1敲入纯合子小鼠、杂合子小 鼠及同窝（同腹)对照的野生型小鼠的血细胞表面上的HLA-A2及人02微球蛋白的表达，并使 用单克隆的FITC标记的抗人02微球蛋白抗体TU99确认HHD-A3101敲入纯合子小鼠、杂合子 小鼠及同窝对照的野生型小鼠的血细胞表面上的人K微球蛋白的表达。
[0296] 其结果，在HHD-A0201敲入纯合子小鼠及HHD-A0201敲入杂合子小鼠中，可观察到 HLA-A2及人拟微球蛋白的表达（图9-1)，另外，在HHD-A3101敲入纯合子小鼠及HHD-A3101敲 入杂合子小鼠中，可观察到人K微球蛋白的表达(图9-2)。
[0297] 进而，使用PE标记的抗H-2Kb/H_2Db抗体28-8_6(Biolegend社）分析血细胞表面上 的内源性的小鼠 MHC I类的表达，结果，在野生型及HHD-A0201敲入杂合子小鼠及HHD-A3101 敲入杂合子小鼠中，可观察到H-2K#P/或H-2Db的表达，但在HHD-A0201敲入纯合子小鼠及 HHD-A3101敲入纯合子小鼠中，确认H-2Kb&H-2Db的表达几乎完全消失。（图10-1、图10-2)
[0298] 实施例14: A24敲入小鼠中的CTL诱导能力的确认
[0299] 将下述记载的病毒衍生的抗原肽或阴性对照肽用大塚蒸馏水(大塚制药工场）制 备为2mg/mL，填充于B Braun Injekt注射器。
[0300] A24V6:EYLVSFGVW(A24限制性HBV衍生的抗原）（序列号32)
[0301 ] A24V8:SFHSLHLLF(A24 限制性 HTLV 衍生的抗原）（序列号 33)
[0302] A24V9:DYCNVLNKEF(A24 限制性 EBV 衍生的抗原）（序列号 34)
[0303] A24V10:RYLRDQQLL(A24 限制性 HIV 衍生的抗原）（序列号 35)
[0304]在其它注射器中填充等量的弗氏不完全佐剂（IFA)之后，将两注射器用GP注射器 连接器连接，通过使病毒衍生的抗原肽溶液和IFA充分地混合而制备乳液。在A24纯合敲入 小鼠、杂合敲入小鼠及同窝野生型小鼠的尾根部的皮下按每周1次各l〇〇yL/小鼠施用上述 乳液，总计2次。最终施用1周后，从小鼠中回收腹股沟淋巴结。将淋巴结细胞悬浮液用完全 培养基（RPMI-1640，10%热灭活的FBS，100U/mL青霉素，100yg/mL链霉素，50虚2-巯基乙 醇）制备为5 X 106细胞/mL，分别加入靶CTL表位肽(最终浓度10yg/mL)、重组小鼠IL-15(最 终浓度100ng/mL)、重组小鼠IL-21(最终浓度100ng/mL)，以lmL/孔向24孔板接种后，在37 °C、5%⑶ 2细胞培养箱内培养8天。8天后，回收细胞，在Murine IFN-yELISpot Kit(GEN-PR0BE)添加的抗IFN- y抗体固相化板上以1 X 105细胞/孔接种。接着，将由同系小鼠脾脏制 备且照射有30Gy的X射线的脾细胞向同一孔作为抗原呈递细胞以1 X 105细胞/孔接种后，加 入靶CTL表位肽、或阴性对照肽（最终浓度10yg/mL)，在37°C、5%⑶ 2细胞培养箱内培养一 夜。第二天，按照试剂盒的说明书文件，使产生IFN- y的细胞点显色。产生IFN- y的细胞点 数用ELISP0T分析器（Immunospot S6，Cellular Technology Ltd.)进行定量。其结果，如图 11所示，在A24纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠任一个中，添加上述病毒衍生的抗原肽的孔的 产生IFN-Y的细胞点数显著地高于添加阴性对照肽的孔的产生IFN-Y的细胞点数 (Student ' s t-test，p<0 ? 001)、确认表位特异性CTL的诱导。
[0305]实施例15: A3敲入小鼠中的CTL诱导能力的确认
[0306]将下述记载的病毒衍生的抗原肽用大塚蒸馏水(大塚制药工场)制备为2mg/mL，填 充于B Braun Injekt注射器。
[0307] A3V3: RLRPGGKKK( A3限制性HIV衍生的抗原）（序列号36)
[0308] A3V4:QVPLRPMTYK(A3限制性HIV衍生的抗原）（序列号37)
[0309] A3V7 :RLRAEAQVK(A3限制性EBV衍生的抗原）（序列号38)
[0310] A3V10:SIIPGPLK(A3限制性流感病毒衍生的抗原）（序列号 39)
[0311] 在其它注射器中填充等量的弗氏不完全佐剂（IFA)之后，将两注射器用GP注射器 连接器连接，通过使病毒衍生的抗原肽溶液和IFA充分地混合而制备乳液。在A3纯合敲入小 鼠、杂合敲入小鼠及同窝野生型小鼠的尾根部的皮下按每周1次各l〇〇yL/小鼠施用上述乳 液，总计2次，以后，利用实施例14中记载的方法评价病毒衍生的抗原肽特异性的CTL的诱 导。其结果，如图12所示，在A3纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠任一个中，添加上述病毒衍生的 抗原肽的孔的产生IFN-Y的细胞点数显著地高于添加阴性对照肽的孔的产生IFN-Y的细 胞点数(Student' s t-test，p<0? 01或p<0? 001)，确认表位特异性CTL的诱导。
[0312] 实施例16:A24/A3双重敲入小鼠中的CTL诱导能力的确认
[0313] 同样地，将病毒衍生的抗原肽(A3V7及A24V8)施用于A24/A3双重敲入小鼠及野生 型小鼠，利用实施例14中记载的方法评价病毒衍生的抗原肽特异性的CTL的诱导。其结果， 如图13所示，在A24/A3双重敲入小鼠中，添加上述病毒衍生的抗原肽的孔的产生IFN-y的 细胞点数显著地高于添加阴性对照肽的孔的产生IFN-y的细胞点数(Student's t-test，p <0.001 )，确认表位特异性的CTL的诱导。
[0314] 实施例17: A2敲入小鼠中的CTL诱导能力的确认
[0315] 将下述记载的病毒衍生的抗原肽用大塚蒸馏水(大塚制药工场)制备为lmg/mL，填 充于B Braun Injekt注射器。
[0316] A2V1:CLGGLLTMV(序列号 45)
[0317] A2V2:GLCTLVAML(序列号 46)
[0318] A2V3:NLVPMVATV(序列号 47)
[0319] A2V4:VLAELVKQI(序列号 48)
[0320] A2V7:VLSDFKTWL(序列号 49)
[0321] A2V8:FLPSDFFPSV(序列号 50)
[0322] A2V9:FLLTRILTI(序列号 51)
[0323] A2V10:GLSPTVWLS(序列号 52)
[0324] 在其它注射器中填充等量的弗氏不完全佐剂（IFA)之后，将两注射器用GP注射器 连接器连接，通过使病毒衍生的抗原肽溶液和IFA充分地混合而制备乳液。在A2纯合敲入小 鼠、杂合敲入小鼠及同窝野生型小鼠的尾根部的皮下按每周1次各i〇〇yL/小鼠施用上述乳 液，总计2次，以后，利用实施例14中记载的方法评价病毒衍生的抗原肽特异性的CTL的诱 导。其结果，如图14所示，在A2纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠任一个中，添加上述病毒衍生的 抗原肽的孔的产生IFN-Y的细胞点数显著地高于添加阴性对照肽的孔的产生IFN-Y的细 胞点数(Student's t-test，p<0? 001 )，确认表位特异性的CTL的诱导。
[0325] 实施例18: A31敲入小鼠中的CTL诱导能力的确认
[0326] 将下述记载的病毒衍生的抗原肽用大塚蒸馏水(大塚制药工场)制备为lmg/mL，填 充于B Braun Injekt注射器。
[0327] A31V3:ASCMGUYNR(序列号 53)
[0328] A：31V5:SVQPTFSVQR(序列号 54)
[0329] A31V6:KFLPDLYDYK(序列号 55)
[0330] A：31V8:SFSFGGFTFK(序列号 56)
[0331] A31V10:RVIDPRRCMK(序列号 57)
[0332] 在其它注射器中填充等量的弗氏不完全佐剂（IFA)之后，将两注射器用GP注射器 连接器连接，通过使病毒衍生的抗原肽溶液和IFA充分地混合而制备乳液。在A31纯合敲入 小鼠、杂合敲入小鼠及同窝野生型小鼠的尾根部的皮下按每周1次各100yL/小鼠施用上述 乳液，总计2次，以后，利用实施例14中记载的方法评价病毒衍生的抗原肽特异性的CTL的诱 导。其结果，如图15所示，在A31纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠任一个中，添加上述病毒衍生 的抗原肽的孔的产生IFN-y的细胞点数显著地高于添加阴性对照肽的孔的产生IFN-y的 细胞点数(Student' s t-test，p<0? 01或p<0? 001)，确认表位特异性的CTL的诱导。
[0333] 实施例19:敲入小鼠中的⑶4TD8+T细胞团的分析
[0334] 对HHD-A2402、HHD-A0301、HHD-A0201、HHD-A3101 各自的敲入纯合子小鼠、敲入杂 合子小鼠、同窝对照的野生型小鼠、及HHD-A2402/HHD-A0301双重敲入小鼠实施安乐死，利 用流式细胞仪法分析血细胞表面上的⑶4及⑶8的表达。具体而言，将1 X 106个血细胞用单 克隆的PE-Cy7标记的抗CD4抗体GK1.5(eBioscience社)及FITC或APC标记的抗CD8抗体53_ 6 ? 7(613；[08(^61106社)进行染色。
[0335] 其结果，在 HHD-A2402、HHD-A0301、HHD-A0201、HHD-A3101 各自的敲入杂合子小鼠 中，CD4-CD8+T细胞的比例与野生型小鼠类似，但在HHD-ASAC^aHHD-AOSOUHHD-AC^OUHHD-AS 101 各自 的敲入纯合子小鼠及 HHD-A240 2/HHD-A0301 双重敲入小鼠中 ，确认 CD4-CD8+T 细胞 的比例与野生型小鼠相比显著地减少。（图16-1、图16-2)
[0336] 将本说明书中引用的全部的刊行物、专利及专利申请直接作为参考引入于本说明 书中。
【主权项】
1. 一种HLA I类基因敲入非人动物，其中，编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、 HLA I类的α?及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌 合基因在该非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。2. 根据权利要求1所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，人工嵌合基因在该非人动 物的一对β2微球蛋白基因座中的一个基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下 表达。3. 根据权利要求1或2所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，HLA I类的α?及α2区域 源自HLA-Ao4. 根据权利要求3所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，HLA-A为HLA-A24、HLA-A3、 HLA-A2或HLA-A31。5. 根据权利要求3所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，HLA-A为HLA-A2402、HLA-A0301、HLA-A0201或HLA-A3101。6. 根据权利要求1所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，编码含有从N末端侧依次连 接有β2微球蛋白、HLA I类的α?及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的第1人 工嵌合蛋白的第1人工嵌合基因在该非人动物的一对β2微球蛋白基因座中的第1基因座中 的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达； 编码含有从Ν末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α?及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的第2人工嵌合蛋白的第2人工嵌合基因在该非人动物的一对β2微球 蛋白基因座中的与该第1基因座不同的第2基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控 制下表达。7. 根据权利要求6所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I 类的α?及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α?及α2区域源自相同基因型的HLA。8. 根据权利要求6所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I 类的α?及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α?及α2区域源自不同基因型的HLA。9. 根据权利要求6~8中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合 蛋白的HLA I类的α?及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α?及α2区域源自HLA-A。10. 根据权利要求9所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I 类的α?及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α?及α2区域相同或不同，源自HLA-A24、 HLA-A3、HLA-A2或HLA-A31。11. 根据权利要求9所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I 类的α?及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α?及α2区域相同或不同，源自HLA-A2402、 HLA-A0301、HLA-A0201或HLA-A3101。12. 根据权利要求1~11中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，非人动物 MHC I类的α3区域源自H-2I类。13. 根据权利要求12所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，非人动物MHC I类的α3区 域源自H-2Db。14. 根据权利要求1~13中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，β2微球蛋白 为人β2微球蛋白。15. 根据权利要求1~14中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，非人动物为 小鼠。16. 根据权利要求15所述的HLA I类基因敲入非人动物，所述HLA I类基因敲入非人动 物具有 B2m+/(HLA/H-2/B!M)或 B2m(HLVH-2/B2M)/(HLA/H- 2/B：M)表示的基因型。17. -种HLA I类基因敲入非人动物的制作方法，所述方法包括:将编码含有从N末端侧 依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α?及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的 人工嵌合蛋白的人工嵌合基因导入在该非人动物的β2微球蛋白基因座的转录调控区的控 制下的工序。18. 根据权利要求17所述的方法，所述方法包括以下工序： (1) 制作包含人工嵌合基因的靶向载体，该人工嵌合基因编码含有从Ν末端侧依次连接 有β2微球蛋白、HLA I类的α?及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合 蛋白； (2) 使该靶向载体作用于该非人动物的多能性干细胞，导入在该多能性干细胞的β2微 球蛋白基因的转录调控区的控制下。19. 根据权利要求18所述的方法，其中，多能性干细胞为ES细胞、GS细胞或iPS细胞。20. 根据权利要求18或19所述的方法，其中，通过同源重组将人工嵌合基因导入在多能 性干细胞的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下。21. 根据权利要求17~20中任一项所述的方法，其中，β2微球蛋白为人β2微球蛋白。22. -种细胞，所述细胞在非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达编 码含有从Ν末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α?及α2区域以及该非人动物MHC I类 的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因。23. 根据权利要求22所述的细胞，所述细胞为ES细胞、GS细胞或iPS细胞。24. -种由权利要求1~16中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物得到的离体组 织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系。25. -种受试物质特异性CTL诱导剂的筛选方法，所述方法包括以下的（1)及（2)的工 序： (1) 使受试物质作用于权利要求1~16中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物、权 利要求22或23所述的细胞、或权利要求24所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代 细胞培养物、或已建立的细胞系的工序； (2) 评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。26. -种评价HLA I类限制性抗原是否存在的方法，所述方法包括以下的（1)及(2)的工 序： (1) 使受试物质作用于权利要求1~16中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物、权 利要求22或23所述的细胞、或权利要求24所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代 细胞培养物、或已建立的细胞系的工序； (2) 评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。27. -种疾病的治疗剂或预防剂的筛选方法，所述方法包括以下的（1)及(2)的工序： (1)使受试物质作用于权利要求1~16中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物、权 利要求22或23所述的细胞、或权利要求24所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代 细胞培养物、或已建立的细胞系的工序； (2)评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。28. 根据权利要求27所述的方法，其中，疾病为癌症或传染病。29. -种比较由受试物质所诱发的CTL反应的HLA限制特异性的方法，所述方法包括以 下的（1)~(2)的工序： (1) 将受试物质施用于分别表达不同的HLA I类基因的多个不同的系统的、权利要求1 ~16中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，分别测定在该非人动物中被诱发的CTL反 应的工序； (2) 比较分别测定的该非人动物的CTL反应，判定诱发CTL反应的受试物质的HLA限制性 的工序。30. -种评价由受试物质诱发的CTL反应的有效性的方法，所述方法包括以下的（1)~ (2)的工序： (1) 将受试物质施用于分别表达不同的HLA I类基因的多个不同的系统的、权利要求1 ~16中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，分别测定在该非人动物中被诱发的CTL反 应的工序； (2) 比较分别测定的该非人动物的CTL反应，判定诱发CTL反应的受试物质的HLA限制性 的工序。31. -种受试物质的安全性评价方法，所述方法包括以下的（1)及(2)的工序： (1) 使受试物质作用于权利要求1~16中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物的工 序； (2) 分析发生在该非人动物中的不良应答的工序。32. 根据权利要求31所述的方法，其中，不良应答为自身免疫反应。33. 根据权利要求25~32中任一项所述的方法，其中，受试物质为一种或多种肽、一种 或多种多肽、一种或多种寡核苷酸、一种或多种多核苷酸、或者一种或多种蛋白质。
【专利摘要】提供一种可以在短期间内有效且简便地制作的表达HLA？I类的非人动物及其制作方法，其中导入基因的导入拷贝数及导入位置被控制且该基因的表达量或表达位点被控制。HLA？I类基因敲入非人动物及其制作方法，其中编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA？I类的α1及α2区域以及非人动物MHC？I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因在该非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。
【IPC分类】C12Q1/02, A01K67/027, C12N15/09, C12N5/10
【公开号】CN105578876
【申请号】CN201480053640
【发明人】原田直干, 深谷智史
【申请人】大鹏药品工业株式会社
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月17日
【公告号】WO2015056774A1