[0029]本发明还涵盖了变体核酸分子。编码杀有害生物蛋白的核苷酸序列的"变体"包括 编码在此披露的杀有害生物蛋白、但由于遗传密码的简并性而保守性地不同的那些序列以 及如以上所讨论的足够一致的那些序列。天然存在的等位基因变体可以使用所熟知的分子 生物学技术来鉴定，例如像以下所概括的聚合酶链式反应(PCR)以及杂交技术。变体核苷酸 序列还包括合成地衍生的核苷酸序列，这些核苷酸序列已经例如通过使用定点诱变而产生 但它们仍编码了在本发明中所披露的杀有害生物蛋白，如以下所讨论。本发明所涵盖的变 体蛋白是有生物活性的，即它们继续具有所希望的天然蛋白的生物活性，即杀有害生物活 性。关于"保留活性"是指该片段将具有至少约30%、至少约50%、至少约70%、或至少约 80%的该天然蛋白的杀有害生物活性。用于测量杀有害生物活性的方法在本领域是熟知 的。参见例如查普拉(Czapla)和朗（1^即）（1990)经济昆虫学杂志（1』(：〇11上1^〇111〇1.)83 : 2480-2485;安德鲁斯(Andrews)等人（1988)生物化学杂志（Biochem.J. )252:199-206;马罗 内（Marrone)等人（1985)经济昆虫学杂志（J. of Economic Entomology) 78:290-293;以及美 国专利号5,743,477，所有这些文献都通过引用以其全文结合在此。
[0030] 熟练的技术人员将进一步意识到，可以通过突变本发明的核苷酸序列来引入变 化，由此导致在这些编码的杀有害生物蛋白的氨基酸序列中的变化，而不改变这些蛋白质 的生物活性。因此，可以通过将一个或多个核苷酸置换、添加、或缺失引入到在此披露的相 应核苷酸序列中而产生分离的核酸分子变体，使得将一个或多个氨基酸置换、添加、或缺失 引入到编码的蛋白质中。可以通过标准的技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)来引入突变。 这样的变体核苷酸序列也由本发明所涵盖。
[0031] 例如，可以在一个或多个、预测的、非必需氨基酸残基处做出保守性氨基酸置换。 一个"非必需"氨基酸残基是可以从一种杀有害生物蛋白的野生型序列改变的而不改变生 物活性的残基，而一个"必需"氨基酸残基是生物活性所需要的。"保守性氨基酸置换"是其 中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。在本领域中已经定义了具有类似 侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有以下的氨基酸:碱性侧链(例如赖氨酸、精氨 酸、组氨酸），酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸），不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸），非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸），β_支链的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮 氨酸）以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。
[0032] δ-内毒素通常具有五个保守的序列结构域和三个保守的结构性结构域(参见，例 如戴马格德(de Maagd)等人(2001)遗传学趋势（Trends Genetics)17:193-199)。第一个保 守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙 构型的三个β片层组成并且结构域III由"果冻卷"结构中的两个反向平行的β片层组成(戴 马格德(de Maagd)等人，2001，同上）。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被认 为是毒素特异性的决定簇。
[0033]氨基酸置换可以在保留功能的非保守性区域中做出。通常，此类置换并非针对保 守的氨基酸残基、或针对在保守基序内的氨基酸残基而做出，其中此类残基是蛋白活性所 必需的。保守的并且对于蛋白质活性可能是必需的残基的实例包括例如以下残基，这些残 基在与本发明的序列相似或相关的毒素的比对中所包括的所有蛋白质之间是相同（例如， 在同源蛋白的比对中是相同的残基）。保守的但可能允许保守性氨基酸置换、并且仍保留活 性的残基的实例包括例如以下残基，这些残基在与本发明的序列相似或相关的毒素的比对 中所包括的所有蛋白质之间仅具有保守性置换(例如，在比对同源蛋白中所包括的所有蛋 白质之间仅具有保守性置换的残基）。然而，本领域的普通技术人员应当理解，功能性变体 在保守的残基中可以具有少量的保守性或非保守性改变。
[0034]可替代地，可以通过沿着该编码序列的全部或部分随机地引入突变(如通过饱和 诱变)来制备变体核苷酸序列，并且可以针对赋予杀有害生物活性的能力来筛选得到的突 变体以鉴定保留活性的突变体。在诱变之后，可以重组表达编码的蛋白，并且可以使用标准 的测定技术来测定蛋白的活性。
[0035] 使用诸如PCR、杂交、以及类似的方法可以鉴定出相应的杀有害生物序列，这样的 序列与本发明的序列具有实质性上的一致性。参见例如萨姆布鲁克（Sambrook)和拉塞尔 (Russell)(2001)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.)(冷 泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港（Cold Spring Harbor)，纽约）以及英尼斯（Innis)等人（1990)PCR方案:方法和应用指导(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications)(学术出版社（Academic Press)，纽约）。
[0036] 在一种杂交方法中，该杀有害生物核苷酸序列的全部或部分可以用于筛选cDNA或 基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法在本领域内通常是已知的，并且披露 于萨姆布鲁克和拉塞尔，2001，同上。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA 片段、或其他寡核苷酸，并且可以用一个可检测基团（如32P、或任何其他可检测的标记物，如 其他放射性同位素、一种荧光化合物、一种酶、或一种酶辅因子)进行标记。可以基于在此披 露的已知的编码杀有害生物蛋白的核苷酸序列通过标记合成寡核苷酸来制备用于杂交的 探针。可以另外地使用简并引物，这些引物是基于在该核苷酸序列或编码的氨基酸序列中 的保守性核苷酸或氨基酸残基而设计的。这种探针典型地包括以下核苷酸序列的区域，这 些核苷酸序列区域在严格条件下与本发明的编码杀有害生物蛋白的核苷酸序列或它的片 段或变体的至少约12个、至少约25个、至少约50、75、100、125、150、175、或200个连续核苷酸 进行杂交。用于制备用于杂交的探针的方法通常是本领域已知的，并且披露于萨姆布鲁克 和拉塞尔，2001(同上）中，该文献通过引用结合在此。
[0037] 例如，在此披露的完整的杀有害生物序列、或它的一个或多个部分可以用作探针， 该探针能够与相应的杀有害生物蛋白样序列以及信使RNA特异性地杂交。为了实现在不同 的条件下的特异性杂交，这样的探针包括以下序列，这些序列是独特的并且长度优选为至 少约10个核苷酸、或长度为至少约20个核苷酸。这样的探针可以用于通过PCR从一种选择的 生物中扩增相应的杀有害生物序列。这种技术可以用于从一种所希望的生物中分离另外的 编码序列，或用作一种诊断性测定以便确定在一种生物中的编码序列的存在。杂交技术包 括杂交筛选平板接种的DNA文库（噬斑抑或菌落;参见，例如萨姆布鲁克等人（1989)分子克 隆:实验室手册(第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约））。
[0038] 因此，本发明涵盖了用于杂交的探针以及能够与本发明的核苷酸序列的全部或部 分（例如，至少约300个核苷酸、至少约400个、至少约500、1000、1200、1500、2000、2500、 3000、3500个核苷酸、或者达到在此披露的一个核苷酸序列的全长)杂交的核苷酸序列。这 样的序列的杂交可以在严格条件下进行。"严格条件"或"严格杂交条件"是指以下条件，在 这些条件下与其他序列相比一种探针将与它的目标序列杂交达到一个可检测地更大的程 度(例如，超过背景至少2倍）。严格条件是序列依赖性的并且在不同的情形下将会不同。通 过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与该探针100%互补的目标序列（同源探 测）。可替代地，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，这样使得检测到更低程度的 相似性(异源探测）。通常，探针的长度为小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷 酸。
[0039]典型地，严格条件将是以下条件，在这些条件下盐浓度在pH 7.0至8.3下是小于约 1.5M Na离子、典型地约0.01至l.OM Na离子浓度(或其他盐类），并且温度对于短探针（例 如，10至50个核苷酸)为至少约30 °C，而对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60 °C。 还可以通过加入去稳定剂（如甲酰胺)实现严格条件。示例性低严格条件包括在37°C下在 30%至35%甲酰胺、1M NaCl、l%SDS(十二烷基硫酸钠）的缓冲溶液中进行杂交以及在50°C 至55°C下在IX至2X SSC(20X SSC = 3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)进行洗涤。示例性中等严 格条件包括在37°C下在40%至45%甲酰胺、1.0M NaCl、1 % SDS中进行杂交以及在55°C至60 °C下在0.5X至IX SSC中进行洗涤。示例性高严格条件包括在37°C下在50%甲酰胺、1M NaCl、1 % SDS中进行杂交以及在60°C至65°C下在0.1 X SSC中进行洗涤。任选地，洗涤缓冲液 可包括约0.1 %至约1 % SDS。杂交的持续时间通常是小于约24小时，通常为约4至约12小时。
[0040] 特异性典型地取决于杂交后洗涤的功能，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以 及温度。对于0嫩-0嫩杂合体，1"可以从迈因科思(]\^111?^)和瓦尔(13111)(1984)分析生物 化学(Anal. Biochem. )138:267-284 的等式中进行估计：Im=81.5°C+16.6(log M)+0.41( % GC)-0.61 ( %form)-500/L;其中Μ是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是在DNA中鸟苷和胞嘧啶 核苷酸的百分比，％f〇rm是在杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是以碱基对计的杂合体的 长度。1?是50%的互补靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度（在限定的离子强度及pH 下）。对于每1%错配，Tm降低约1°C;因此，可调整1"、杂交的和/或洗涤的条件以便杂交至具 有所希望的一致性的序列。例如，如果找到具有>90 % -致性的序列，则Tm可以降低10 °C。一 般来说，将严格条件选择为比特定序列及其补体在限定的离子强度以及pH下的热熔点(Tm) 低约5°C。然而，极严格条件可利用低于热熔点(T m)rC、2°C、3°C或4°C的杂交和/或洗涤；中 等严格条件可利用低于热熔点(!^)6°(：、7°(：、8°(：、9°(：或10°(：的杂交和/或洗涤;低严格条件 可利用低于热熔点（Im) 11°C、12°C、13°C、14°C、15°C或20°C的杂交和/或洗涤。使用该方程、 杂交和洗涤组成以及所希望的T m，本领域普通技术人员应理解，杂交的和/或洗涤的溶液严 格性的变化固有地得到了描述。如果所希望的错配程度导致小于45°C (水性溶液)或32°C (甲酰胺溶液）的Tm，则优选增加 SSC浓度，这样使得可以使用更高的温度。对核酸杂交的广 泛指导见于以下文献:泰森(TijSSen)(1993)生物化学和分子生物学中的实验室技术-使用 核酉爱探针杂交（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)，第I部分，第2章（愛思唯尔（Elsevier)，纽 约）；以及奥苏贝尔(Ausubel)等人编著（1995)现代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)，第2章（格林出版社和威力出版社（Greene Publishing and Wiley-Interscience)，纽约）。参见，萨姆布鲁克等人（1989)分子克隆：实验室手册（第二 版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）。
[0041] 分离的蛋白质及其变体和片段
[0042] 杀有害生物蛋白也涵盖于本发明之内。"杀有害生物蛋白"是指具有SEQ ID N0: 2-3中所列出的氨基酸序列的一种蛋白。还提供了它的片段、生物活性部分以及变体，并且它 们可以用于实践本发明的方法。"分离的蛋白"或"重组的蛋白"被用于指代一种蛋白质，该 蛋白质不再存在于它的自然环境中（例如，在体外或在重组体细菌或植物宿主细胞中）。在 一些实施例中，该重组蛋白是SEQ ID N0: 2-5的变体，其中该变体相对于SEQ ID N0: 2-5包 含至少一个氨基酸置换、缺失、或插入。
[0043] "片段"或"生物活性部分"包括以下多肽片段，这些多肽片段包含与SEQ ID N0:2- 3中列出的氨基酸序列足够地一致的氨基酸序列，并且展示出杀有害生物活性。杀有害生物 蛋白的生物活性部分可以是以下多肽，该多肽的长度例如为10、25、50、100、150、200、250、 300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、 1200、1250、1300、1350个、或更多个氨基酸。可以通过重组技术制备这样的生物活性部分， 并且对它们的杀有害生物活性进行评估。用于测量杀有害生物活性的方法在本领域是熟知 的。参见例如查普拉(Czapla)和朗（1^即）（1990)经济昆虫学杂志（1』(：〇11上1^〇111〇1.)83 : 2480-2485;安德鲁斯(Andrews)等人（1988)生物化学杂志（Biochem.J. )252:199-206;马罗 内（Marrone)等人（1985)经济昆虫学杂志（J.of Economic Entomology)78: 290-293;以及 美国专利号5,743,477，所有这些文献都通过引用以其全文结合在此。如在此所使用的，一 个片段包含SEQ ID N0:2-3的至少8个连续的氨基酸。然而，本发明涵盖了其他片段，如在长 度大于约 10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、 800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350个、或更多个氨基酸的蛋 白质中的任何片段。
[0044] "变体"是指具有与SEQ ID N0: 2-3中任一项的氨基酸序列至少约60%、65%、约 70%、75%、约80%、85%、约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99% - 致的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体还包括由与SEQ ID NO: 1的核酸分子或其互补物在 严格条件下杂交的核酸分子编码的多肽。变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的多 肽。由本发明所涵盖的变体蛋白是生物活性的，即它们继续具有所希望的天然蛋白的生物 活性，即保留了杀有害生物活性。在一些实施例中，这些变体相对于天然蛋白具有改进的活 性。用于测量杀有害生物活性的方法在本领域是熟知的。参见例如查普拉（Czapla)和朗 (Lang) (1990)经济昆虫学杂志（J.Econ.Entomol ·)83:2480-2485;安德鲁斯(Andrews)等人 (1988)生物化学杂志(Biochem.J. )252:199-206;马罗内（Marrone)等人（1985)经济昆虫学 杂志（J.of Economic Entomology)78:290-293;以及美国专利号5,743,477,所有这些文献 都通过引用以其全文结合在此。
[0045] 细菌基因（如本发明的axmi基因）在开放阅读框的起始附近常常具有多个甲硫氨 酸起始密码子。经常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始将导致一种功能蛋 白的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌（如，芽孢杆菌）还将该密码子 GTG识别为一个起始密码子，并且在GTG密码子上起始翻译的蛋白质在第一个氨基酸上包括 一个甲硫氨酸。在少数情况下，细菌系统中的翻译可以在TTG密码子处启动，尽管在这种情 况下TTG编码一个甲硫氨酸。此外，常常不首先确定这些密码子中的哪一些在细菌中自然地 使用。因此，应当理解，使用这些可替代的甲硫氨酸密码子之一也可能导致杀有害生物蛋白 的产生。这些杀有害生物蛋白涵盖于本发明之中，并且可以在本发明的这些方法中使用。应 当理解的是当在植物中表达时将有必要将替代起始密码子改变为ATG以用于正确的翻译。
[0046] 在本发明的不同实施例中，杀有害生物蛋白包括从在此披露的全长核苷酸序列中 推导出的氨基酸序列、以及由于使用替代的下游起始位点而比这些全长序列更短的氨基酸 序列。因此，本发明的核苷酸序列和/或包含本发明的核苷酸序列的载体、宿主细胞以及植 物（以及制备和使用本发明的核苷酸序列的方法)可以包含编码与SEQ ID N0:3、4、或5相应 的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0047] 还涵盖了针对本发明的多肽、或它们的变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法 在本领域是熟知的（参见，例如哈洛（Har 1 ow)和拉内（Lane) (1988)抗体：实验室手册 (Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；美国专利号4,196， 265) 〇
[0048] 因此，本发明一方面涉及与本发明的蛋白或肽分子中的一种或多种以及它们的同 源物、融合物或片段特异性结合的抗体、单链抗原结合分子、或其他蛋白。在一个特别优选 的实施例中，该抗体与具有SEQ ID N0:2-3中列出的氨基酸序列的蛋白或其片段特异性地 结合。在另一个实施例中，该抗体与包含选自SEQ ID N0:2-3中列出的氨基酸序列的一个氨 基酸序列的融合蛋白或其片段特异性地结合。在不同的实施例中，与本发明蛋白或包含本 发明蛋白的融合蛋白特异性地结合的抗体是非天然存在的抗体。
[0049] 本发明的抗体可以用于定量地或定性地检测本发明的蛋白或肽分子、或者检测这 些蛋白的翻译后修饰。如在此所使用的，如果一种抗体或肽与本发明的一种蛋白或肽分子 的结合不被非相关分子的存在竞争性地抑制，则将这种结合称为"特异性地结合"。
[0050] 本发明的抗体可以被包含在一个试剂盒中，该试剂盒用于检测本发明的蛋白或肽 分子。本发明进一步包括一种检测本发明的蛋白或肽分子(特别是由SEQ ID N0:2-3中列出 的氨基酸序列编码的一种蛋白，包括能够特异性结合到本发明的抗体的变体或片段）的方 法