表达hlai类的非人动物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表达HLA I类的非人动物、其制造方法及其使用等。更详细而言， 本发明涉及一种HLA I类基因敲入非人动物或非人细胞、它们的衍生物、及它们的使用方 法，其中编码含有从N末端侧依次连接有02微球蛋白、HLA I类的al及a2区域以及非人动物 MHC I类的a3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因在该非人动物的02微球蛋白基 因的转录调控区的控制下表达。
【背景技术】
[0002] 主要组织相容性抗原复合物(MHC)通过呈递源自癌或病毒的抗原肽，在T细胞的免 疫应答诱导引起的生物体防御反应中发挥重要的作用。MHC被分类为I类和II类两种，其中I 类在除生殖细胞和红细胞等之外的所有体细胞中表达。MHC I类由a链和的连构成，其中，a链 由参与接纳抗原肽的凹槽的形成的al ? a2区域及参与与在细胞毒性T细胞(CTL)表面表达 的辅助受体CD8分子的结合的a3区域构成。另一方面，MHC I类的M连由02微球蛋白基因编码 (非专利文献1)。
[0003] 已知细胞毒性T细胞(CTL)通过经由T细胞受体识别存在于抗原呈递细胞(APC)表 面的MHC I类分子和抗原肽的复合体而被活化，特异性地杀伤表达相同复合体的癌细胞或 病毒感染细胞。利用这种细胞性免疫机制，进行用于癌症免疫治疗或传染病治疗的疫苗开 发。
[0004] 由于作为实验动物所通用的小鼠的MHC I类(H-2I类)与人的MHC I类(HLA I类)不 同，因此，不能使用小鼠作为人类疫苗开发的体内评价模型。因此，通过将含有启动子区域 的人HLA基因、或在小鼠H2启动子区域的下游插入HLA基因的重组基因注射于小鼠受精卵 中，制作表达人HLA I类分子的各种各样的转基因小鼠（非专利文献2、3)。但是，在这些转基 因小鼠中，由于通过小鼠⑶8的人HLA I类的a3区域的识别不充分，因此，HLA限制性的CTL诱 导是有限的。因此，制作了将融合有HLA I类的al/a2和小鼠H-2I类的a3的嵌合基因插入于 SV40启动子的下游的转基因小鼠（非专利文献4)，首次能够在体内评价HLA限制性的CTL诱 导。
[0005] 但是，这些转基因小鼠中表达内源性的小鼠H-21类，在小鼠CTL识别抗原时优选使 用H-2I类分子，因此，HLA I类限制性的CTL诱导是不完整的。报道为了解决该问题，将小鼠 H-2I类a分子(H-2Kb及H-2Db)的双敲除小鼠和HLA I类嵌合基因转基因小鼠交配而制作复 合型突变小鼠，改善了HLA I类限制性的CTL诱导(非专利文献5)。
[0006] 但是，报道由于构成MHC I类的0链的02微球蛋白基因在MHC I类分子的功能中是 必须的，因此，在破坏了02微球蛋白基因的小鼠中，小鼠MHC I类的功能丧失(非专利文献6、 7)。另外，已知用由15个氨基酸构成的肽接头连接02微球蛋白的C末端和MHC I类的N末端的 单链融合基因在细胞内正常工作(非专利文献8)。
[0007] 因此，制作了将融合有02微球蛋白、HLA I类的al/a2结构域及小鼠H-2I类的a3结 构域的人工MHC I类基因插入于HLA I类基因启动子的下游的转基因小鼠，与拟微球蛋白基 因敲除小鼠交配，由此制作复合型突变小鼠（非专利文献9)。在这些小鼠中，H-2I类的表达 几乎完全消失，观察到HLA I类限制性的CTL诱导反应，因此，认为是目前最优异的MHC I类 人源化小鼠。
[0008] 近年来，报道将作为严重免疫缺陷动物的N0D/SCID/gamma-c-null(N0G)小鼠进一 步与上述的MHC I类人源化小鼠交配，并通过将人血干细胞移入至得到的多重突变型小鼠 中，可重建具有完全HLA限制性T细胞的人适应性免疫系统(非专利文献10)。因此，认为通过 上述的MHC I类人源化小鼠与其它突变系统的交配，进而在制作优异的人免疫系统模型动 物时也是有用的。
[0009] 但是，认为迄今为止所制作的人工MHC I类基因转基因小鼠中的转基因的表达受 拷贝数、基因组上的插入位点、或者表观遗传修饰等各种因素的影响。因此，必需从所制作 的转基因系统中选择显示最佳表达量的系统。另外，基于相同的理由，在表达不同的MHC I 类的转基因小鼠系统间比较CTL诱导能力也是困难的。
[0010]进而，为了提高人MHC I类限制性的CTL诱导，所选择的系统和02微球蛋白基因敲 除小鼠的交配为必需的，因此，在选择显示最佳表达量的转基因小鼠系统之后，还需要更多 的时间和精力。
[0011] 根据这样的理由，虽然MHC I类人源化小鼠是非常有用的，但是，到目前为止，仅制 作了 A1、A2、A24、A11、B44、B7等有限的转基因系统，通过拟微球蛋白基因敲除小鼠的交配得 到的复合型突变小鼠的制备例进一步受限定。
[0012] 现有技术文献
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献 1:Human Vaccines 4:6,400-409;November/December 2008
[0015] 非专利文献2 :Eur J Immunol .1989Sep; 19(9): 1575-83
[0016] 非专利文献3: J Immunol .1989Feb 15; 142(4): 1366-71
[0017] 非专利文献4:J Exp Med. 1991Apr 1; 173(4): 1007-15
[0018] 非专利文献5: J Immunol .1999,163:2555-60
[0019] 非专利文献 6 :Nature.l990Apr 19; 344(6268): 742-6
[0020] 非专利文献 7: Science，Vol.248(8June 1990): 1227-30
[0021] 非专利文献8:Proc Natl Acad Sci U S A. 1992November 15;89(22): 10658-62
[0022] 非专利文献9:J Exp Med.l997Jun 16;185(12):2043-51
[0023] 非专利文献 10:Proc Natl Acad Sci U S A.2010Jul 20; 107(29): 13022-7
【发明内容】
[0024] 发明所要解决的课题
[0025] 本发明的课题在于，提供一种解决了如上所述缺点的表达HLA I类的非人动物、及 其制作方法。
[0026] 即，本发明在于提供一种表达HLA I类的非人动物、及其制作方法，所述表达HLA I 类的非人动物可以在短期间内有效且简便地制作，且导入基因的导入拷贝数及导入位置被 控制，该基因的表达量或表达位点被控制。
[0027] 用于解决课题的技术方案
[0028]本发明人等为了解决上述课题重复进行了潜心研究，结果发现:通过使编码含有 从N末端侧依次连接有02微球蛋白、HLA I类的al及a2区域以及非人动物MHC I类的a3区域 的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因在该非人动物的02微球蛋白基因的转录调控区 的控制下表达，可以在短期间内有效且简便地制作HLA I类基因敲入非人动物，进而，在利 用该方法得到的HLA I类基因敲入非人动物中，可以控制人工嵌合基因的导入拷贝数及导 入位置，可以控制该基因的表达量或表达位点，直至完成本发明。
[0029] SP，本发明包含以下发明。
[0030] [1]-种HLA I类基因敲入非人动物，其中，编码含有从N末端侧依次连接有02微球 蛋白、HLA I类的al及a2区域以及非人动物MHC I类的a3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人 工嵌合基因在该非人动物的K微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。
[0031] [2]根据[1]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，人工嵌合基因在该非人动物 的一对02微球蛋白基因座中的一个基因座中的02微球蛋白基因的转录调控区的控制下表 达。
[0032] [3]根据[1]或[2]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，HLA I类的al及a2区域 源自HLA-A。
[0033] [4]根据[3]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，HLA-A为HLA-A24、HLA-A3、 HLA-A2或HLA-A31。
[0034] [5]根据[3]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，HLA-A为HLA-A2402、HLA- A0301、HLA-A0201或HLA-A3101。
[0035] [6]根据[1]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，编码含有从N末端侧依次连 接有02微球蛋白、HLA I类的al及a2区域以及非人动物MHC I类的a3区域的蛋白质的第1人 工嵌合蛋白的第1人工嵌合基因在该非人动物的一对似微球蛋白基因座中的第1基因座中 的似微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达；
[0036]编码含有从N末端侧依次连接有02微球蛋白、HLA I类的al及a2区域以及非人动物 MHC I类的a3区域的蛋白质的第2人工嵌合蛋白的第2人工嵌合基因在该非人动物的一对02 微球蛋白基因座中的与该第1基因座不同的第2基因座中的02微球蛋白基因的转录调控区 的控制下表达。
[0037] [7]根据[6]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类 的al及a2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的al及a2区域源自相同基因型的HLA。
[0038] [8]根据[6]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类 的al及a2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的al及a2区域源自不同基因型的HLA。
[0039] [9]根据[6]~[8]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合 蛋白的HLA I类的al及a2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的al及a2区域源自HLA-A。
[0040] [10]根据[9]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I 类的al及a2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的al及a2区域相同或不同，源自HLA-A24、 HLA-A3、HLA-A2或HLA-A31。
[0041] [11]根据[9]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I 类的al及a2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的al及a2区域相同或不同，源自HLA-A2402、 HLA-A0301、HLA-A0201或HLA-A3101。
[0042] [12]根据[1]~[11]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，非人动物 MHC I类的a3区域源自H-2I类。
[0043] [13]根据[12]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，非人动物MHC I类的a3区 域源自H-2Db。
[0044] [14]根据[1]~[13]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，02微球蛋 白为人02微球蛋白。
[0045] [15]根据[1]~[14]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，非人动物 为小鼠。
[0046] [16]根据[15]所述的HLA I类基因敲入非人动物，所述HLA I类基因敲入非人动物 具有 B2mv(HLVH-2/B2M)或 B2m(HLVH-2/B2MV(HLVH-2/B2M)表示的基因型。
[0047] [17]-种HLA I类基因敲入非人动物的制作方法，所述方法包括:将编码含有从N 末端侧依次连接有02微球蛋白、HLA I类的al及a2区域以及非人动物MHC I类的a3区域的蛋 白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因导入在该非人动物的敗微球蛋白基因座的转录调控 区的控制下的工序。
[0048] [18]根据[17]所述的方法，所述方法包括以下工序：
[0049] (1)制作包含人工嵌合基因的靶向载体，该人工嵌合基因编码含有从N末端侧依次 连接有02微球蛋白、HLA I类的al及a2区域以及非人动物MHC I类的a3区域的蛋白质的人工 嵌合蛋白；
[0050] (2)使该靶向载体作用于该非人动物的多能性干细胞，导入在该多能性干细胞的0 2微球蛋白基因的转录调控区的控制下。
[00511 [ 19 ]根据[18 ]所述的方法，其中，多能性干细胞为ES细胞、GS细胞或iPS细胞。
[0052] [20]根据[18]或[19]所述的方法，其中，通过同源重组将人工嵌合基因导入在多 能性干细胞的02微球蛋白基因的转录调控区的控制下。
[0053] [21]根据[17]~[20]中任一项所述的方法，其中，02微球蛋白为人02微球蛋白。
[0054] [22] -种细胞，所述细胞在非人动物的02微球蛋白基因的转录调控区的控制下表 达编码含有从N末端侧依次连接有02微球蛋白、HLA I类的al及a2区域以及该非人动物MHC I类的a3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因。
[0055] [ 23 ]根据[22 ]所述的细胞，所述细胞为ES细胞、GS细胞或iPS细胞。
[0056] [24]-种由[1]~[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物得到的离体组 织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系。
[0057] [25]-种受试物质特异性CTL诱导剂的筛选方法，所述方法包括以下的（1)及(2) 的工序：
[0058] (1)使受试物质作用于[1]~[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物、
[22]或[23]所述的细胞、或[24]所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养 物、或已建立的细胞系的工序；
[0059] (2)评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。
[0060] [26] -种评价HLA I类限制性抗原是否存在的方法，所述方法包括以下的（1)及 (2)的工序：
[0061] (1)使受试物质作用于[1]~[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物、
[22]或[23]所述的细胞、或[24]所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养 物、或已建立的细胞系的工序；
[0062] (2)评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。
[0063] [27]-种疾病的治疗剂或预防剂的筛选方法，所述方法包括以下的（1)及(2)的工 序：
[0064] (1)使受试物质作用于[1]~[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物、 [22]或[23]所述的细胞、或[24]所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养 物、或已建立的细胞系的工序；
[0065] (2)评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。
[0066] [28]根据[27]所述的方法，其中，疾病为癌症或传染病。
[0067] [29] -种比较由受试物质所诱发的CTL反应的HLA限制特异性的方法，所述方法包 括以下的（1)~(2)的工序：
[0068] (1)将受试物质施用于分别表达不同的HLA I类基因的多个不同的系统的、[1]~ [16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，分别测定在该非人动物中被诱发的CTL反 应的工序；
[0069] (2)比较分别测定的该非人动物的CTL反应，判定诱发CTL反应的受试物质的HLA限 制性的工序。
[0070] [30]-种评价由受试物质诱发的CTL反应的有效性的方法，所述方法包括以下的 (1)~(2)的工序：
[0071] (1)将受试物质施用于分别表达不同的HLA I类基因的多个不同的系统的、[1]~ [16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，分别测定在该非人动物中被诱发的CTL反 应的工序；
[0072] (2)比较分别测定的该非人动物的CTL反应，判定诱发CTL反应的受试物质的HLA限 制性的工序。
[0073] [31]-种受试物质的安全性评价方法，所述方法包括以下的（1)及(2)的工序：
[0074] (1)使受试物质作用于[1]~[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物的工 序；
[0075] (2)分析发生在该非人动物中的不良应答的工序。
[0076] [32]根据[31]所述的方法，其中，不良应答为自身免疫反应。
[0077] [33]根据[25]~[32]中任一项所述的方法，其中，受试物质为一种或多种肽、一种 或多种多肽、一种或多种寡核苷酸、一种或多种多核苷酸、或者一种或多种蛋白质。
[0078]本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请2013-217684号的说 明书和/或附图中所记载的内容。
[0079]发明效果
[0080]根据本发明，可以提供以下发明。
[0081 ]本发明提供一种02微球蛋白基因座中的基因改变的非人动物。
[0082]更具体而言，为一种HLA I类基因敲入非人动物或非人细胞、它们的衍生物及它 们的使用方法，所述HLA I类基因敲入非人动物的编码含有从N末端侧依次连接有02微球蛋 白、HLA I类的al及a2区域以及非人动物MHC I类的a3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工 嵌合基因（以下，记为"人工嵌合基因"或"该人工嵌合基因"。）在该非人动物的02微球蛋白 基因的转录调控区的控制下表达。
[0083] 本发明的通过使该人工嵌合基因在非人动物的02微球蛋白基因的转录调控区的 控制下表达的特征，可以避免目前已知的HLA基因导入转基因小鼠、或目前已知的复合型突 变小鼠（即，制作将编码融合有02微球蛋白、HLA I类的al/a2结构域及小鼠H-2I类的a3结构 域的蛋白质的人工MHC I类基因插入于HLA I类基因启动子的下游的转基因小鼠，通过与02 微球蛋白基因敲除小鼠交配而制作的复合型突变小鼠（上述非专利文献9)。以下记为"目前 已知的复合型突变小鼠"。）具有的缺点。
[0084] 具体而言，在本发明中，具有如下所示的非常优异的优点。
[0085] (1)缩短制作时间、效率化、简便化
[0086]在制作目前已知的复合型突变小鼠的情况下，制作将上述人工MHC I类基因插入 于HLA I类基因启动子的下游的转基因小鼠，在选择出导入基因的表达的最佳系统之后，必 须与02微球蛋白基因敲除小鼠交配，因此，为了得到复合型突变小鼠，至少需要1年半~2年 的时间。
[0087]与此相对，由于本发明的非人动物不需要系统选择及交配的步骤，因此，例如在非 人动物为小鼠的情况下，能够在约7个月~8个月的短期间内制作。
[0088] 即，根据本发明，与目前已知的复合型突变小鼠相比，能够在短期间内有效且简便 地制作目的HLA I类基因敲入非人动物。
[0089] (2)实现生理性表达水平(表达量）
[0090]在目前已知的复合型突变小鼠中，该人工嵌合基因的表达量或表达位点受所导入 的人工MHC I类基因的拷贝数、基因组上的插入位点、表观遗传修饰等各种因素的影响，因 此，表达