本发明属于农业用菌剂的开发技术领域，具体涉及一种控释枯草芽孢杆菌菌剂。
背景技术
微生物菌剂的使用大大减少了化肥的用量及减少污染，而且可以通过微生物之间或与植物之间的互作来增强植物的抗病与抗逆能力，这对于提高农作物品质及产量、延长农产品的采收期和自然保鲜期有着重要意义。微生物菌剂使用安全方便，且价格低廉不污染环境，是未来代替化学肥料的一种新兴制剂。
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，是一种内生抗逆孢子的杆状细菌，广泛存在于自然界中如土壤、湖泊、海洋和动植物的体表，自身没有致病性。该菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用，能减少肥料和农药的使用量，是一种较理想的生防微生物，因此，如何能进一步提高其利用效率是目前急需解决的问题之一。
技术实现要素：
本发明提供了一种控释枯草芽孢杆菌菌剂，本发明通过将多巴胺附着在枯草芽孢杆菌的表面，然后在多巴胺表面包覆具环境敏感性的高聚物分子，从而制备出一种可根据环境条件的变化，而自动调节其内包裹的枯草芽孢杆菌的释放量，是一种可提高枯草芽孢杆菌菌剂利用效率的新型智慧菌剂。
本发明的一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌菌剂，所述菌剂包括枯草芽孢杆菌、多巴胺或其盐、高聚物分子。
具体的，还包括下述1)和/或2)：
1)所述高聚物分子包括温敏高聚物分子；具体的，所述高聚物分子包括pnipam聚合物；
2)所述多巴胺或其盐覆盖在枯草芽孢杆菌和/或其芽孢的表面，所述高聚物分子覆盖在所述多巴胺或其盐的表面。
具体的，所述菌剂由下述方法制备而成：
将枯草芽孢杆菌和/或其芽孢于ph值8～8.5的tris-hcl缓冲液中，与盐酸多巴胺一起室温搅拌2h以上，抽滤后，将产物置于反应容器中，加超纯水，通n2，向溶液中加入高聚物分子的单体、交联剂、催化剂，避光继续通n2，室温下搅拌，然后将反应容器转移至冰浴中搅拌，加入引发剂，搅拌后转移至密闭模具中，在室温下聚合24h，将产物粉碎即得；
具体的，按质量计，所述方法中，所述枯草芽孢杆菌和/或其芽孢1-10份、盐酸多巴胺1-10份、高聚物分子的单体10-500份、交联剂0.8-200份；
再具体的，按质量计，所述方法中，所述枯草芽孢杆菌和/或其芽孢10份、盐酸多巴胺1份、高聚物分子的单体12-60份、交联剂1-20份。
本发明的还一个目的是提供一种菌剂的制备方法，所述方法包括：将枯草芽孢杆菌和/或其芽孢于ph值8～8.5的tris-hcl缓冲液中，与盐酸多巴胺一起室温搅拌2h以上，抽滤后，将产物置于反应容器中，加超纯水，通n2，向溶液中加入高聚物分子的单体、交联剂、催化剂，避光继续通n2，室温下搅拌，然后将反应容器转移至冰浴中搅拌，加入引发剂，搅拌后转移至密闭模具中，在室温下聚合24h，将产物粉碎即得。
具体的，所述方法还包括下述1)-3)中所述的至少一种：
1)所述高聚物分子包括温敏高聚物分子；具体的，所述高聚物分子包括pnipam聚合物；
2)按质量计，所述方法中，所述枯草芽孢杆菌和/或其芽孢1-10份、盐酸多巴胺1-10份、高聚物分子的单体10-500份、交联剂0.8-200份；
再具体的，按质量计，所述方法中，所述枯草芽孢杆菌和/或其芽孢10份、盐酸多巴胺1份、高聚物分子的单体12-60份、交联剂1-20份；
3)将枯草芽孢杆菌和/或其芽孢于ph值8～8.5的tris-hcl缓冲液中，与盐酸多巴胺一起室温搅拌2h以上，抽滤后，将产物置于反应容器中，加超纯水，通n2，向溶液中加入单体nipam、交联剂和催化剂，用量分别为每1-5g所述产物加入50ml超纯水、nipam11.3g/100gh2o，交联剂粘土0.8-4g/100gh2o，催化剂temed8μl/100gh2o；避光继续通n2，室温下搅拌15min，然后将反应容器转移至冰浴中搅拌5min，加入引发剂kps，kps用量为2g/100gh2o，搅拌30s后转移至密闭模具中，在室温下聚合24h。
本发明的还一个目的是提供本发明任一所述方法制备得到的菌剂。
本发明的再一个目的是提供本发明任一所述菌剂的应用。
具体的，所述应用包括下述1)-3)中所述的至少一种：
1)作为枯草芽孢杆菌和/或其芽孢的缓释或控释产品；
2)作为有益植物生长的产品；
3)作为土壤微生物生态或营养状况的调节产品；
所述植物包括农作物。
具体的，当所述菌剂中的高聚物分子包括pnipam聚合物时，所述缓释或控释为温度响应机制的缓释或控释；具体的，当温度低于pnipam聚合物的lcst时，所述产品的释放量增加，当温度高于pnipam聚合物的lcst时，所述产品的释放量减少。
本发明的最后一个目的是提供本发明任一所述方法的应用。
具体的，所述应用包括下述1)-3)中所述的至少一种：
1)在制备具有缓释或控释枯草芽孢杆菌和/或其芽孢的产品或其相关产品中的应用；
2)在制备具有有益植物生长的产品或其相关产品中的应用；
3)在制备具有调节土壤微生物生态或营养状况的产品或其相关产品中的应用；
所述植物包括农作物。
具体的，当所述方法中的高聚物分子包括pnipam聚合物时，所述缓释或控释为温度响应机制的缓释或控释；具体的，当温度低于pnipam聚合物的lcst时，所述产品的释放量增加，当温度高于pnipam聚合物的lcst时，所述产品的释放量减少。
本发明提供的一种控释枯草芽孢杆菌菌剂，至少具有以下优点：
(1)本发明提供的控释枯草芽孢杆菌菌剂，能有效释放活菌，从而能改善作物的营养条件和养分供应状况，抑制有害微生物的活动，提高作物的抗病抗逆能力，可持续性的改善土壤肥力状况。
(2)本发明提供的控释枯草芽孢杆菌菌剂，其制备工艺简单、环保，不使用有机溶剂，适合于工业大量生产应用。
(3)在一个具体的实施方式中，本发明利用枯草芽孢杆菌菌剂表面涂覆的温敏pnipam聚合物的lcst在32°附近，当温度低于lcst时，pnipam分子链具有较强的亲水性，表现为伸展的线团结构，容易释放活菌；当温度上升到lcst之上时，pnipam刷子处于坍塌状态，使得多层聚合物涂层的枯草芽孢杆菌菌剂渗透性降低，从而减缓释放速率，以达到根据环境的变化智能调控菌剂性能的目的，提高菌剂的利用效率。
(4)本发明提供的控释枯草芽孢杆菌菌剂，在一个具体的实施方式中，温敏pnipam聚合物可生物降解，避免了肥料的大量施用所带来的环境污染问题，满足生态绿色可持续发展的要求，具有巨大的实际和商业应用价值。
具体实施方式
下述实施例中所使，用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例及其具体说明用于解释和理解本发明，并不构成对本发明的不当限定。
实施例1、温度响应控释枯草芽孢杆菌菌剂的制备
(一)枯草芽孢杆菌表面包裹附着多巴胺
称取1.5gtris置于烧杯中，加入约的900ml去离子水，用6m的hcl将tris-hcl溶液ph调至8～8.5；将枯草芽孢杆菌(含芽孢率50％以上)50g加入上述tris-hcl溶液中，并将溶液定容至1l；加入5g盐酸多巴胺，室温搅拌2h以上，抽滤得表面包裹附着有多巴胺的枯草芽孢杆菌。
(二)温敏高聚物分子材料的包覆
取1-5g上述制备的表面包裹附着有多巴胺的枯草芽孢杆菌，置于100ml的反应容器中，加超纯水50ml。通n20.5h除去其中的溶解氧，向溶液中加入单体nipam、交联剂和催化剂，具体用量分别为nipam11.3g/100gh2o，交联剂粘土0.8-4g/100gh2o，催化剂temed8μl/100gh2o，在锡纸包覆下避光继续通n2，室温下快速搅拌15min。然后将反应容器转移至冰浴中缓慢搅拌5min，加入引发剂kps(kps用量为2g/100gh2o)，搅拌30s后迅速转移至密闭模具中，在室温下聚合24h。产物在超纯水中离心洗涤，除去未反应的单体和杂质。最后将产物粉碎，得到表面包覆温敏高聚物分子的枯草芽孢杆菌，即得温度响应控释枯草芽孢杆菌菌剂。
实施例2、温度响应控释枯草芽孢杆菌菌剂的活菌或芽孢释放实验
取按照实施例1所述方法制备的温度响应枯草芽孢杆菌菌剂18g，平均分为9份，分别于15℃、25℃、35℃的环境中放置10天、1个月和3个月，然后检测不同温度不同放置时间下，温度响应控释枯草芽孢杆菌菌剂的活菌或芽孢释放量。
平板检测法检测活菌或芽孢释放量检测方法：
1)按照放置后的样品与无菌水的质量体积比为1∶10的比例配制成溶液，将所述溶液抽滤过1.2微米滤膜，以滤去未释放活菌的表面包覆温敏高聚物分子的枯草芽孢杆菌菌剂；
2)收集滤液，加入玻璃珠，静置20min，在旋转式摇床上200r/min振荡30min，即得母液菌悬液；
3)用无菌移液管分别吸取5.0ml上述母液菌悬液加入45ml无菌水中，按体积比为1∶10的比例进行系列稀释，分别得到不同稀释倍数的一系列稀释菌悬液；
4)每个样品取3个连续适宜的稀释度，用无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1ml，加至固体琼脂培养基上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度的菌悬液均匀涂于固体琼脂培养基上；每个稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，于37℃的恒温培养箱中培养12-36h；
5)菌落计数和样品中活菌数目的计算：按照国家标准gb20287-2006中的方法进行。
检测结果如表1所示。表1结果表明，按照实施例1所述方法制备得到的温度响应控释枯草芽孢杆菌菌剂可以根据温度的不同，调节其包裹的活菌或芽孢的释放速度，当温度低于lcst32℃时，温度越低，活菌或芽孢的释放量越大；当温度高于lcst32℃时，活菌或芽孢的释放量急剧下降。这一实验结果表明本发明提供的温度响应控释枯草芽孢杆菌菌剂非常适合早稻和冬小麦的施肥。而在高温的夏季，本发明提供的温度响应控释枯草芽孢杆菌菌剂可自动保存其包裹的活菌或芽孢不流失，提高菌剂的利用效率。
此外，同一温度，不同放置时间，样品中活菌或芽孢的释放量，推测应该还受枯草芽孢杆菌本身的繁殖代谢活动及芽孢产率(枯草芽孢杆菌在营养匮乏或其它恶劣环境条件下，菌体内会产芽孢，一个菌产一个芽孢，芽孢在环境条件合适时，又会迅速复活，形成枯草芽孢杆菌)的影响，如果将所述样品置于田地中，活菌的数量应该大于表1所示数量，因为田间环境有利于菌的代谢繁殖。
表1
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。