光响应性控释纳米农药制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及控释纳米农药制剂，特别是涉及一种光响应性控释纳米农药制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

农业上农药的广泛使用有助于实现全球粮食安全，但是也给人类和环境带来了不良影响。有高达90％的传统农药的使用存在诸多问题：从未到达作用靶点、到达作用靶点发挥药效的时间不够或者到达靶点的药物数量没有达到要求，从而难以发生预期的生物效应。

造成这一现象的原因是这些农药的非特异性和重复多次施用。这不仅提高了农药使用成本，而且也导致环境污染。因为合成新型化合物的以替代现有农药的成本过高以及其他种种限制因素，人们转而将注意力转向开发农药控释传递系统。农药控释剂因其特有的如下优点，成为治理农药负面问题的新希望：(1)可以使高毒品种低毒化，避免或减轻高毒农药品种在使用过程中对人、畜及有益微生物的急性中毒和伤害，也可以避免或减轻农药对环境的污染。(2)可以使农药减少在环境中的光解、水解、生物降解、挥发、流失等，使用药量大大减少，而持效期大大延长。(3)由于药剂释放剂量和时间可以得到控制，因而药剂的功能性得到提高。

最近由亲水基团和疏水基团组成的两亲性聚合物在生物技术和医药制剂应用领域引发了人们日益关注。在水溶液中，这种两亲性聚合物能自组装形成核-壳结构的纳米胶束或自聚集体，其疏水核能充当一个药库疏水区包囊各种疏水的生物活性物质；由亲水链段组成的壳能赋予胶束水溶性和立体稳定性，它能保护包载的药物免于在流体中失活。更为重要的是，聚合物胶束由于较低的临街胶束浓度能对抗环境稀释，与基于表面活性的胶束相比具有更高的稳定性。考虑到良好的生物相容性、生物可降解性和低毒，采用亲水性的天然多糖为基质，通过疏水改性制备两亲性聚合物，然后在水溶液中自组装成聚合物胶束，用作各种疏水性生物活性物质的载体被认为是控释制剂技术领域最具前景的方向之一。

刺激响应性聚合物纳米胶束是一种能响应外界光刺激而发生形态或结构改变的微粒。目前为止已经成功开发了多种包括pH，温度，光，还原电势和酶等刺激敏感的聚合物纳米胶束，其中光响应性聚合物纳米胶束用作药物载体，由于能在时空上很方便地调节药物释放，因而在药物传递和控释领域备受关注。一般来讲，构建光响应纳米粒需要用到一个光触发基团(phototrigger)诸如4-香豆素亚甲氧基、2-硝基苯甲氧基和7-硝基吲哚啉等。在这些光触发基团中，2-硝基苯甲氧基更具吸引力，因为它能在紫外光或近红外光下发生光解反应，破坏含有2-硝基苯甲氧基的两亲性聚合物的亲疏平衡，导致自组装体系的破裂。例如，MengL等人设计合成了基于含有2-硝基苯甲氧基的两亲性壳聚糖的胶束系统(Biomacromolecules,14,2601–2610)，该系统能响应紫外光刺激释放疏水抗癌药物喜树碱，对MCF-7癌细胞显示出良好的细胞毒性。然而，至今文献中所报道的光响应纳米粒主要用作控释药物的载体，用于农药控制释放的设计尚未见报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：为了解决现有技术中存在的问题，提供一种新型的光响应性的控释纳米农药制剂及其制备方法和应用。该方法不仅工艺简单，操作简便，而且制备的纳米农药制剂具有较好的光响应性，可以通过选择在无光照的条件下喷施作用靶植物及害虫表面或体内；一旦作用到靶植物及害虫表面或体内，能随时响应外界太阳光刺激释放农药。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的光响应性控释纳米农药制剂，其控释有效成分为两亲性羧甲基壳聚糖衍生物，其由邻硝基苄基琥珀酸单酯与羧甲基壳聚糖反应制得。

所述的两亲性羧甲基壳聚糖衍生物，可以由以下方法制成：

先取羧甲基壳聚糖的水溶液，按照羧甲基壳聚糖的糖单元与邻硝基苄基琥珀酸单酯的摩尔比为1：(0.01～1)加入经EDC·HCl和NHS活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯(NBS)的有机溶液中，室温下反应6h，得到两亲性羧甲基壳聚糖溶液；所述有机溶液是二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺溶液中的一种，或其两种任意重量配比组成的混合溶液；再经透析、冷冻干燥，得到两亲性羧甲基壳聚糖衍生物，其为光响应性羧甲基壳聚糖衍生物。

上述方法中，按1:0.2摩尔比，将光响应性羧甲基壳聚糖衍生物和农药同时分散于水中，超声3min，得光响应性控释纳米农药制剂。

所述的农药为杀虫剂、除草剂或植物生长调节剂中的一种，或几种混合物。

本发明提供的光响应性控释纳米农药制剂的制备方法，具体是采用包括以下步骤方法：

(1)羧甲基壳聚糖水溶液的制备：

将羧甲基取代度为0.1～1.8的羧甲基壳聚糖加入到水中，羧甲基壳聚糖水溶液的重量百分比浓度为0.08～10％，然后于室温下搅拌均匀，得到所述羧甲基壳聚糖水溶液；

(2)邻硝基苄基琥珀酸单酯的合成：

先称取摩尔比为1:2的邻硝基苯甲醇与琥珀酸酐溶于氯仿中，加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)，氮气保护环境下，回流反应24h，停止反应后，减压蒸馏除去部分氯仿，剩余反应液用质量浓度10％(w/w)的HCl溶液洗涤三次，再用饱和的碳酸氢钠溶液萃取洗涤后，用质量浓度10％(w/w)的HCl溶液调节水相pH至5，收集白色沉淀物，然后将白色沉淀物于40℃真空干燥，得到所述邻硝基苄基琥珀酸单酯；

(3)NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯有机溶液的制备：

先将邻硝基苄基琥珀酸单酯溶于有机溶剂，于室温下搅拌均匀，制得重量百分比浓度为5％～85％的邻硝基苄基琥珀酸单酯有机溶液；再将该有机溶液降温至0-5℃，按邻硝基苄基琥珀酸单酯：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)为1：1.1：1.1的摩尔比依次投放NHS和EDC·HCl，然后于室温反应24h，将反应液过滤，得到所述NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯有机溶液；

(4)光响应性羧甲基壳聚糖衍生物的制备：

先取羧甲基壳聚糖的水溶液，按照羧甲基壳聚糖的糖单元与邻硝基苄酯的摩尔比为1：(0.01～1)加入经NHS和EDC·HCl活化的邻硝基基琥珀酸单酯有机溶液，于去离子水中透析48h，再冷冻干燥透析液，得到所述光响应性羧甲基壳聚糖衍生物；

(5)光响应性控释纳米农药制剂的制备：

采用原位载药法，将光响应性羧甲基壳聚糖衍生物和农药同时分散于水中，超声分散后，即得所述光响应性的控释纳米农药制剂。

上述方法中，所述减压蒸馏工艺为：采用旋转蒸发仪，转速100转/分钟，温度设置35℃。

上述方法中，所述冷冻干燥工艺为：先将样品于零下20度预冻过夜，将冷冻干燥机抽真空，温度降到零下100摄氏度时，放入预冻好的样品，24小时后取出。

上述方法中，所述超声分散工艺为：室温下，超声仪功率为100W，工作时间/间歇时间为2s/2s，共3分钟。

上述方法中，取质量百分比浓度为0.01％～5％光响应羧甲基壳聚糖衍生物水溶液，加入占该衍生物水溶液质量5％～50％的农药中，该农药是杀虫剂、除草剂、植物生长调节剂中的一种，或几种混合物。

本发明提供的上述方法制备的光响应性控释纳米农药制剂，其在无光照的条件下喷施用靶植物及害虫表面或体内中的应用；一旦该制剂位于用靶植物及害虫表面或体内，则随时响应外界太阳光刺激释放农药。

本发明与现有技术相比具有以下主要优点：

(1)本制剂表面带负电荷，叶片表面带正电荷，故该纳米粒子可以吸附在叶面上避免雨水冲刷，提高药物利用率。

(2)本制剂首次将农药包载到光响应纳米粒里，能在太阳光下实现响应，并能达缓慢释放药物的效果(8小时释放95％以上)，在无光照射下，基本无药物泄漏(药物释放率小于4％)，能够减少施药次数，提高了药物作用效率。

(3)本制剂通过两分子自组装形成的纳米粒，具有较好的抗稀释稳定性(临界胶束浓度低达0.019mg/ml)，与基于表面活性的胶束相比具有更高的稳定性。

附图说明

图1为本发明制备的邻硝基苄基琥珀酸单酯的核磁图谱(NBS在CDCl₃中¹H-NMR图谱)。

图2为本发明制备的羧甲基壳聚糖的核磁图谱(羧甲基壳聚糖(CMCS)在D₂O中¹H-NMR图谱)。

图3为本发明制备的光响应性羧甲基壳聚糖的核磁图谱(光响应两亲性羧甲基壳聚糖衍生物(NBS-CMCS)在DMSO-d₆/D₂O(1:3，v/v)中¹H-NMR图谱)。

图4为本发明制备的羧甲基壳聚糖和光响应性羧甲基壳聚糖的红外图谱。

图5为本发明制备的光响应性羧甲基壳聚糖在365nm紫外光下辐射不同时间段的紫外吸收曲线。

图6为本发明制备的光响应性控释纳米胶束在365nmUV光照前的透射电镜图。

图7为本发明制备的光响应性控释纳米胶束在365nmUV光照后的透射电镜图。

图8为本发明制备的光响应性控释纳米农药制剂的体外释药曲线图，该图反映了实施例1和实施例4制备的光响应性控释纳米制剂在pH7.0缓冲溶液中有光照或无光照条件下药物释放曲线图(以敌草隆为模型农药)。作为控制样品，无光辐射的条件下，负载敌草隆的两种控释纳米农药制剂在pH7.0的缓冲溶液中4h内分别只有4.33％和3.35％的敌草隆释放；而在模拟太阳光照射下，在两小时以内，分别有75.80％和71.80％的敌草隆从两种样品中释放出来。随着暴露在模拟太阳光下的时间进一步延长，敌草隆的释放会继续增加，累积释放率在5h分别达到98.30％和96.60％。图8中：■.模拟太阳光照射(200-2500nm光谱输出，50W辐射输出)；▲.无光照射。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明，但不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：

(1)邻硝基苄基琥珀酸单酯的制备：

称取摩尔比为1:2邻硝基苯甲醇与琥珀酸酐溶于氯仿中，加入为原料物质的量的0.2倍的量的催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)，氮气保护环境下，回流反应24h，停止反应后，减压蒸馏除去部分氯仿，剩余反应液用体积百分比浓度为10％(v/v)HCl溶液洗涤三次，然后用饱和的碳酸氢钠溶液萃取洗涤后，用体积百分比浓度为10％(v/v)HCl溶液调节水相pH至5，有大量白色沉淀生成。收集白色沉淀物，于40摄氏度真空干燥，即得邻硝基苄基琥珀酸单酯(NBS)。

所述真空干燥工艺参数为：真空度<133Pa，温度：40℃，干燥时间：24h。

(2)NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMSO溶液的制备：

取邻硝基苄基琥珀酸单酯溶于DMSO，室温搅拌均匀，制得重量百分比浓度为10％的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMSO溶液。该溶液降温至0-5℃，按邻硝基苄基琥珀酸单酯：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)为1：1.1：1.1的摩尔比依次投放NHS和EDC·HCl，室温反应24h，反应液过滤，获得经NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMSO溶液。

(3)光响应性羧甲基壳聚糖的制备：

取羧甲基取代度为0.75、重量百分比浓度为2.0％的羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖单元与邻硝基苄基琥珀酸单酯摩尔比为1:0.07加入经NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯的DMSO溶液，于室温、避光和氮气保护下反应6h后，用去离子水透析至中性，冷冻干燥，得光响应性羧甲基壳聚糖。

所述冷冻干燥工艺参数为：温度：-100℃，真空度：<10Pa，时间：24h。

(4)取重量百分比浓度为2％的光响应性羧甲基壳聚糖水溶液，加入占该衍生物质量35％的除草剂，超声氧化巯基，即得光响应性羧甲基壳聚糖控释纳米农药制剂。使用时可根据除草剂的有效剂量适当加水配制，喷雾使用。

所述超声氧化巯基工艺为：功率100W，超声3min。

实施例2：

(1)邻硝基苄基琥珀酸单酯的制备：

同实施例1。

(2)NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMF溶液的制备：

取邻硝基苄基琥珀酸单酯溶于DMF，室温搅拌均匀制得重量百分比浓度为20％的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMF溶液。该溶液降温至0-5℃，按邻硝基苄基琥珀酸单酯：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)为1：1.1：1.1的摩尔比依次投放NHS和EDC·HCl，室温反应24h，反应液过滤，获得经NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMF溶液。

(3)光响应性羧甲基壳聚糖的制备

取羧甲基取代度为1.2、重量百分比浓度为1.0％的羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖单元与邻硝基苄基琥珀酸单酯摩尔比为1:0.3加入经NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯的DMF溶液，于室温、避光和氮气保护下反应6h后，用去离子水透析至中性，冷冻干燥，得光响应性羧甲基壳聚糖。

(4)取重量百分比浓度为4％的光响应性羧甲基壳聚糖水溶液，加入占该衍生物质量6％的植物生长调节剂，超声分散即得光响应性羧甲基壳聚糖控释纳米农药制剂。使用时可根据植物生长调节剂的有效剂量适当加水配制，喷雾使用。

实施例3：

(1)邻硝基苄基琥珀酸单酯的制备：

同实施例1。

(2)NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMF溶液的制备：

取邻硝基苄基琥珀酸单酯溶于DMF，室温搅拌均匀制得重量百分比浓度为15％的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMF溶液。该溶液降温至0-5℃，按邻硝基苄基琥珀酸单酯：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)为1：1.1：1.1的摩尔比依次投放NHS和EDC·HCl，室温反应24h，反应液过滤，获得经NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMF溶液。

(3)光响应性羧甲基壳聚糖的制备

取羧甲基取代度为1.6、重量百分比浓度为5.0％的羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖单元与邻硝基苄基琥珀酸单酯摩尔比为1:0.5加入经NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯的DMF溶液，于室温、避光和氮气保护下反应6h后，用去离子水透析至中性，冷冻干燥，得光响应性羧甲基壳聚糖。

(4)取重量百分比浓度为1％的光响应性羧甲基壳聚糖水溶液，加入占该衍生物质量30％的杀虫剂，超声分散即得光响应性羧甲基壳聚糖控释纳米农药制剂。使用时可根据杀虫的剂的有效剂量适当加水配制，喷雾使用。

实施例4：

(1)邻硝基苄基琥珀酸单酯的制备：

同实施例1。

(2)NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMSO溶液的制备：

同实施例1。

(3)光响应性羧甲基壳聚糖的制备

取羧甲基取代度为0.75、重量百分比浓度为5.0％的羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖单元与邻硝基苄基琥珀酸单酯摩尔比为1:0.15加入经EDC·HCl和NHS活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMSO溶液，于室温、避光和氮气保护下反应6h后，用去离子水透析至中性，冷冻干燥，得光响应性羧甲基壳聚糖。

(4)取重量百分比浓度为2％的光响应性羧甲基壳聚糖水溶液，加入占该衍生物质量40％的除草剂，超声分散即得光响应性羧甲基壳聚糖控释纳米农药制剂。使用时可根据除草剂的有效剂量适当加水配制，喷雾使用。

实施例5：

(1)邻硝基苄基琥珀酸单酯的制备：

同实施例1。

(2)NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMSO与DMF混合溶液的制备：

取邻硝基苄基琥珀酸单酯溶于DMSO与DMF(体积比1：10)，室温搅拌均匀制得重量百分比浓度为15％的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMSO与DMF混合溶液。该溶液降温至0-5℃，按邻硝基苄基琥珀酸单酯：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)为1：1.1：1.1的摩尔比依次投放NHS和EDC·HCl，室温反应24h，反应液过滤，获得经NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMSO与DMF混合溶液。

(3)光响应性羧甲基壳聚糖的制备

取羧甲基取代度为1.6、重量百分比浓度为5.0％的羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖单元与邻硝基苄基琥珀酸单酯摩尔比为1:1.0加入经NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯的DMSO与DMF混合溶液，于室温、避光和氮气保护下反应6h后，用去离子水透析至中性，冷冻干燥，得光响应性羧甲基壳聚糖。

(4)取重量百分比浓度为3％的光响应性羧甲基壳聚糖水溶液，加入占该衍生物质量35％的杀虫剂，超声分散即得光响应性羧甲基壳聚糖控释纳米农药制剂。使用时可根据杀虫剂的有效剂量适当加水配制，喷雾使用。

实施例6：

(1)邻硝基苄基琥珀酸单酯的制备：

同实施例1。

(2)NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMF与DMSO混合溶液的制备：

取邻硝基苄基琥珀酸单酯溶于DMF与DMSO(体积比1：50)，室温搅拌均匀制得重量百分比浓度为60％的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMF与DMSO混合溶液。该溶液降温至0-5℃，按邻硝基苄基琥珀酸单酯：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)为1：1.1：1.1的摩尔比依次投放NHS和EDC·HCl，室温反应24h，反应液过滤，获得经EDC·HCl和NHS活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯DMF与DMSO混合溶液。

(3)光响应性羧甲基壳聚糖的制备

取羧甲基取代度为0.8、重量百分比浓度为0.8％的羧甲基壳聚糖水溶液，按照羧甲基壳聚糖单元与邻硝基苄基琥珀酸单酯摩尔比为1:1.1加入经NHS和EDC·HCl活化的邻硝基苄基琥珀酸单酯的DMF与DMSO混合溶液，于室温、避光和氮气保护下反应6h后，用去离子水透析至中性，冷冻干燥，得光响应性羧甲基壳聚糖。

(4)取重量百分比浓度为0.05％的光响应性羧甲基壳聚糖水溶液，加入占该衍生物质量50％的除草剂，超声分散即得光响应性羧甲基壳聚糖控释纳米农药制剂。使用时可根据除草剂的有效剂量适当加水配制，喷雾使用。

取上述实施例1、2、3、4、5和6中制备的光响应性羧甲基壳聚糖，在365nm处UV的辐射下，测定其紫外吸收曲线随UV辐射时间的变化，表征其UV光解行为。

取上述实施例1、2、3、4、5和6中制备的空白制剂样品(不添加农药的样品)，采用透射电镜观察UV的辐射前后的形态变化，表征其光响应行为。

将上述实施例1、2、3、4、5和6中制备的光响应性控释纳米农药制剂冷冻干燥后，分别溶于pH为7.0的缓冲溶液中，在不同的光照条件下，用高效液相法测定纳米农药制剂的累积释药率，研究其体外释药行为。具体如下：

上述实施例中的纳米农药制剂冷冻干燥后，取一定量样品分散在磷酸盐缓冲溶液(0.1M，pH7.0)中，然后投入透析袋(截止分子量：14000)。将透析袋引入装有80mL磷酸盐缓冲液的柱塞锥形瓶中，并将锥形瓶放入恒温摇床中，控制温度在25±1℃，在震荡状态下置于紫外灯下辐射。在适当时间间隔内，取出2mL样品溶液，再加入新的2mLPBS，使用HPLC来检测药物释放。没有光照的的样品作为控制样。

采用模拟太阳光取代UV辐射，同样的方法可评价上述实施例中纳米农药制剂的释药行为。太阳光模拟器是300W氙弧灯(200-2500nm光谱输出，50W辐射输出)。

按农药标准曲线计算药物浓度。采用以下公式计算农药的累积释药率(Re)：

Re＝M_t/M₀

式中：Re为纳米制剂的累积释药率；M_t为纳米制剂在缓冲溶液中在时间t的累积释药量；M₀为纳米制剂中包载的农药总质量。

尽管这里参考给出的实施方案说明并且描述了本发明的某些方面，但并不是为了将所附的权利要求限定到所显示的细节中。相反，可以预料本领域的技术人员可以对这些细节进行不同的修改，其中这些修改应该还在所要求的主题的精神和范围内，并且是为了相应地解释这些权利要求。