一种白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，尤其是一种白黄链霉菌（Streptomyces albofIavus)在番前灰霉病害防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 灰霉病是一种世界性的真菌病害，灰霉病原菌寄主范围广、繁殖快、遗传变异大、 容易产生抗药性，可侵染番茄、葡萄、黄瓜、草莓等多种作物的叶片、果实及果柄等部位。灰 霉病的危害是欧洲、亚洲、美洲、地中海沿岸等国家面临的一个普遍性问题。番茄灰霉病是 番前生产中影响番前产量和质量的主要病害之一。目前，主要利用多菌灵、喃霉胺和腐霉利 等化学农药防治番茄灰霉病。但化学药剂的长期使用容易造成环境污染、残毒积累，甚至危 及人畜健康。生物防治由于具有高效、广谱、对人畜安全及与生态环境兼容等特点，越来越 受到人们的关注和重视。
[0003] 生物防治，即在各种条件下或者利用各种措施，通过其它生物的自然控制作用，降 低植物病原物的生存和活动能力从而达到减轻病害发生和危害的目的的病害控制策略。微 生物由于易于大量培养，产生的代谢产物丰富，抑菌作用强，在植物病害的生物防治方面具 有很大的商业价值。目前，国内外已经报道了许多能控制番茄生长及采后灰霉病害的拮抗 细菌、真菌、放线菌以及商品化的生防制剂。
[0004] 链霉菌的分类地位为细菌域，放线杆菌纲，放线菌亚纲，放线菌目，链霉菌科，链霉 菌属。链霉菌主要分布在土壤中，种类繁多，产生的次级代谢产物结构复杂，是一类具有较 大开发潜力的微生物资源。链霉菌作为抗生素等一些价值较高的生理活性物质的产生菌， 在医药、农业等多方面有着广泛应用，它所产生的抗生素不仅能有效地防治人类和牲畜的 传染性疾病，在农业病害的生物防治方面也有重要应用。筛选拮抗链霉菌用以防治番茄灰 霉病，是利用自然间天然存在的微生物之间的拮抗效应进行的生物防治措施，不易产生抗 性，安全性高，符合我国农业和环境可持续发展的要求，是解决番茄灰霉病害发生和蔓延的 重要途径之一。
[0005] 通过检索，发现如下两篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
[0006] 1. 一株微白黄链霉菌及其在防治黄瓜霜霉病方面的应用（CN103468620A)，公开 了一株微白黄链霉菌及其在防治黄瓜霜霉病方面的应用，属于生物防治植物病害领域。该 菌株为微白黄链霉菌（Streptomycesalbidoflavus)ACT033,保藏编号CGMCCNo. 8125。本 发明还公开了一种采用该新的微白黄链霉菌菌株ACT033制备的能够高效防治黄瓜霜霉病 的生物防治制剂及其制备方法。实验表明，本发明的微白黄链霉菌菌株ACT033具有生长速 度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好 的应用前景。由该微白黄链霉菌菌株ACT033制备的生物防治制剂，不仅能够防治黄瓜霜霉 病，还能有效提高作物产量。
[0007] 2.具有新代谢特性的微白黄链霉菌及其在生物降解中的应用（CN101250491)，本 发明分离筛选出一株具有新代谢特性的微白黄链霉菌。本发明的优点是微白黄链霉菌通过 部分还原途径降解硝基苯，并矿化降解过程中的副产物吡啶甲酸，从而实现硝基苯的彻底 降解，解决了硝基苯部分还原降解中的瓶颈；微白黄链霉菌能够在高盐度以及多种有机物 质共存的条件下有效降解硝基苯；微白黄链霉菌能够以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源进行生 长，吡啶甲酸最终被矿化为无害的二氧化碳和水；微白黄链霉菌能够作为生物强化制剂应 用于盐度高、成分复杂的硝基苯废水和吡啶甲酸废水的生物治理中。
[0008] 通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种长期使用不会造成环境污 染、残毒积累、不会危及人畜健康、具有较强的抑制效果的白黄链霉菌在番茄灰霉病害防治 中的应用，提供了一种防治番茄灰霉病的新菌株和新方法。
[0010] 本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
[0011] -种白黄链霉菌在番前灰霉病防治中的应用，所述白黄链霉菌（Streptomyces alboflavus)为白黄链霉菌TD-I，该白黄链霉菌TD-I保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 4666,所述白黄链霉菌TD-I的活菌体、发酵液、 麦麸培养物、麦麸培养物的固态菌剂或麦麸培养物产生的挥发性物质（VOCs)在番茄灰霉 病防治中的应用。
[0012] 而且，所述白黄链霉菌TD-I的发酵液的制备步骤如下：
[0013] ⑴菌种的活化培养：
[0014] 将分离保存的白黄链霉菌TD-I菌株转接到PDA固体培养基上，30°C条件下培养 5-6d，保存备用；
[0015] ⑵菌株ID-I孢子悬浮液的制备：
[0016] 取PDA平板上活化的白黄链霉菌TD-I，用无菌水洗下平板表面的孢子，配成孢子 悬浮液，并调整孢子浓度为1. 〇XIO6个/mL;
[0017] ⑶菌株TD-1种子培养液的制备：
[0018] 种子液培养基为每1000 mL水中含有可溶性淀粉，20.Og;黄豆粉，10.Og;KN03， I.Og;K2HP04,0. 5g;NaCl，0. 5g;MgS04.7H20,0. 5g;FeS04.7H20,0.Olg，每 250mL三角瓶装培 养基IOOmL;配制后121°C灭菌20min，待冷却后在无菌条件下按1%的接种量将TD-I孢子 悬浮液接种于培养基内，30°C，180r/min摇床培养48h，得到菌株TD-I种子液；
[0019] ⑷TD-I菌株发酵液的制备：
[0020]TD-I菌株发酵培养基的配制与⑶中种子液培养基配方一致，121°C灭菌20min，待 冷却后在无菌条件下按10%的比例接种TD-I种子液，30°C、180r/min摇床培养6d，5000r/ min离心15min，取上清液备用，即得可用于对灰霉菌抑菌的白黄链霉菌TD-I的发酵液。
[0021] 而且，所述白黄链霉菌TD-I的麦麸培养物的制备步骤如下：
[0022] 称取20_30g的干燥麦麸，按照料水比的质量比为1:1的比例添加蒸馏水，121°C灭 菌20min，冷却后按20%的比例接种链霉菌TD-I的种子培养液，在30°C条件下培养8d，即 得可用于对灰霉菌抑菌的白黄链霉菌TD-I的麦麸培养物。
[0023] 而且，所述白黄链霉菌TD-I麦麸培养物的固态菌剂的制备步骤如下：
[0024]而且，称取20_30g的无菌麦麸，按20%的接种量，接种链霉菌TD-I种子液，30°C发 酵2d，待菌种适应生长环境后，将发酵物置于30°C烘箱中干燥24h，再按2% (mL/g)的比例 添加司盘60:吐温80(1:1)乳化剂到干燥后的固态发酵物中，分装于自封袋中，4°C条件下 保存两个月后，即得白黄链霉菌TD-I麦麸培养物的固态菌剂。
[0025] 而且，所述白黄链霉菌TD-I的麦麸培养物产生的挥发性物质在番茄灰霉病防治 中的应用的检测方法的步骤如下：
[0026] ⑴抑菌活性测定方法
[0027] 采用双皿对扣法测定挥发性物质的抑菌活性，根据测量得到的菌落直径，用以下 公式计算挥发性抑菌物质的抑菌率；
[0028] 抑菌率=[(空白组菌落直径一实验组菌落直径）/空白组菌落直径]X100%
[0029] ⑵挥发性物质对菌丝生长和产孢能力的影响
[0030] 取发酵8d的TD-I麦麸培养物，置于直径90mm的皿底，取活化好的灰霉孢菌菌饼， 直径6mm，接种于另一PDA皿底中央，两皿对扣，封□膜密封，25°C培养，以加入相应质量的 无菌麦麸作为空白对照，每个处理设3个平行，重复3次，5d后，采用十字交叉法测量菌落直 径，按上述公式计算抑菌率，用血球计数板计数各组灰霉病菌的产孢量；
[0031] ⑶挥发性物质对灰霉病菌细胞膜通透性的影响
[0032] 双层平皿培养如步骤⑵所述，下层皿底为发酵8d的TD-I麦麸培养物，上层皿底 倒入PDA培养基，冷却后平铺灭菌玻璃纸，I. 5XI. 5cm2,将灰霉病菌孢子悬浮液浓度调整至 0. 5 - 5X106CFU/mL，取0. 5mL均匀涂布于玻璃纸上，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白 对照，封口膜密封，25 °C培养，分别于12h、24h、36h、48h和60h时取出，5mL无菌水洗下菌体， 离心，取上清，分光光度计测定OD26tl值；每个样品做3次平行，重复3次；
[0033] ⑷挥发性物质对灰霉病菌细胞形态的影响
[0034] 挑取培养5d的菌落边缘菌丝，在生物显微镜下观察菌丝形态及变化；从PDA培养 基上取大小为3-5mm3灰霉病菌菌块，用扫描电子显微镜观察挥发性物质对菌丝微观形态的 影响；
[0035] (5)挥发性物质的对番茄果实上灰霉病菌的防治
[0036] 取大小一致的番前果实，每个果实用打孔器打一直径6mm的伤口，接种浓度为 0. 5 - 5XIO6CFUAiL的灰霉孢菌孢子悬浮液IyL，将果实放入带隔板保鲜盒，盒底部放入 20gID-I麦麸培养物，放少量无菌水保湿，保鲜膜封住保鲜盒口，以加入相应质量的无菌麦 麸作为空白对照，30°C培养4d后观察灰霉病菌对番茄果实的侵染情况；
[0037] (6)挥发性物质的GC/MS分析鉴定
[0038] 取样品于顶空瓶中，45°C水浴30min，用经老化处理的DVB/CAR/PDMS固相微萃