PirB基因敲入的小鼠动物模型及其构建方法与流程

技术领域：

本发明属于遗传学和生物技术领域，具体涉及pirb基因敲入的小鼠动物模型，还涉及上述小鼠动物模型的构建方法。

背景技术：

鼠源成对免疫球蛋白样受体b(pairedimmunoglobulin-likereceptorb，pirb)，是人类免疫球蛋白样受体b2(humanleukocyteimmunoglobulin(ig)-likereceptorb2，lilrb2)的同源基因，pirb基因(ncbireferencesequence：nm_011095.2)位于小鼠的7号染色体近端，总大小为8.97kb，编码841个氨基酸，目前鉴定出15个外显子，外显子1起始密码为atg，外显子15的终止密码子是tga(转录本：pirb-201ensmust00000078451.6)。pirb蛋白属于i型跨膜糖蛋白，包含由六个免疫球蛋白样结构域(domain，d)组成(d1-d6)的胞外段，一个疏水的跨膜段，三个免疫受体酪氨酸依赖的抑制序列(immunoreceptortyrosinebasedinhibitorymotifs，itims)和一个itims样序列组成的胞内段。理论上讲，pirb的分子量约为92kd，但是western-blot分析中，pirb经常位于105kd处，因为pirb是糖蛋白。以往研究发现，pirb在免疫系统和中枢调节中均发挥重要作用。

在免疫系统中，pirb在许多造血细胞都有表达，包括b细胞、肥大细胞、巨噬细胞、粒细胞和树突细胞，但是在胸腺细胞、成熟的t细胞和自然杀伤细胞不表达，另外pirb在髓细胞和b细胞的表达随细胞分化和激活增加。在免疫系统，pirb作为主要组织相容性复合物1(classimajorhistocompatibilitycomplex，mhc1)的受体，广泛参与免疫调节，包括中性粒细胞和巨噬细胞整合素通路、细胞毒性t淋巴细胞激活、b淋巴细胞激活和体液—细胞免疫应答等。pirb的前两个细胞外免疫球蛋白结构域(d1-d2)介导mhci和pirb的结合。

在中枢神经系统(centralnervoussystem，cns)，pirb在许多脑区包括皮层、海马、小脑和嗅球都有表达，但在成年脊髓不表达。在细胞层面，pirb不仅表达于神经元，也表达于星形胶质细胞。在许多病理条件下，如脑外伤、中风和cns感染，pirb的mrna和蛋白表达水平显著增加。在cns，pirb是髓鞘抑制因子nogo-a、mag、omgp的受体，参与神经元突起芽发和生长锥塌陷，抑制神经元轴突再生和突触可塑性。pirb的细胞外免疫球蛋白结构域(d3-d6)介导了pirb与nogoa的结合。近年来关于阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)研究还发现，pirb是aβ42寡聚体的高亲和力受体，亲和力达到纳摩尔水平。pirb的前两个细胞外免疫球蛋白结构域(d1-d2)介导了aβ42寡聚体和pirb的相互作用，导致丝切蛋白(cofilin)信号通路增强。免疫组织化学染色结果发现，pirb在轴突生长锥表达，位于富含肌动蛋白的前缘和synapsin免疫阳性的囊泡中，在神经元突起的表达呈点状分布。文献表明，pirb表达随年龄增加，特别是在老龄认知损伤的小鼠海马中，pirb能够抑制轴突再生和突触可塑性。研究表明小鼠aβ寡聚体对海马长时程增强的破坏作用需要pirb的参与，在ad转基因模型中，pirb不仅参与成年小鼠记忆缺失，而且介导幼年小鼠视皮层突触可塑性的丢失。这些研究提示我们，pirb参与突触可塑性，抑制pirb可能对ad起到治疗效应。但是在cns，pirb的功能和下游抑制性信号通路仍然未被阐明，因此迫切需要pirb的细胞和动物模型。

目前对于pirb基因功能的研究，多采用可溶性的pirb的胞外段(pirbextracellularpeptide，pep)和抑制剂，或者采用慢病毒转染。前者受到是否能够透过血脑屏障和抑制剂效率的影响，后者慢病毒转染在原代细胞和在体的转染效率比较低，使研究pirb的功能受到极大的限制。为解决这些问题，我们通过crispr/cas9技术建立了pirb基因敲入小鼠，将pirb基因敲入c57bl/6j的rosa26位点，为研究pirb在免疫系统或者神经系统的作用和机制提供了很好的工具。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供pirb基因敲入的小鼠动物模型，该模型能够帮助我们研究pirb基因在免疫系统和神经系统的功能以及下游的调节机制。

本发明的另一目的在于提供上述小鼠动物模型的构建方法。

本发明所采用的第一种技术方案是：pirb基因敲入的小鼠动物模型，包括确定pirb基因的待敲入的特异性靶位点grna1和grna2，将pirb基因敲入c57bl/6j小鼠的rosa26基因的内含子1内，所述grna1的基因序列如seqidno.1所示，grna2的基因序列如seqidno.2所示。

本发明所采用的第二种技术方案为：pirb基因敲入的小鼠动物模型的构建方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、基于crispr/cas9技术构建针对c57bl/6j小鼠rosa26基因的特异性grna1和grna2，grna1的基因序列如seqidno.1所示，grna2的基因序列如seqidno.2所示；

步骤2、构建“cagpromoter-loxp-stop-loxp-kozak-mousepirbcds-polya”基因盒打靶载体，将打靶载体进行线性化处理；

步骤3、步骤2中将含有loxp位点打靶载体、步骤1中有活性的grna1和grna2与cas9蛋白共同注射进入代孕小鼠受精卵中，获得f0代小鼠；

步骤4、将步骤3中性成熟的阳性f0小鼠分别与野生型鼠交配繁一代，获得f1代杂合子小鼠，通过pcr、测序和southern杂交确定动物基因型；

步骤5、将步骤4获得的f1代杂合子小鼠近交获得f2代纯合子小鼠，即为本发明构建的一种pirb基因敲入的小鼠动物模型。

本发明所采用第二种技术方案的特点还在于，

步骤1中得到grna1和grna2后分别与trancrrna在25℃孵育10min形成二级结构。

步骤3中grna1、grna2的浓度均为2～10pmol/ul，cas9蛋白的注射浓度为30～100ng/μl。

步骤4中southern杂交采用bamhi和avrii核酸内切酶切割f1代杂合子小鼠的dna。

本发明的有益效果是：本发明提供了pirb基因敲入的小鼠动物模型及其构建方法，本发明的小鼠动物模型对于pirb基因功能的研究和在体验证提供了良好的基础。分离自pirb基因敲入小鼠的细胞还可以用于研究pirb发挥调节作用的下游机制。通过pirb敲入动物模型与不同类型cre小鼠的杂交，可以用于研究ad不同器官或不同细胞类型pirb的调节作用。

附图说明

图1为本发明pirb基因敲入的小鼠插入pirb基因cds和loxp位点的打靶质粒载体的构建图；

图2为本发明pirb基因敲入的小鼠模型的构建方法的流程图；

图3为本发明f1代pirb敲入的小鼠的基因型pcr结果鉴定电泳图；

图4为本发明f1代pirb敲入的小鼠验证pirb基因敲入效果的测序峰图；

图5为本发明f1代pirb基因敲入的小鼠进行southern鉴定的方法示意图；

图6为本发明f1代pirb基因敲入的小鼠进行southern鉴定的结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对发明作进一步阐述。

本发明构建了pirb基因敲入的小鼠动物模型，将pirb基因敲入c57bl/6j小鼠的rosa26基因的内含子1内。具体来说，构建一个cagpromoter-loxp-stop-loxp-kozak-mousepirbcds-polya的基因盒，将其克隆进入rosa26基因的内含子1中。

rosa26基因(ncbireferencesequence：nr_011095.2)位于小鼠的七号染色体。

本发明pirb基因敲入的小鼠动物模型的构建方法，具体按照以下步骤具体实施:

步骤1、根据小鼠rosa26基因(genebank：nr_027008.1))序列，利用cas-desigher软件在1号内含子设计grna靶序列，并搜索小鼠dbm-db基因组数据库基因，采用crispr脱靶效应软件cas-offinder检测潜在的脱靶位点：最终选取两个grna，grna1的基因序列如seqidno.1所示，grna2的基因序列如seqidno.2所示：

seqidno.1:ggcaggcttaaaggctaacctgg

seqidno.2:ctccagtctttctagaagatggg

将grna1和grna2分别与trancrrna在25℃孵育10min形成二级结构；

步骤2、利用c57bl/6小鼠文库bac克隆，通过pcr扩增获得pirb基因cds的同源臂，采用in-fusion方法构建含有cagpromoter-loxp-stop-loxp-kozak-mousepirbcds-polya的基因盒的质粒打靶载体，通过酶切、pcr及测序对打靶质粒载体进行验证，图1为构建好的pirb基因打靶载体的示意图。

步骤3、pmsg处理c57bl/6雌性小鼠(6周龄，平均体重20g)，46h后注射hcg，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射，将步骤1的grna1、grna2、cas9蛋白以及线性化后的打靶载体一起注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即f0代小鼠。

上述步骤中grna1、grna2的浓度均为2～10pmol/ul，cas9蛋白的注射浓度为30～100ng/μl，cas9蛋白购自newenglandbiolabs，货号为m0386m。

步骤4、提取f0代小鼠尾部dna，pcr扩增产物测序，鉴定是否为嵌合体。

本发明用于f0代小鼠pirb基因pcr鉴定的特异性引物如下：

pcrprimers1(annealingtemperature60.0℃):

5’armforwardprimer(f1):

5’-tacgccacagggagtccaagaatg-3’

5’kireverseprimer(r1):

5’-gatggggagagtgaagcagaacg-3’

pcrprimers2(annealingtemperature60.0℃):

3’kiforwardprimer(f2):

5’-ctgctgtccattccttattccatag-3’

3’armreverseprimer(r2):

5’-ctggaaatcaggctgcaaatctc-3’。

primers1对应的扩增产物大小为2.7kb，primers2对应的扩增产物为2.5kb。

用于f0代小鼠测序的引物如下：

sequencingprimerforpcrproduct1:

5’sequenceprimer(f3):

5’-cacttgctctcccaaagtcgctc-3’

sequencingprimerforpcrproduct2:

3’sequenceprimer(r3):5’-atactccgaggcggatcacaa-3’

步骤4、鉴定为pirb基因敲入的f0代雄性小鼠7周龄、雌性小鼠6周龄分别与野生型异性小鼠交配获得f1代杂合子小鼠，图2为本发明f1代杂合子小鼠pirb基因敲除小鼠的流程图，小鼠出生后20天进行pcr鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞。

(1)通过pcr方法对获得的f1代小鼠进行基因型的鉴定：

(a)dna的提取：

方法1：采用takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkit(ver.5.0_codeno.9765)来获得高纯度的基因组dna。

步骤a.每只小鼠剪下一段尾巴(2～5mm)，放入离心管中，加入180μlbuffergl，20μl蛋白激酶k和10μlrnasea。

步骤b.将步骤a离心管内于56℃孵育过夜。

步骤c.过夜后12000rpm离心2min去除杂质。

步骤d.加入200μlbuffergb和200μl无水乙醇，充分混匀。

步骤e.将吸附柱放在收集管上，将步骤d得到的样品加到吸附柱里，12000rpm离心2min，弃掉收集管中液体。

步骤f.弃去液体后在吸附柱中加入500μlbufferwa，12000rpm离心1min，弃掉收集管中液体。

步骤g.在收集管中加入700μlbufferwb，12000rpm离心1min。弃掉收集管中液体。

注意：bufferwb需要与100％乙醇预混，沿管壁加入bufferwb冲走残余的盐。

步骤h.重复步骤g一次。

步骤i.将步骤h的吸附柱放入收集管，12000rpm离心2min。

步骤j.吸附柱放到一个新的1.5ml的离心管，在吸附柱膜中央加入50～200μl灭菌水或者洗脱液，停留5min。(将无菌水或者洗脱液加热到65℃能够增加洗脱的得率)。

步骤i.基因组dna定量，洗脱的基因组dna可以通过电泳鉴定。

方法2：一种低成本基因组dna的粗提方法：

步骤a.每只小鼠剪下一段尾巴(2-5mm)，放入离心管中，加入100μl尾部消化缓冲液，注意不要剪尾太长；

步骤b.将离心管及其内容物于56℃孵育过夜；

步骤c.过夜后将离心管于98℃孵育13min，使蛋白酶k失活；

步骤d.在微型离心机以最大转速旋转15min，上清直接用于pcr体系(每50μlpcr体系加入上清2μl)。

尾消化缓冲液成分：

50mmkcl

10mmtris-hcl(ph9.0)

0.1％tritonx-100

0.4mg/mlproteinasek

(b)长链pcr反应：

长链引物：

pcrprimers1(annealingtemperature60.0℃):扩增片段：2.7kb

5’armforwardprimer(f1):

5’-tacgccacagggagtccaagaatg-3’

5’kireverseprimer(r1):

5’-gatggggagagtgaagcagaacg-3’

pcrprimers2(annealingtemperature60.0℃):扩增片段：2.5kb

3’kiforwardprimer(f2):

5’-ctgctgtccattccttattccatag-3’

3’armreverseprimer(r2):

5’-ctggaaatcaggctgcaaatctc-3’

pirb基因敲除型有上述两条扩增片段，野生型等位基因没有扩增产物。

pcrmix：

反应条件：

pcr扩增产物的电泳鉴定结果如图3所示，从图3中可以看出，6、8、9号为pirb基因敲入小鼠在2.7kb、2.5kb有特异性扩增产物，wt小鼠pcr产物没有这两个扩增产物。

(c)短链pcr反应，引物如下：

primers(annealingtemperature60.0℃):

forwardprimer(f4):5’-aacaatcaggctgccgaatctg-3’

reverseprimer(r4):5’-ctttattagccagaagtcagatgc-3’

expectedpcrproduct:

targetedallele:344bp

pirb基因敲入型小鼠能够扩增出344bp的产物，而野生型没有。

pcr体系：

反应条件：

(2)f1代小鼠测序：

通过pcr扩增后测序鉴定小鼠基因型，如图4所示，为6号pirb基因敲入小鼠测序峰图，pcr所用引物如下：

sequencingprimerforpcrproduct1：

5’sequenceprimer(f3):

5’-cacttgctctcccaaagtcgctc-3’

sequencingprimerforpcrproduct2:

3’sequenceprimer(r3):

5’-atactccgaggcggatcacaa-3’

(3)southern杂交检测f1代小鼠基因型：

采用bamhi和avrii核酸内切酶切割dna分子，切割示意图如图5。具体的southern杂交检测过程如下：

步骤a、提取f1代小鼠尾部dna；

步骤b、制备探针，通过pcr方法将dig-dutp渗入到步骤a的dna分子中；

f1代小鼠southern印记的5’探针引物如下：

primersfor5’probe:

5’probeforwardprimer:

5’-aaacgtggagtaggcaatacccagg-3’

5’probereverseprimer:

5’-aaagaagggtcacctcagtctccct-3’

primersfor3’probe:

3’probeforwardprimer:

5’-ttctgggcaggcttaaaggctaac-3’

3’probereverseprimer:

5’-aggagcgggagaaatggatatgaag-3’

southern印记的目标片段大小如下：

5’probe-bamhi:5.83kb-wt,4.80kb-mt

3’probe-avrii:5.27kb-wt,11.12kb-mt。

步骤c、采用限制性内切酶bamhi和avrii对dna进行切割；琼脂糖凝胶电泳分离dna；

步骤d、将dna转到尼龙膜上；

步骤e、探针变性后，与dna分子进行杂交，nbt/bcip化学显色法显色，拍照观察。southern杂交结果如图6所示，可以看到：6、8、9号pirb基因敲除小鼠如果被bamhi切割，在5.83kb和3.56kb有两个片段，wt小鼠只在5.83kb处有一个切割片段，如果被avrii切割，pirb基因敲除小鼠在11.12kb和5.27kb有两个片段，wt小鼠只在5.27kb处有一个切割片段。

步骤6、将f1代杂合子小鼠近交获得f2代纯合子pirb基因敲入小鼠，即为本发明所述小鼠pirb基因敲入的动物模型。

将本发明获得的动物模型f2代纯合子小鼠与同品系小鼠组织/细胞特异性cre表达的小鼠杂交，获得f3代小鼠，可以实现在不同组织或者细胞类型中敲入pirb基因。

对f3代小鼠进行基因型的鉴定：含有无(pirb-cwt)、一个(pirb-chet)或者两个(pirb-cki)pirb基因敲入的小鼠，pirb基因敲入到特异性组织或细胞中。其中pirb-cwt小鼠表达cre，但不含有loxp-pirb等位基因，pirb-chetandpirb-cki小鼠表达cre并分别含有一个或者两个loxp-pirb等位基因。

其中f3代杂交小鼠纯合子/杂合子鉴定所用的pcr引物如下：

f3:5’-cacttgctctcccaaagtcgctc-3’

r3:5’-atactccgaggcggatcacaa-3’

f5:5’-gcatctgacttctggctaataaag-3’

homozygotes:644bp

heterozygotes:644bp/453bp

wildtypeallele:453bp

组织特异性的基因敲入也可以通过加入另一对引物，用pcr来验证：

pcrforconstitutivekiallele:

f6:5’-ggcaacgtgctggttattgtg-3’

r6:5’-ggctgtactctgaggataggcttag-3’

f7:5’-agatctgcaagctaattcctgc-3’

withcki:1180bp/215bp

constitutivekiallele:303bp

注意：如果dna的样本不够纯，或者pcr的延伸时间不够长，可能扩增不出来1180bp的产物。

cre阳性pcr鉴定所需的引物如下:

forward:5’-gaacgcactgatttcgacca-3’

reverse:5’-gctaaccagcgttttcgttc-3’

creamplicon:204bp。

序列表

<110>西安医学院

<120>pirb基因敲入的小鼠动物模型及其构建方法

<130>2019

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggcaggcttaaaggctaacctgg23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctccagtctttctagaagatggg23