本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种利用大豆组合苗筛选耐盐基因的方法。
技术背景
耕地盐碱化是目前我国农业生产中面临的主要问题之一，其严重影响了我国农业生产及粮食安全。培养耐盐碱的作物新品种是面对盐碱化的有效手段之一，而培育大豆耐盐新品种对于进一步提高大豆产量具有重要意义。筛选耐盐大豆资源并从中寻找耐盐关键基因是培育耐盐材料的快速直接的方法，并对探究大豆耐盐机理具有重要意义。然而由于大豆遗传转化困难，转化率低，转化周期长导致耐盐基因功能鉴定效率低下。
因此本领域的技术人员致力于开发一种简便快速利用组合苗鉴定大豆耐盐基因功能的方法。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供了一种利用大豆组合苗筛选耐盐基因的方法，在一个具体实施方式中，该方法包括：
1)大豆籽粒经消毒、培养后获取大豆地上部分外植体；
2)对地上部分外植体进行根系的诱导培养，获得组合苗；
3)对完整的组合苗进行盐胁迫筛选，鉴定耐盐基因。
进一步地，步骤1中，挑取成熟饱满表皮无病变的大豆籽粒进行表面消毒后，种植于珍珠岩中并浇灌Hoagland营养液，使其生长至第一对三出复叶完全展开。
优选地，大豆籽粒消毒为使用氯气，在静置条件下消毒16-20小时。进一步优选地，将籽粒在无菌条件下通风10-20分钟。
优选地，珍珠岩使用前需经过10-20分钟消毒，消毒温度为127℃。
进一步地，在大豆植株子叶节下方2-3cm处沿斜下30度角度将大豆植株切断，获得大豆地上部分外植体。
进一步地，在步骤2中，将4-7ml利用1/4MS基础盐(basalt salt)液体培养基重悬的含有待鉴定基因的发根农杆菌k599菌液滴加至岩棉块中，之后将步骤1中获得的大豆植株地上部分外植体下部垂直插入该岩棉中部，使植株下部没入岩棉2-2.5cm。
优选地，在步骤2中，岩棉块的大小为3cm×3cm×3cm，其中一面戳一个直径2mm，深度1.5-2cm的孔。
进一步地，在步骤2)中，将插有大豆植株地上部分的岩棉块放入洁净保湿盒中过夜保湿，第二天拿下保湿盒上盖，直到豆苗全部出现萎蔫后，加入无菌1/4MS basal salt溶液，盖上保湿盒，直到豆苗恢复正常状态。适当添加无菌的去离子水保持岩棉块湿润。2周后用镊子轻轻撕下岩棉块，除去非切口处的根，获得大豆组合苗。
进一步地，步骤3中，将获得的大豆组合苗转移到含有灭菌后的蛭石及珍珠岩的小花盆中，加入适当地Hoagland营养液。其中，蛭石/珍珠岩＝3：1，小花盆直径10cm，高9cm。
进一步地，步骤3)中，对大豆组合苗进行盐胁迫处理，对组合苗的地上部分及再生根进行耐盐基因表达鉴定。
进一步地，上述盐胁迫为：每天用50ml 100mmol/L的NaCl溶液浇灌1周，1周后对组合苗的地上部分及再生根进行鉴定。
进一步地，使用大豆品系为东农47，天隆1号。
本发明在常规通过转基因手段进行大豆基因功能研究的基础上，使用大豆组合苗对基因功能进行研究。利用由非转基因的大豆植株地上部分与转基因的大豆根系组成的大豆组合苗系统对大豆基因进行功能鉴定不仅可以大大缩短鉴定周期，同时又克服了不同遗传背景下基因功能发生变化的不确定性等问题。该方法整体操作简单，且效率高，有利于加快大豆基因功能鉴定的进程，能够明显缩短基因功能鉴定周期。
以下将结合具体实施例对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
具体实施方式
实施例中使用的待鉴定基因GmNHX1和GmNHX2均是已知的耐盐基因，用于举例说明，并不用于限定发明的范围。
在实际的耐盐基因筛选中，通过用农杆菌侵染转入了目的基因的大豆组合苗进行盐胁迫处理，若生长良好说明之前用于转化的农杆菌携带的是耐盐基因；若生长萎蔫则农杆菌携带的不是耐盐基因。
实施例1
(1)大豆籽粒经消毒、培养后获取大豆地上部分外植体
选择当年收获的熟饱满表皮无病变的大豆品种东农47的籽粒。将种子平铺于培养皿并将培养皿敞开置于氯气环境中16小时后，将种子连同培养皿敞开置于超净工作台中通风15分钟。将完成消毒的籽粒置于消毒过的珍珠岩中，并浇灌Hoagland营养液，2周之后大豆植株生长至第一对三出复叶完全展开。利用锋利刀片在大豆植株子叶节下方2-3cm处沿斜下30度角度将大豆植株切断，获得大豆植株上部分外植体。
其中珍珠岩使用前消毒15分钟，消毒温度127℃。
(2)对地上部分外植体进行根系诱导培养，获得组合苗
获取3cm×3cm×3cm的岩棉块，在岩棉块一面的中间戳一个直径2mm，1.5-2cm深的小孔，将岩棉块置于培养皿上。将4-7ml利用1/4MS basal salt液体培养基重悬的含有待鉴定基因GmNHX1的发根农杆菌k599菌液(OD600＝0.8-1.0)滴加至上述岩棉块中，使岩棉块被完全浸润。将地上部分外植体插入戳出的小孔中，使得斜下30度切断后形成的大豆外植体切面全部插入岩棉块2-2.5cm。
将插有大豆植株地上部分的岩棉块放入洁净保湿盒中过夜保湿，第二天拿下保湿盒上盖，直到豆苗全部出现萎蔫后，加入无菌1/4MS basal salt溶液，盖上保湿盒，直到豆苗恢复正常状态。适当添加无菌的去离子水保持岩棉块湿润。2周后用镊子轻轻撕下岩棉块，除去非切口处的根，获得大豆组合苗。
(3)对完整的组合苗进行盐胁迫筛选后进行耐盐基因性状鉴定
将通过步骤2获得的大豆组合苗转移到含有灭菌后的蛭石及珍珠岩的小花盆中，加入适当地Hoagland营养液。每天用50ml 100mmol/L的NaCl溶液进行盐胁迫处理，连续浇灌1周。1周之后，转化有耐盐基因的组合苗生长良好，而未转化耐盐基因的组合苗出现萎蔫现象。
其中蛭石/珍珠岩＝3：1，小花盆直径10cm，高9cm。
实施例2
(1)大豆籽粒经消毒、培养后获取大豆地上部分外植体
选择当年收获的熟饱满表皮无病变的大豆品种天隆1号的籽粒。将种子平铺于培养皿并将培养皿敞开置于氯气环境中16小时后，将种子连同培养皿敞开置于超净工作台中通风15分钟。将完成消毒的籽粒置于消毒过的珍珠岩中，并浇灌Hoagland营养液，2周之后大豆植株生长至第一对三出复叶完全展开。利用锋利刀片在大豆植株子叶节下方2-3cm处沿斜下30度角度将大豆植株切断，并保留上部分外植体备用。
其中珍珠岩使用前消毒15分钟，消毒温度127℃。
(2)对地上部分外植体进行根系诱导培养，获得组合苗
获取3cm×3cm×3cm的岩棉块，在岩棉块一面的中间戳一个直径2mm，1.5-2cm深的小孔，将岩棉块置于培养皿上。将4-7ml利用1/4MS basal salt液体培养基重悬的含有待鉴定基因GmNHX2的发根农杆菌k599菌液滴(OD600＝0.8-1.0)加至上述的岩棉块中，使岩棉块被完全浸润。将地上部分外植体插入戳出的小孔中，使得斜下30度切断后形成的大豆外植体切面全部插入岩棉块2-2.5cm。
将插有大豆植株地上部分的岩棉块放入洁净保湿盒中过夜保湿，第二天拿下保湿盒上盖，直到豆苗全部出现萎蔫后，加入无菌1/4MS basal salt溶液，盖上保湿盒，豆苗恢复正常状态。适当添加无菌的去离子水保持岩棉块湿润。2周后用镊子轻轻撕下岩棉块，除去非切口处的根，获得大豆组合苗。
(3)对完整的组合苗进行盐胁迫筛选后进行耐盐基因性状鉴定
将通过步骤2获得的大豆组合苗转移到含有灭菌后的蛭石及珍珠岩的小花盆中，加入适当地Hoagland营养液，每天用50ml 100mmol/L的NaCl溶液进行盐胁迫处理，连续浇灌1周。1周后，转化有耐盐基因的组合苗生长良好，而未转化耐盐基因的组合苗出现萎蔫现象。
其中蛭石/珍珠岩＝3：1，小花盆直径10cm，高9cm。
对比例
(1)大豆籽粒经消毒、培养后获取待外源基因转化的外植体
选择当年收获的熟饱满表皮无病变的大豆品种东农47的籽粒。将种子平铺于培养皿并将培养皿敞开置于氯气环境中16小时后，将种子连同培养皿敞开置于超净工作台中通风15分钟。消毒后的种子接种在添加BA0.4mg/L的MSB5培养基中培养5～7d。将得到的无菌苗用无菌刀片切除初生叶和上胚轴，去掉胚根，留大约3～5cm的下胚轴。
MSB5培养基为：1×MS盐+1×B5维生素。
(2)利用农杆菌侵染的方法对大豆外植体进行遗传转化
将含有目的基因的农杆菌在含有相应抗生素的YEP液体培养基中，于28℃摇床180rpm恒温振荡培养12～16h至OD600＝0.8～1.0。将菌液5000rpm离心15min，用液体染菌培养基重悬后(OD600＝0.8-1.0)，将外植体在重悬后的菌液中浸泡20min，取出后吸去外植体表面多余的菌液，置于共培养培养基中遮光培养3d，之后将外植体转到芽诱导培养基中培养14d后转入不添加激素的MSB芽伸长培养基中，培养15d后将外植体上的两片子叶去除，换到新的芽伸长培养基中。
其中，液体染菌培养基为：MSB液体培养基，蔗糖20g/L，AS 100μmol/L；pH 5.8；
共培养基为：MSB固体培养基，BA 3.0mg/L，IBA 0.2mg/L，AS 100μmol/L，蔗糖20g/L，pH 5.8；
芽诱导培养基为：MSB固体培养基，BA 3.0mg/L，IBA 0.2mg/L，KT 0.5mg/L，蔗糖20g/L，pH 5.8；
不添加激素的MSB芽伸长培养基为：MSB固体培养基，蔗糖20g/L，pH 5.8；
芽伸长培养基为：MS固体培养基，头孢霉素300mg/L，蔗糖20mg/L，pH 5.8。
(3)经转化操作后的外植体再生，获得转化植株
每隔14d更换新的芽伸长培养基，4周之后芽伸长到3cm左右，转入添加IBA0.5mg/L的MSB生根培养基中培养至生出2～3条根，将瓶盖打开炼苗2d，小心用镊子取出小苗，温水洗净根部残留琼脂，然后栽于盛有灭菌的土:蛭石:沙子(1:1:1)均匀混合的塑料盆中，保持一定湿度，此时要适当降低培养温度，三周后移栽到温室中。
其中，MSB生根培养基为：MS固体培养基，头孢霉素300mg/L，IBA 0.5mg/L，蔗糖20mg/L，pH 5.8
(4)对完整的组合苗进行盐胁迫筛选后进行耐盐基因性状鉴定
将通过步骤3获得的大豆组合苗转移到含有灭菌后的蛭石及珍珠岩的小花盆中，加入适当地Hoagland营养液，每天用50ml 100mmol/L的NaCl溶液进行盐胁迫处理，连续浇灌1周。1周后，转化有耐盐基因的组合苗生长良好，而未转化耐盐基因的组合苗出现萎蔫现象。
其中蛭石/珍珠岩＝3：1，小花盆直径10cm，高9cm。
上述常规筛选方法，由于需要从大豆籽粒形成外植体，外植体侵染后有需要再生形成完整的植株，因此，整体筛选周期长，不能快速进行耐盐基因的筛选。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例及对比例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。