种于配方为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+2,4-D 2mg/L+琼脂3.3g/L+蔗糖30g/L或MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L+2,4-D 2mg/L+琼脂3.3g/L+蔗糖30g/L的启动培养基上培养，直至培育出愈伤组织；

2)将愈伤组织转移到MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L+Vc 20mg/L+琼脂3.3g/L+蔗糖30g/L的培养基上增殖培养，每15d继代一次；

3)将增殖后的愈伤组织转移至MS+6-BA 0.2～0.3mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L+TDZ 0.1～0.3mg/L+琼脂3.3g/L+蔗糖30g/L的培养基上诱导分化。

步骤1)中洗净消毒的方法为：自来水冲洗1～2h，75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3～5次，0.1％HgCl₂消毒5min，再用无菌水冲洗5～6次。

步骤2)中，丛芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L+Vc 20mg/L+琼脂3.3g/L+蔗糖30g/L。

有益效果：与现有的技术相比，本发明的‘粉彩’组培快速繁殖方法，有效建立出‘粉彩’的再生体系，能快速高效的获得优质种苗，解决了实生苗生长周期长的问题，为工厂化育苗缩短了时间、提高了效率、降低了成本，同时保留了母本的优良性状。研究中发现丛芽诱导效率较高，最高可达95.00％、增殖量大，生长旺盛，成功实现了无菌苗的大量培育，得出了较佳的培育体系；愈伤组织的诱导及分化还需要进一步的研究。

附图说明

图1是茎段诱导图；

图2是丛芽增殖图；

图3是茎段生根图；

图4是愈伤诱导图；

图5是愈伤分化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

一种红山樱‘粉彩’组培快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)茎段芽诱导培养：

不定芽诱导：剪取春季‘粉彩’健壮嫩枝，去除叶片，剪成2～3cm带芽茎段洗净消毒，结果表明：0.1％HgCl₂消毒时间为5min时较佳。无菌茎段接种到以MS、1/2MS、1/4MS为基本培养基，以6-BA和IBA为激素组合的启动培养基中。结果如表1所示，表明：1/4MS+6-BA1.0mg/L+IBA 0.01mg/L的组合出芽率最高，为95.00％，出芽时间最短，约7d；如图1所示。而MS+6-BA 0.5mg/L+IBA0.01mg/L的组合出芽率最低，为45.00％，出芽时间超过10d。

表1启动培养结果

2)丛芽增殖培养：将生长健壮的丛芽块作为外植体进行丛芽增殖，以MS为基本培养基，以6-BA(0.1、0.5、1.0mg/L)+NAA(0.02、0.05、0.08、0.10mg/L)组合的12组培养基和6-BA(0.5、1.0、1.5mg/L)+IBA(0.01、0.05、0.10、0.20mg/L)组合的12组培养基以及6-BA(0.5、1.0mg/L)+NAA(0.05、0.10mg/L)+TDZ(0.1、0.5mg/L)组合的8组培养基中进行丛芽增殖试验。统计丛芽增殖系数及生长情况。结果如表2、表3、表4所示，表明：6-BA+NAA+TDZ的激素组合丛芽增殖时间最短，为10d，增殖系数最高，其中MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+TDZ 0.5mg/L的培养基丛芽增殖系数最高，为5.27，且增殖快，丛芽密集，生长良好，但芽段略细弱(如图2所示)；6-BA+IBA的激素组合丛芽增殖时间最长，为20d，但苗都较为健壮，其中MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L的培养基丛芽增殖系数最高，为2.99，丛芽增殖速度一般；6-BA+NAA的激素组合丛芽增殖时间介于前两者之间，为16d，其中MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L的培养基丛芽增殖效果最好，增殖系数为3.15，略有愈伤，丛芽较密集，生长健壮。

表2丛芽增殖结果

表3丛芽增殖结果

表4丛芽增殖结果

3)壮苗及生根培养：将小苗培养在壮苗及生根培养基中，以MS为基本培养基，添加6-BA 1.0mg/L，NAA 0.05mg/L，GA(0、0.5、1.0、2.0、5.0、7.0、10.0mg/L)3种激素，共设置7个处理进行壮苗试验。结果如表5所示，确定MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.05mg/L+GA 5～7mg/L培养基壮苗效果理想。

表5壮苗结果

以1/4MS、1/2MS、3/4MS和MS为基本培养基的生根率分别为50.00％、63.33％、60.00％、46.67％。采用1/2MS培养基添加NAA(0、0.2、0.5、0.8、1.0mg/L)+IBA(0、0.2、0.5、0.8、1.0mg/L)进行交叉对比试验，发现NAA 适合作为生根诱导激素，浓度为0.8mg/L时，生根率最高，且不定根健壮，须根发达，苗生长良好，即最佳的生根培养基为1/2MS+NAA 0.8mg/L+琼脂3.3g/L+蔗糖30g/L，生根率达83.33％，如图3和表6所示。

表6生根结果

4)试管苗的移栽：将生长健壮的幼苗在自然光下带盖炼苗3～4d，洗净培养基，移至细沙：珍珠岩：蛭石(1:1:1)的基质中，保持稳定的温湿度和透气性，每隔7d对幼苗进行一次1000倍多菌灵喷雾消毒，移栽成活率达60％，苗生长快，健壮。

实施例2

一种红山樱‘粉彩’组培快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)愈伤组织诱导培养：

愈伤组织诱导：摘取春季‘粉彩’展叶期鲜嫩叶片及花，洗净消毒，结果表明：用0.1％HgCl₂消毒效果佳，花器官的消毒时间定为4min时消毒效果最佳，叶片的最佳消毒时间初步定为5min。将花分离成花瓣、花梗、萼筒、子房、萼片等5部分，将叶分离成叶片、叶脉、叶柄等3部分，在每种外植体背面划出2～3处创伤，但不划透，伤口朝下接种于启动培养基上。启动培养基以MS为基本培养基，添加6-BA(0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L)和NAA(2.0、1.5、1.0、0.5、0mg/L)组合，2,4-D 2mg/L，琼脂3.3g/L，蔗糖30g/L。总体来看，花各部结构愈伤组织诱导效果为萼筒＞花梗＞子房＞花瓣＞花萼，叶各部结构愈伤组织诱导效果为叶片＞叶柄＞叶脉。当激素水平为6-BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L或6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L时，平均出愈时间约9d，愈伤组织生长较快，结构疏松，乳白色，少褐化，量多，如图4和表7所示。

表7启动培养结果

2)愈伤组织的增殖：挑选部分生长健康的淡乳白色的愈伤组织接种于以MS+6-BA(0.5、1.0、2.0mg/L)和NAA(0.1、0.3、0.5mg/L)的培养基中进行增殖，结果表明：愈伤组织在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L的培养基上增殖效果佳，一周后愈伤组织增重1.47g，质地疏松，小颗粒状。在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L培养基上添加浓度为0.5、1.0、2.0mg/L的KT、ZT、2,4-D进行增殖，结果如表8和9所示，表明：ZT浓度为1.0mg/L时，一周后愈伤组织增重1.98g，小颗粒状，乳白色。

表8增殖结果

表9增殖结果

3)愈伤组织分化：以MS+6-BA(0.1、0.5、1.0mg/L)+NAA(0.1、0.2、0.5mg/L)组合，附加TDZ(0.1、0.5、1.0mg/L)进行愈伤组织分化，结果表明：低浓度6-BA对愈伤组织分化有利，浓度为0.1～0.5mg/L时愈伤组织生长健康。当以MS+6-BA(0.1、0.2、0.3mg/L)+NAA(0.1、0.2、0.3mg/L)+TDZ(0.1、0.2、0.3mg/L)为优化组合时，6-BA、NAA、TDZ浓度在0.2～0.3mg/L时，愈伤组织分化较为成熟，有较多芽点的产生，经过多次继代后有少部分芽的分化，如图5和表10所示。

表10愈伤组织分化结果

实施例3

将实施例2诱导得到的生长健康淡乳白色的愈伤组织接种到含有不同防褐化剂添的MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L愈伤增殖培养基中继代培养。防褐化剂种类如下VC(5、10、20mg/L)、CA(5、10、20mg/L)、PVP(500、1000、1500mg/L)、AC(500、1000、1500mg/L)。结果如表11所示，表明：Vc的防褐化效果较柠檬酸钠(CA)理想，当Vc 20mg/L时，愈伤组织少量褐化，增殖快，结构疏松，乳白色；比较2种吸附剂，PVP的防褐化效果优于活性炭(AC)，当PVP浓度为500mg/L时防褐化效果最好。