一种水稻叶片提取物在防治稻瘟病中的应用的制作方法

本发明属于稻瘟病防治领域，具体涉及一种水稻叶片提取物在防治稻瘟病中的应用。

背景技术：

稻瘟病菌是一种能引起水稻病害的丝状子囊真菌。这种病原菌遍布全球所有的粮食产地，平均每年因稻瘟病造成的水稻产量损失足以养活6000万以上的人口。除了水稻，稻瘟病菌还可以侵染小麦、大麦、高粱等禾本科植物，被认为是最重要的植物病原真菌之一。稻瘟菌侵染循环始于分生孢子，从孢子形成的部位通过风或者水滴传播到健康宿主植物组织上。分生孢子着落在寄主植物表面后，在适合的条件下萌发产生芽管，继而芽管又特异性分化成一个球状的侵染结构-附着胞。附着胞进一步分化出坚硬的侵入结构（侵染栓），穿透感病宿主植物角质层后成功入侵和定殖，最后造成侵染部位出现病斑。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种水稻叶片提取物在防治稻瘟病中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种水稻叶片提取物在防治稻瘟病中的应用，所述水稻叶片提取物是将稻瘟菌侵染的抗病品种水稻叶片液氮研磨成细粉，然后取1g，加入1-4ml、80vol%的甲醇溶液，搅拌混合后于4℃孵育12小时，然后采用13000rpm离心10分钟，取上清液过滤，即得。

发明人经研究发现，稻瘟菌侵染的水稻叶片提取物具有抑制稻瘟菌孢子萌发的功能，有望将其用于制备抗稻瘟病菌的新型杀菌剂。

经进一步研究，发明人发现，水稻次生代谢产物bayogenin3-o-cellobioside（月桂素3-o-纤维二糖甙，其结构式为：）仅在接种了稻瘟病菌的水稻代谢产物中出现，且抗病能力越强的水稻中bayogenin3-o-cellobioside积累的量越高，即水稻叶片提取物对稻瘟菌分生孢子萌发的抑制作用可能与其所含次生代谢产物bayogenin3-o-cellobioside的量有关。

附图说明

图1为稻瘟菌侵染的不同品种水稻叶片提取物抑制稻瘟菌分生孢子萌发的情况。

图2为稻瘟菌侵染的不同品种水稻叶片中bayogenin3-o-cellobioside的含量。

图3为bayogenin3-o-cellobioside类似化合物对稻瘟菌分生孢子萌发的影响。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

1.稻瘟菌侵染的水稻叶片提取物对稻瘟菌分生孢子萌发的影响

收集在米糠培养基上生长七天的稻瘟菌分生孢子，用0.02%的吐温溶液配成浓度为1.5-2×10⁵个/ml的分生孢子悬浮液，然后喷雾接种于3-4周龄的感病水稻品种（co39、tp309、lth、npb）和抗病水稻品种（pi-a、pi-b、pi-gm、pi-zt）上。接种后的水稻于25℃避光保湿环境中放置12小时。分别收集各组水稻叶片，用液氮研磨成细粉，然后取1g粉末溶解于4ml80%甲醇中，4℃孵育过夜。混合物采用13000rpm离心10分钟后取上清，上清用0.22μm细菌过滤器过滤。所得到的溶液直接用于冲洗培养皿上的分生孢子，制成孢子悬浮液。然后取20μl孢子悬浮液滴于疏水盖玻片上，26℃黑暗保湿培养，观察附着胞形成情况，结果见图1。

由图1可见，抗病品种（pi-gm，pi-b）的水稻叶片提取物可以明显抑制孢子萌发。

2.水稻代谢组学实验

收集在米糠培养基上生长七天的稻瘟菌分生孢子，用0.02%的吐温溶液配成浓度为1.5-2×10⁵个/ml的分生孢子悬浮液，然后喷雾接种于3-4周龄的感病水稻品种（co39、tp309、lth、npb）和抗病品种（pi-a、pi-b、pi-gm、pi-zt）上，对照组用0.02%的吐温溶液喷洒。接种后的水稻于25℃避光保湿环境中放置。接种12小时后收集各组水稻叶片，用液氮研磨成细粉，然后取25mg粉末置于ep管中，加入8000µl冷冻后的甲醇/水（1：1）的缓和溶液，往ep管中加入两颗小钢珠。将样本放置于tissuelyser中研磨，参数设置为50hz，5分钟。研磨后，取出钢珠，将离心管放置在-20℃冰箱中沉淀2小时，25000g4℃离心15分钟,取出550µl上清于新的ep管中，取50µl上机进行代谢组学分析。代谢组学实验利用超高效液相色谱串联质谱法进行检测分析，液相色谱采用2777cuplc系统(waters，uk)，质谱采用xevog2-xsqtof系统（waters，uk）。结果见图2。

由图2可见，相比于其他水稻品种，抗病品种（pi-gm，pi-b）的水稻叶片中大量积累次生代谢产物bayogenin3-o-cellobioside，由此推测，水稻叶片提取物对稻瘟菌分生孢子萌发的抑制作用可能与其所含次生代谢产物bayogenin3-o-cellobioside的量有关。

为进一步证实bayogenin3-o-cellobioside对稻瘟菌分生孢子萌发的影响，采用bayogenin3-o-cellobioside类似物bayogenin-3-o-β-d-glucopyranoside（贝萼皂苷元3-o-beta-d-吡喃葡萄糖）、其他皂苷类化合物hederagenin（常春藤皂苷元）和oleanolicacid（齐墩果酸）分别处理稻瘟病菌分生孢子，结果见图3。

由图3可见，高浓度（10nmol/l及以上）的bayogenin-3-o-β-d-glucopyranoside（bayogenin3-o-cellobioside类似物）可以有效抑制稻瘟病菌分生孢子萌发，而采用其他皂苷类化合物（hederagenin和oleanolicacid）均无法抑制稻瘟菌孢子的萌发。由此进一步证明，水稻叶片提取物对稻瘟菌分生孢子萌发的抑制作用可能与其所含次生代谢产物bayogenin3-o-cellobioside的量有关。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种水稻叶片提取物在防治稻瘟病中的应用，所述水稻叶片提取物是以稻瘟菌侵染的水稻叶片为原料，将其经液氮研磨后采用甲醇溶液提取制得，该水稻叶片提取物具有抑制稻瘟菌孢子萌发的功能，有望用于制备抗稻瘟病菌的新型杀菌剂，且经研究发现，其中月桂素3‑O‑纤维二糖甙（Bayogenin 3‑O‑cellobioside）的含量与水稻抗病能力呈正比。

技术研发人员：王宗华;贾斯蒂斯;林莉莉;瓦希德·阿卜杜勒;萨米·阿利尤;鲁国东;林娅红;谢薇
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：2018.10.10
技术公布日：2018.12.21