及小鼠H-2DbS因组片段连接，构建全长为3735bp的所期望的人工嵌合基因(HHD-A2402)。（图1)
[0239] 实施例5:靶向载体的制作
[0240]接着，如图2所示制作用于将上述所制作的人工嵌合基因（HHD-A2402)敲入于小鼠 02微球蛋白基因的靶向载体。
[0241 ] 首先，基于小鼠02微球蛋白的cDNA序列信息（GeneBank Accession No.NM _ 009735.3)，从含有小鼠02微球蛋白基因的基因组区域(GeneBank Accession No.NC_ 000068.7)克隆在ES细胞内的同源重组中所需要的基因组序列。具体而言，以C57BL6/N小鼠 的基因组DNA为模板，使用PCR法克隆小鼠拟微球蛋白基因的第一甲硫氨酸的上游约1.2Kb。 此时，可以进行与人工嵌合基因（HHD-A2402)的结合，同时，在5 '端侧添加Sail识别序列，在 3'末端侧添加Ncol识别序列以使以后的载体构建变得容易。具体而言，通过使用下述中记 载的引物进行PCR法，得到进行了该改变的1198bp的DNA片段。
[0242] B2m-SHA-Fl ：
[0243] 5'-GTCGACCTGGGTAGACACTGTAGGATTGGGTCTCTG-3'（序列号24)
[0244] B2m-SHA-Rl：
[0245] 5 ' -CCATGGTGACGACTGAAGCGACCGCGACTG-3 '（序列号25)
[0246] 接着，从含有小鼠拟微球蛋白基因的基因组DNA序列的BAC克隆(RP23-34E24)，克 隆从内含子2的Nhel识别序列至内含子4的SacII识别序列的全长8462bp的基因组片段。
[0247] 通过将如以上那样得到的小鼠02微球蛋白基因的基因组片段及人工嵌合基因 (HHD-A2402)与PGK-DT-A盒及PGK-neo-bpA盒同时在质粒pBluescript II KS+上进行克隆， 制作由全长约19.2Kb构成的所期望的靶向载体。（图3)
[0248] 实施例6:向ES细胞导入靶向载体
[0249]接着，将实施例5中所制作的靶向载体导入于ES细胞。
[0250] ES细胞使用从Millipore社购入的CMTI-1细胞(Passage 11)。以下的实施例中记 载的细胞的培养使用添加有 20%FBS(ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum) (Life Technologies社)及 103units/mL的LIF(Leukocyte Inhibitory Factor)(Millipore社）的 DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基）（Life Technologies社），在37°C的5%⑶2细胞培养 箱中进行。
[0251] 将实施例5中制作的靶向载体50yg用Notl切割之后，溶解于0.2mL的ES细胞用电穿 孔缓冲液(Millipore社），与悬浮于0.3mL的电穿孔缓冲液的2X10 7个CMTI-1细胞同时在电 穿孔用样品池(bio-rad社）中进行混合。其后，使用Gene Pulser II (bio-rad社），在250V、 500yF的条件下给予电脉冲，在5个预先接种有新霉素抗性饲养细胞(DS Pharma社）的10cm 培养皿中各加入0.1111匕12-18小时后，添加效价为250yg/mL的G418(nacalai tesque)，培养 1周。
[0252] 实施例7:已发生同源重组的ES细胞的选择和确认
[0253]在实施例6中，收集384个添加G418后培养1周后存活的ES细胞集落。将各集落分成 两份，一份继续培养，另一份用PBS洗涤之后进行蛋白酶K处理，使用下述记载的引物进行 PCR，选择3个已发生同源重组的克隆。
[0254] HHD-HRES-F1：
[0255] 5'-AGCAITTCCTAGTACAGITCAACACAGTGITTAGT-3'（序列号洸）
[0256] HHD-HRES-R1：
[0257] 5'-GAGTAGCAGGACGAGGGTTCGGGGCGCCAT-3'（序列号27)
[0258] 关于PCR的实验条件，将94°C 30秒、60 °C 1分钟、72 °C 2分钟作为1循环进行35循环， 通过PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳，将检测出在成功地进行同源重组时所预测的PCR产物 (约1.4Kb)的克隆判断为阳性。
[0259] 为了更准确地确认同源重组，从在前项中认为是阳性的ES细胞克隆中提取基因组 DNA，利用如下DNA印迹技术法进行分析。
[0260] 将1 Oyg基因组DNA用限制酶EcoRI切割后，进行1 %琼脂糖凝胶电泳，在10 X SSC溶 液中通过毛细管法转移到尼龙薄膜Hybond_N+( Pharmacia社）上。从实施例5中克隆的 1198bp的DNA片段进一步制备5'-侧上游的约0.5Kb的DNA片段。将以[a-32P]-dCTP (Perkinelmer社)标记的上述DNA片段作为探针进行Southern杂交，成功地进行了同源重组 的约2.1Kb的条带和源自野生型的2.5Kb的条带以1:1被检测出。（图4)
[0261] 实施例8:敲入人工嵌合基因（HHD-A2402)的转基因动物的制作
[0262] 将确认已发生同源重组的ES细胞通过胰蛋白酶处理进行分散。从适于与小鼠 C57BL/6系统的雄体交配的同品系的雌体中取出胚泡，使用微注射装置(NARISHIGE社），向 每1个胚泡的分裂腔内注入约10个上述ES细胞。将其移至进行了假妊娠处理的雌性小鼠的 子宫中，通过持续产生胎儿以得到嵌合小鼠。
[0263] 将该嵌合小鼠的雄体与C57BL/6系统的雌体交配，选择刚出生的仔鼠中的野生型 色(agouti)，从切割自其尾巴的一部分的试样中提取基因组DNA，使用下述记载的引物进行 PCR〇
[0264] HHD-F1 ：
[0265] 5'-CTAGAAGCAAGGTCAGAAATCCTCT-3'（序列号28)
[0266] HHD-WT-R3：
[0267] 5'-CCGTCAGCACACTCGCAAACAGGCG-3'（序列号29)
[0268] HHD-HRES-R1：
[0269] 5'-GAGTAGCAGGACGAGGGTTCGGGGCGCCAT-3'（序列号30)
[0270]关于PCR的实验条件，将94°C 30秒、60°C 1分钟、72°C 1分钟作为1循环进行35循环， 将PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。除源自野生型基因座的804bp的PCR产物之 外，通过检测出在成功地进行同源重组时所预测的510bp的PCR产物，确认敲入杂合子小鼠。
[0271] 将敲入杂合子小鼠彼此交配，从切割自出生不久的仔鼠的尾巴的一部分的试样中 提取基因组DNA，使用上述PCR法分析基因型。源自野生型基因座的804bp的PCR产物没有被 检测出，通过仅检测出在成功地进行同源重组时所预测的510bp的PCR产物，确认敲入纯合 子小鼠。
[0272] 将由利用PCR法判定为纯合子、杂合子及野生型的小鼠各3只的尾巴的一部分制备 的基因组DNA通过实施例7中记载的Southern杂交法进行分析，结果，在纯合子中，确认仅约 2.1Kb的条带，在杂合子中，确认约2.1KB及约2.5Kb的2个条带，在野生型小鼠中，确认仅约 2.5Kb的条带。（图5)
[0273] 对纯合子、杂合子及野生型小鼠各3只实施安乐死，使用Isogen(和光纯药工业)及 RNeasy Kit(QIAGEN社）由肝脏制备总RNA，在进行DNA酶I处理之后，使用Superscript HI First-Strand Synthesized System(Life Technologies社）合成cDNA。在加入检测小鼠 02 微球蛋白及核糖体RNA的TaqMan Assay Mix(Applied Biosystems社）和2XTaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems社）之后，使用PRISM7900HT Sequence Detection System(AppliedBiosystems社）利用定量RT-PCR法进行分析，结果确认:在纯合 子中，小鼠 02微球蛋白mRNA的表达几乎完全消失，在杂合子中，减少至野生型小鼠的表达量 的约一半。（图6)
[0274] 实施例9:敲入人工嵌合基因（HHD-A0301)的转基因动物的制作
[0275] 基于人HLA-A0301 的序列信息（GeneBank Accession No .AJ748743 ? 1)，进行包含a 1及a2区域的基因片段的全合成。具体而言，在N末端侧添加编码含有BamHI识别序列的10个 氨基酸肽的序列、及在C末端侧的内含子3序列内添加 Bglll识别序列，合成下述记载的 867bp的DNA片段。
[0276] 5，-
[0277] ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCG GCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCAT CGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGAC GCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACG GAATGTGAAGGCCCAGTCACAGACTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG gtgagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgg gtccgagatccaccccgaagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggtttc attttcagtttaggccaaaaatccccccgggttggtcggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcgggg tcggggccagGTTCTCACACCATCCAGATAATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTA CCGGCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGG CGGCTCAGATCACCAAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCATGAGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGATGGCACGTGC GTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcc tccctgatcgcctgtagatct-3'（序列号31)(大写字母表示外显子区域，小写字母表示内含子 区域）
[0278] 以后，利用实施例2~8中记载的方法制作HHD-A0301的敲入杂合子小鼠及敲入纯 合子小鼠。
[0279] 实施例10:敲入人工嵌合基因（HHD-A0201)的转基因动物的制作
[0280] 基于人HLA-A0201 的序列信息（GeneBank Accession No .AY365426 ? 1 )，进彳丁包含a 1及a2区域的基因片段的全合成。具体而言，在N末端侧添加编码含有BamHI识别序列的10个 氨基酸肽的序列、及在C末端侧的内含子3序列内添加 Bglll识别序列，合成下述中记载的 867bp的DNA片段。
[0281] 5，-
[0282] ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCG GCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACG CCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGC AGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACG GAAAGTGAAGGCCCACTCACAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG gtgagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgg gtccgagatccaccccgaagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggtttc attttcagtttaggccaaaaatccccccgggttggtcggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcgggg tcggggccagGTTCTCACACCGTCCAGAGGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGGCGCTTCCTCCGCGGGTA CCACCAGTACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGG CAGCTCAGACCACCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGC GTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcc tccctgatcgcctgtagatct-3'（序列号43)(大写字母表示外显子区域，小写字母表示内含子 区域）
[0283] 以后，利用实施例2~8中记载的方法，制作HHD-A0201的敲入杂合子小鼠及敲入纯 合子小鼠。
[0284] 实施例11:敲入人工嵌合基因（HHD-A3101)的转基因动物的制作
[0285] 基于HLA-A3101 的序列信息（GeneBank Accession No.M84375.1)，进行包含al及a 2区域的基因片段的全合成。具体而言，在N末端侧添加编码含有BamHI识别序列的10个氨基 酸肽的序列、及在C末端侧的内含子3序列内添加 Bglll识别序列，合成下述中记载的867bp 的DNA片段。
[0286] 5'-
[0287] ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCATGAGGTATTTCACCACATCCGTGTCCCG GCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACG CCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGAGGCCTGAGTATTGGGACCAGGAGACACGG AATGTGAAGGCCCACTCACAGATTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACT ACAACCAGAGCGAGGCCG gtgagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgg gtccgagatccaccccgaagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggtttc attttcagtttaggccaaaaatccccccgggttggtcggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcgggg tcggggccagGTTCTCACACCATCCAGATGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTA CCAGCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCTTGAACGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGG CGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGC GTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcc tccctgatcgcctgtagatct-3'（序列号44)(大写字母表示外显子区域，小写字母表示内含子 区域）
[0288] 以后，利用实施例2~8中记载的方法制作HHD-A3101的敲入杂合子小鼠及敲入纯 合子小鼠。
[0289] 实施例12:敲入HHD-A2402及HHD-A0301的转基因动物的制作
[0290] 将HHD-A2402敲入纯合子小鼠和HHD-A0301敲入纯合子小鼠交配，制作持有各1个 拷贝的HHD-A2402及HHD-A0301基因的双重敲入小鼠。
[0291] 实施例13:敲入小鼠中的人及小鼠MHC I类的表达确认
[0292] 对HHD-A2402、HHD-A0301各自的敲入纯合子小鼠、敲入杂合子小鼠、同窝对照（同 腹対照）的野生型小鼠及HHD-A240 2/HHD-A0 301双重敲入小鼠实施安乐死，利用流式细胞仪 法分析从摘除的脾脏中回收的脾细胞或血细胞表面上的人MHC I类的表达。具体而言，将1 X 106个脾细胞或血细胞用单克隆的PE标记的抗HLA抗体17A10(MBL社）、或作为一抗的生物 素化抗体4;1153(413〇31]1社）及作为二抗的？￡标记的抗生物素抗体13;[03-18￡7(|/[;[]^61171 Biotec)进行染色。
[0293] 其结果，在HHD-A2402敲入纯合子小鼠及HHD-A2402敲入杂合子小鼠中，确认HLA-A24的表达，而在HHD-A0301敲入纯合子小鼠及HHD-A0301敲入杂合子小鼠中，确认HLA-A3的 表达。另外，在HHD-A2402/HHD-A0301双重敲入小鼠中，可观察到HLA-A24及HLA-A3两者的 表达。（图7-1、图7-2)
[0294] 进而，使用PE标记的抗H_2Kb抗体AF6_88.5(BD Bioscience社）分析脾细胞表面上 的内源性小鼠 MHC I类的表达，结果，在野生型及HHD-A2402敲入杂合子小鼠及HHD-A0301敲 入杂合子小鼠中可观察到H_2Kb的表达，但在HHD-A2402敲入纯合子小鼠、HHD-A0301敲入纯 合子小鼠、及HHD-A2402/HHD-A0301双重敲入小鼠中确认H-2K b的表达几乎完全消失。（图8-1、图8-2)
[0295] 同样地，使用单克隆的PE标记的抗HLA-A2抗体BB7.2 (MBL社)及单克隆的FITC标记 的抗人拟微球蛋白抗体TU99(BD Bioscience社）确认HHD-A020