一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法
【专利摘要】本发明公开了一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，步骤包括：A、选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种；B、对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料；C、在制种前一周停浇水、肥、药，保持花梗干净；D、花梗腋芽的诱导，在诱导腋芽形成的培养基中进行诱导；E、类原球体的诱导；F、类原球体的增殖；G、芽体的分化、壮苗及生根；本发明通过在蝴蝶兰类原球茎体的诱导和增殖中关键阶段运用适当的操作工艺，从而达到快速诱导、增殖和分化成芽的目的，该发明的运用有效地建立了的蝴蝶兰品种的类原球茎体，通过类原球茎体的快速增殖从而达到蝴蝶兰试管苗工厂化生产的开展。
【专利说明】
-种促使蝴蝶兰类原球茎体快速増殖培养蝴蝶兰的方法
技术领域
[0001] 本发明设及植物栽培及育苗技术领域，尤其设及一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速 增殖培养蝴蝶兰的方法。
【背景技术】
[0002] 蝴蝶兰(Phalaenopsis)属兰科多年生植物，是世界上栽培最广泛、最普及的洋兰 品种之一，由于其花大、色艳，开花期长达2~3个月，而素有"洋兰皇后"的美称。随着近年来 蝴蝶兰价格的降低，蝴蝶兰更是成为普通市民年宵花优选的盆花之一，销量逐年增加。随着 蝴蝶兰品种的普及，市场对花色、品质的要求越来越高，后代分离严重的播种苗已开始退出 市场，代之的是高品质的、花色统一的无性苗。近几年来流行和杨销的品种有"大辣椒"、"红 太阳"、"内山姑娘"、"火鸟"、"红龙"、"超群9号"等，而运些品种无一不是通过花梗诱导而成 的组培苗栽培形成的。
[0003] 通过花梗诱导侧芽萌发，再通过侧芽繁殖组培苗的方法有两种途径。一是通过侧 芽诱导丛生芽生产，再通过芽生芽的方式进行增殖，从而达到快繁的目的；二是通过花梗侧 芽或叶片诱导类原球茎体(Protocorm-like bodies,简称化B)发生，再经类原球茎体的增 殖、分化成苗，从而达到快繁的目的。通过芽生芽的方式繁殖速度较慢，且基部产生的褐化 物质较多，制约着蝴蝶兰无性繁殖速度；W无菌苗叶片作为外植体材料诱导类原球茎体的 途径，在生产实际中也存在着一些技术难题，一是不同品种诱导类原球茎体的难易程度不 同，某些品种的叶片较易诱导类原球茎体，而某些品种很难诱导;二是类原球茎体在生长过 程中极易形成单个芽体从而影响增殖速度;Ξ是产生褐化组织较多，抑制培养体的生产速 度甚至使之死亡。由于运些问题的存在，极大地制约了蝴蝶兰组培苗无性繁殖速度，从而影 响种苗工厂化生产的进程。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供一种操作简单，产生经济价值高的紫香兰组培快繁方法。
[0005] 本发明目的通过W下技术方案来予W实现： 一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，步骤包括： A、 选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种，包括："大辣椒"、"红太阳"、"内 山姑娘"、"富乐夕阳"、"沙拉黄金"、"小白兔"等品种； B、 对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料； C、 在制种前一周停诱水、肥、药，保持花梗干净； D、 花梗蔽芽的诱导，在诱导蔽芽形成的培养基中进行诱导； E、 类原球体的诱导； F、 类原球体的增殖； G、 芽体的分化、壮苗及生根； 所述步骤D具体包括； (1) 采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花薩按重量计的0.5%的洗衣 粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟;在洁净工作台上，用刀片小屯、去除所述花梗节 位上蔽芽的外巷片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成l-2cm长度的茎段，每 一段包含一个节位;将所述花梗节段放入0.10%升隶溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断 摇动;然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟；后浸入无菌水中备 用； (2) 将消毒好的所述花梗节段切除两头受升隶侵害的部分，并将所述茎段的极性基部 插入诱导蔽芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上;每瓶1个茎段； (3) 培养条件:前7~14 d黑暗培养，溫度24~26°C; 10 d后，光强提到12.5~18.75皿〇1· nf2.s-i，继续培养20~30 d; 所述步骤G具体为:当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将 类原球茎体转移到芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS +香蕉泥5~10% +马铃馨泥3~ 5%+白糖2.5~3%;抑值为5.4~5.6;每30~40 d继代培养一次;所述类原球茎体的茎尖发芽并 长出芽体，将所述芽体切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养；当芽体生长出两片叶， 并且每片叶大小在IcmW上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中；不达标的植株在 分化培养基中继续培养;培养条件为:光照强度31.25~37.5皿〇1 ·πΓ2 · S-1，光照时间12 h · d -1，溫度为24~28°C;生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出^2条根系，并且生长较为健 壮时，可W出瓶种植。
[0006] 所述步骤E具体为：当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至 1.0-1.5 cm芽体时，将所述芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中屯、生长点W下0~ 0.2cm的位置，目的是破坏所述芽体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所 述幼嫩组织周边产生；去除所述花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的 所述芽体转入诱导培养基中，培养条件为:前7~14天黑暗培养;待新鲜切面开始膨大时，将 光照强度调到5~12.5皿〇1 ·πΓ2 · S-1，光照时间12 h· cfi，溫度为24~26°C ;培养周期20~25天； 所述芽体块在诱导培养基上培养约10~15天左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染 黑，此时将所述芽体转移到同个培养瓶中的不同培养基表面上，每5~10 d变换一个区域，W 减少所述褐化物质对培养材料的浸害；如此重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质 时，将所述芽体转移至新的培养基中，约30~40左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球 茎体。
[0007] 所述步骤F具体为：当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述 类原球茎体的组织块切下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中屯、生 长点部位约±0.2cm的位置切去顶部，目的是破坏所述类原球茎体的生长点使幼嫩组织暴 露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。将带有新鲜切面的所述类原球茎体 放入一级增殖培养基中，所述一级增殖培养基为液体培养基，并在每分钟60~120次转速的 摇床上旋转培养5~10 d，使所述类原球体的表面充分吸收到营养并且减少后期培养中褐化 组织的产生。之后将所述类原球茎体转入二级增殖培养基中继续培养20~25 d，此时可见所 述类原球茎体在幼嫩切面上及周围长出数个大小不等的新的类原球茎体。当所述新的类原 球茎体直径长到0.4~0.5cm大小时，将所述新的类原球茎体顶端去掉，切割深度达到生长点 部位约±0.2cm位置，并且连同所述的类原球茎体一起转入所述一级增殖培养基中，进行液 体旋转培养，之后转入所述二级增殖培养基中，液体和固体培养基反复培养，继代周期30~ 35 d。如此反复，直到获得足够的类原球茎体;培养条件为:光照强度18.75~25 μπιο? ·πΓ2· s-i，光照时间12 h · d-i，溫度为24~28°C。
[000引所述一级增殖培养基为：1/2MS+BA^5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1 ~0.5 mg/L +挪子水50~150ml/L+白糖25g/L。
[0009] 所述二级增殖培养基为固体培养基，成分为：1/2MS+BA1~5mg/L +KT 0.5~3 mg/L +NAA0.^0.5 mg/L + 挪子水50~150ml/L+白糖25g/L+琼脂5.5g/L。
[0010] 本发明的有益效果:在花梗芽诱导形成后或在类原球体形成后，切割位置位于生 长点部位，目的是破坏具有顶端优势的生长点组织，促使生长点周围幼嫩组织细胞增殖，从 而诱导新的或更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。蝴蝶兰丛生芽或类原球茎体在 诱导阶段和增殖阶段均易于产生褐化组织，通过前期暗培养和快速变换芽体或类原球茎体 位置的方法，有利于减少褐化物质的产生，避免芽体或类原球茎体受到褐化物质的浸害。
[0011] 本发明通过在蝴蝶兰类原球茎体的诱导和增殖中关键阶段运用适当的操作工艺， 从而达到快速诱导、增殖和分化成芽的目的，该发明的运用有效地建立了的蝴蝶兰品种的 类原球茎体，通过类原球茎体的快速增殖从而达到蝴蝶兰试管苗工厂化生产的开展。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合具体实施例来进一步说明本发明。
[oou]实施例一 A、 选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种，包括："大辣椒"、"红太阳"、"内 山姑娘"、"富乐夕阳"、"沙拉黄金"、"小白兔"等品种； B、 对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料； C、 在制种前一周停诱水、肥、药，保持花梗干净； D、 花梗蔽芽的诱导： (1) 采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花薩按重量计的0.5%的洗衣 粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟。在洁净工作台上，用刀片小屯、去除所述花梗节 位上蔽芽的外巷片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成l-2cm长度的茎段，每 一段包含一个节位。将所述花梗节段放入0.10%升隶溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断 摇动。然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟。后浸入无菌水中备 用； (2) 将消毒好的所述花梗节段切除两头受升隶侵害的部分，并将所述茎段的极性基部 插入诱导蔽芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上。每瓶1个茎段。（3) 培养条件:前7 d黑暗培养，溫度24~26°C;10 d后，光强提到12.5~18.75μπιο1·πΓ2·3-ι^0? 续培养20~30 d; E、 类原球体的诱导： 当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-1.5 cm芽体时，将所述 芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中屯、生长点或W下0cm的位置，目的是破坏所述芽 体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。去除所述 花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽体转入诱导培养基中，培 养条件为：前7 d黑暗培养。待新鲜切面开始膨大时，将光照强度调到扣πιο1·πΓ2·3-ι，光照 时间12 h · cfi，溫度为24~26°C。培养周期20~25 d。所述芽体块在诱导培养基上培养约10~ 15 d左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时将所述芽体转移到同个培养瓶中 的不同培养基表面上，每5 d变换一个区域，W减少所述褐化物质对培养材料的浸害。如此 重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所述芽体转移至新的培养基中，约30~ 40 d左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。
[0014] F:原球体的增殖： 当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类原球茎体的组织块切 下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中屯、生长点部位约±0.2cm的位 置切去顶部，目的是破坏所述类原球茎体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎 体从所述幼嫩组织周边产生。将带有新鲜切面的所述类原球茎体放入一级增殖培养基中， 一级增殖培养基为：1/2MS+BA1 ~5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1 ~0.5 mg/L + 挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L。所述一级增殖培养基为液体培养基，并在每分钟60~120次转速的摇床 上旋转培养5~10 d，使所述类原球体的表面充分吸收到营养并且减少后期培养中褐化组织 的产生。之后将所述类原球茎体转入二级增殖培养基中继续培养20~25 d，二级增殖培养基 为固体培养基，成分为：1/2MS+BA1~5mg/L +KT0.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L+琼脂5.5g/L。此时可见所述类原球茎体在幼嫩切面上及周围长出数个 大小不等的新的类原球茎体。当所述新的类原球茎体直径长到0.4~0.5cm大小时，将所述新 的类原球茎体顶端去掉，切割深度达到生长点部位约± 0.2cm位置，并且连同所述的类原球 茎体一起转入所述一级增殖培养基中，进行液体旋转培养，之后转入所述二级增殖培养基 中，液体和固体培养基反复培养，继代周期30~35 d。如此反复，直到获得足够的类原球茎 体;培养条件为:光照强度18.75~25皿〇1-111-2*3-1，光照时间12}1'(1-1，溫度为24~28°(：。
[0015] G、芽体的分化、壮苗及生根： 当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将类原球茎体转移到 芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS +香蕉泥5~10%+马铃馨泥3~5%+白糖2.5~3%。抑值 为5.4~5.6。每30~40 d继代培养一次。所述类原球茎体的茎尖发芽并长出芽体，将所述芽体 切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养。当芽体生长出两片叶，并且每片叶大小在1cm W上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中。不达标的植株在分化培养基中继续培 养。培养条件为:光照强度31.25~37.5 4111〇1-111-2*3-1，光照时间12}1'(1-1，溫度为24~28°(：。 生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可W出瓶种 植。
[0016] 实施例二 A、 选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种，包括："大辣椒"、"红太阳"、"内 山姑娘"、"富乐夕阳"、"沙拉黄金"、"小白兔"等品种； B、 对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料； C、 在制种前一周停诱水、肥、药，保持花梗干净； D、 花梗蔽芽的诱导： (1)采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花薩按重量计的0.5%的洗衣 粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟。在洁净工作台上，用刀片小屯、去除所述花梗节 位上蔽芽的外巷片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成l-2cm长度的茎段，每 一段包含一个节位。将所述花梗节段放入0.10%升隶溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断 摇动。然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟。后浸入无菌水中备 用； (2)将消毒好的所述花梗节段切除两头受升隶侵害的部分，并将所述茎段的极性基部 插入诱导蔽芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上。每瓶1个茎段。（3) 培养条件：前10 d黑暗培养，溫度24~26°C;10 d后，光强提到12.5~18.75皿〇1-111^，3^， 继续培养20~30 d; E.类原球体的诱导： 当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-1.5 cm芽体时，将所述 芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中屯、生长点W下0.1cm的位置，目的是破坏所述芽 体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。去除所述 花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽体转入诱导培养基中，培 养条件为:前10 d黑暗培养。待新鲜切面开始膨大时，将光照强度调到10 μπιο1·πΓ2·3-ι，光 照时间12 h · cfi，溫度为24~26°C。培养周期20~25 d。所述芽体块在诱导培养基上培养约10 ~15 d左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时将所述芽体转移到同个培养瓶 中的不同培养基表面上，每7 d变换一个区域，W减少所述褐化物质对培养材料的浸害。如 此重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所述芽体转移至新的培养基中，约30 ~40 d左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。
[0017] F、类原球体的增殖： 当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类原球茎体的组织块切 下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中屯、生长点部位约±0.2cm的位 置切去顶部，目的是破坏所述类原球茎体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎 体从所述幼嫩组织周边产生。将带有新鲜切面的所述类原球茎体放入一级增殖培养基中， 一级增殖培养基为：1/2MS+BA1 ~5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1 ~0.5 mg/L + 挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L。所述一级增殖培养基为液体培养基，并在每分钟60~120次转速的摇床 上旋转培养5~10 d，使所述类原球体的表面充分吸收到营养并且减少后期培养中褐化组织 的产生。之后将所述类原球茎体转入二级增殖培养基中继续培养20~25 d，二级增殖培养基 为固体培养基，成分为：1/2MS+BA1~5mg/L+KT0.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L+琼脂5.5g/L。此时可见所述类原球茎体在幼嫩切面上及周围长出数个 大小不等的新的类原球茎体。当所述新的类原球茎体直径长到0.4~0.5cm大小时，将所述新 的类原球茎体顶端去掉，切割深度达到生长点部位约± 0.2cm位置，并且连同所述的类原球 茎体一起转入所述一级增殖培养基中，进行液体旋转培养，之后转入所述二级增殖培养基 中，液体和固体培养基反复培养，继代周期30~35 d。如此反复，直到获得足够的类原球茎 体;培养条件为:光照强度18.75~25皿〇1-111-2*3-1，光照时间12}1'(1-1，溫度为24~28°(：。
[0018] G、芽体的分化、壮苗及生根： 当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将类原球茎体转移到 芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS +香蕉泥5~10%+马铃馨泥3~5%+白糖2.5~3%。抑值 为5.4~5.6。每30~40 d继代培养一次。所述类原球茎体的茎尖发芽并长出芽体，将所述芽体 切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养。当芽体生长出两片叶，并且每片叶大小在1cm W上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中。不达标的植株在分化培养基中继续培 养。培养条件为:光照强度31.25~37.5 4111〇1-111-2*3-1，光照时间12}1'(1-1，溫度为24~28°(：。 生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可W出瓶种 植。
[0019] 实施案例立 A、 选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种，包括："大辣椒"、"红太阳"、"内 山姑娘"、"富乐夕阳"、"沙拉黄金"、"小白兔"等品种； B、 对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料； C、 在制种前一周停诱水、肥、药，保持花梗干净； D、 花梗蔽芽的诱导： (1) 采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花薩按重量计的0.5%的洗衣 粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟。在洁净工作台上，用刀片小屯、去除所述花梗节 位上蔽芽的外巷片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成l-2cm长度的茎段，每 一段包含一个节位。将所述花梗节段放入0.10%升隶溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断 摇动。然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟。后浸入无菌水中备 用； (2) 将消毒好的所述花梗节段切除两头受升隶侵害的部分，并将所述茎段的极性基部 插入诱导蔽芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上。每瓶1个茎段。
[0020] (3)培养条件：前14 d黑暗培养，溫度24~26°C; 10 d后，光强提到12.5~18.75μ mol · πΓ2 · S-1，继续培养20~30 d; E、 类原球体的诱导： 当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-1.5 cm芽体时，将所述 芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中屯、生长点W下0.2cm的位置，目的是破坏所述芽 体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。去除所述 花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽体转入诱导培养基中，培 养条件为:前14 d黑暗培养。待新鲜切面开始膨大时，将光照强度调到12.5皿ο1·πΓ2·3^ι， 光照时间12 h-cfi，溫度为24~26Γ。培养周期20~25 d。所述芽体块在诱导培养基上培养约 10~15 d左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时将所述芽体转移到同个培养 瓶中的不同培养基表面上，每10 d变换一个区域，W减少所述褐化物质对培养材料的浸害。 如此重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所述芽体转移至新的培养基中，约 30~40 d左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。
[0021] F、类原球体的增殖： 当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类原球茎体的组织块切 下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中屯、生长点部位约±0.2cm的位 置切去顶部，目的是破坏所述类原球茎体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎 体从所述幼嫩组织周边产生。将带有新鲜切面的所述类原球茎体放入一级增殖培养基中， 一级增殖培养基为：1/2MS+BA1 ~5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1 ~0.5 mg/L + 挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L。所述一级增殖培养基为液体培养基，并在每分钟60~120次转速的摇床 上旋转培养5~10 d，使所述类原球体的表面充分吸收到营养并且减少后期培养中褐化组织 的产生。之后将所述类原球茎体转入二级增殖培养基中继续培养20~25 d，二级增殖培养基 为固体培养基，成分为：1/2MS+BA1~5mg/L +KT0.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L+琼脂5.5g/L。此时可见所述类原球茎体在幼嫩切面上及周围长出数个 大小不等的新的类原球茎体。当所述新的类原球茎体直径长到0.4~0.5cm大小时，将所述新 的类原球茎体顶端去掉，切割深度达到生长点部位约± 0.2cm位置，并且连同所述的类原球 茎体一起转入所述一级增殖培养基中，进行液体旋转培养，之后转入所述二级增殖培养基 中，液体和固体培养基反复培养，继代周期30~35 d。如此反复，直到获得足够的类原球茎 体;培养条件为:光照强度18.75~25皿〇1-111-2*3-1，光照时间12}1'(1-1，溫度为24~28°(：。
[0022] G、芽体的分化、壮苗及生根： 当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将类原球茎体转移到 芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS +香蕉泥5~10%+马铃馨泥3~5%+白糖2.5~3%。抑值 为5.4~5.6。每30~40 d继代培养一次。所述类原球茎体的茎尖发芽并长出芽体，将所述芽体 切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养。当芽体生长出两片叶，并且每片叶大小在1cm W上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中。不达标的植株在分化培养基中继续培 养。培养条件为:光照强度31.25~37.5 4111〇1-111-2*3-1，光照时间12}1'(1-1，溫度为24~28°(：。 生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可W出瓶种 植。
[0023] 对比例1 A、 选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种，包括："大辣椒"、"红太阳"、"内 山姑娘"、"富乐夕阳"、"沙拉黄金"、"小白兔"等品种； B、 对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料； C、 在制种前一周停诱水、肥、药，保持花梗干净； D、 花梗蔽芽的诱导： (1) 采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花薩按重量计的0.5%的洗衣 粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟。在洁净工作台上，用刀片小屯、去除所述花梗节 位上蔽芽的外巷片，并用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成l-2cm长度的茎段，每 一段包含一个节位。将所述花梗节段放入0.10%升隶溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断 摇动。然后将所述花梗节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟。后浸入无菌水中备 用； (2) 将消毒好的所述花梗节段切除两头受升隶侵害的部分，并将所述茎段的极性基部 插入诱导蔽芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上。每瓶1个茎段。（3) 培养条件，自然光照，溫度24~26°(：;10(1后，光强改为12.5~18.75皿〇1-111-2*3-1，继续培 养20~30 d; E、 类原球体的诱导： 当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-1.5 cm芽体时，将所述 芽体的顶端去掉，切割部位位于所述芽体中屯、生长点W下3cm的位置，目的是破坏所述芽体 的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生。去除所述花 梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽体转入诱导培养基中，培养 条件为：自然光照培养。待新鲜切面开始膨大时，将光照强度调到25μπιο1 ·πΓ2 · s^i，光照时 间12 h · cfi，溫度为24~26°C。培养周期20~25 d。所述芽体块在诱导培养基上培养约10~15 d左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时将所述芽体转移到同个培养瓶中的 不同培养基表面上，每5 d变换一个区域，W减少所述褐化物质对培养材料的浸害。如此重 复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所述芽体转移至新的培养基中，约30~40 d左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。
[0024] F:原球体的增殖： 当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类原球茎体的组织块切 下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中屯、生长点部位W下0cm的位置 切去顶部，目的是破坏所述类原球茎体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体 从所述幼嫩组织周边产生。当所述增殖培养基表面变色时，将所述类原球茎体转移到同个 培养瓶中的不同培养基表面上，每5~7 d变换一个区域，W减少所述褐化物质对培养材料的 浸害。培养周期30~35 d，如此反复，直到获得足够的类原球茎体。培养条件为：光照强度 18.75~25皿〇1.111-2.3-1，光照时间12}1.(1-1，溫度为24~28°(：。
[00巧]G、芽体的分化、壮苗及生根： 当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将类原球茎体转移到 芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS +香蕉泥5~10%+马铃馨泥3~5%+白糖2.5~3%。抑值 为5.4~5.6。每30~40 d继代培养一次。所述类原球茎体的茎尖发芽并长出芽体，将所述芽体 切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养。当芽体生长出两片叶，并且每片叶大小在1cm W上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中。不达标的植株在分化培养基中继续培 养。培养条件为:光照强度31.25~37.5 4111〇1-111-2*3-1，光照时间12}1'(1-1，溫度为24~28°(：。 生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可W出瓶种 植。
[0026]将W上实施例培养的瓶苗1周后移至花盆栽培，通过W下表格对实施例中的结果 进行统计和对比如下：
由实施例数据看w看出，经过本发明培养的蝴蝶兰新苗较为健壮，炼苗后成活率高，与 对比例相比，实施例1-3与对比例相比有更多的类原球茎体从所述幼嫩组织周边产生，并且 苗成活率较高，所W本发明具有极高的推广价值。
[0027] W上所述并非对本新型的技术范围作任何限制，凡依据本发明技术实质对W上的 实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，其特征在于，步骤包括： A、 选用适合的蝴蝶兰品种花梗作为作种的蝴蝶兰品种； B、 对所述作种的蝴蝶兰品种母株的花梗作为外植体材料； C、 在制种前一周停浇水、肥、药，保持花梗干净； D、 花梗腋芽的诱导，在诱导腋芽形成的培养基中进行诱导； E、 类原球体的诱导； F、 类原球体的增殖； G、 芽体的分化、壮苗及生根； 所述步骤D具体包括； (1) 采回的所述花梗，在自来水下冲洗干净，并用湿脱脂棉花蘸按重量计的0.5%的洗衣 粉水轻擦表面，再在自来水下冲洗5~10分钟；用刀片去除所述花梗节位上腋芽的外苞片，并 用75%的酒精轻擦表面，然后将所述花梗切割成l-2cm长度的茎段，每一段包含一个节位;将 所述花梗节段放入0.10%升汞溶液中进行浸泡消毒8~10分钟，并不断摇动;然后将所述花梗 节段取出，在无菌水中漂洗4~5次，每次2~3分钟;后浸入无菌水中备用； (2) 将消毒好的所述花梗节段切除两头受升汞侵害的部分，并将所述茎段的极性基部 插入诱导腋芽形成的培养基中，使节位上的芽点保留在培养基的表面上;每瓶1个茎段； (3) 培养条件:前7~14 d黑暗培养，温度24~26°C;10 d后，光强提到12.5~18.75μπιο1·πι 一2.s-S继续培养20~30 d; 所述步骤G具体为：当所述类原球茎体在增殖培养基上增殖达到一定的库存数量时，将 类原球茎体转移到芽体分化培养基上，分化培养基为1/2MS +香蕉泥5~10% +马铃薯泥3~ 5%+白糖2.5~3%; pH值为5.4~5.6;每30~40 d继代培养一次;所述类原球茎体的茎尖发芽并 长出芽体，将所述芽体切下继续在所述分化培养基上进行壮苗培养；当芽体生长出两片叶， 并且每片叶大小在Icm以上时，从基部将植株切下，转移至生根培养基中；培养条件为:光照 强度31 · 25~37 · 5μπιο1 .m-2. s-1，光照时间12 h. d-1，温度为24~28°C ;生根苗培养周期50~60 d，当所述植株长出1~2条根系，并且生长较为健壮时，可以出瓶种植。2. 根据权利要求1所述的促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，其特征 在于:所述步骤E具体为：当作为外植体的所述花梗茎段节位上的芽点萌发形成高至1.0-?. 5 cm 芽体时 ，将所述芽体的顶端去掉 ，切割部位位于所述芽体中 心生长点以下0~0. 2cm 的 位置，目的是破坏所述芽体的生长点使幼嫩组织暴露，诱导更多的类原球茎体从所述幼嫩 组织周边产生;去除所述花梗基部褐化的部分，将连着所述花梗的带有新鲜切面的所述芽 体转入诱导培养基中，培养条件为:前7~14天黑暗培养;待新鲜切面开始膨大时，将光照强 度调到1~12.5μπιο1.m- 2. s-1，光照时间12 h. d-1，温度为24~26°C ;培养周期20~25天;所述芽 体块在诱导培养基上培养约10~15天左右，褐化物质开始形成，并将培养基表面染黑，此时 将所述芽体转移到同个培养瓶中的不同培养基表面上，每5~10 d变换一个区域，以减少所 述褐化物质对培养材料的浸害;如此重复，直到整个培养基表面都有较多褐化物质时，将所 述芽体转移至新的培养基中，约30~40左右所述芽体切面上长出数个幼嫩的类原球茎体。3. 根据权利要求1所述的促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，其特征 在于:所述步骤F具体为：当所述类原球茎体长到高度达0.3~0.8 cm时，将带有数个所述类 原球茎体的组织块切下，去除周边褐化组织及老的组织块，并在所述类原球茎体中心生长 点部位约±0.2cm的位置切去顶部，将带有新鲜切面的所述类原球茎体放入一级增殖培养 基中，所述一级增殖培养基为液体培养基，并在每分钟60~120次转速的摇床上旋转培养5~ 10 d，之后将所述类原球茎体转入二级增殖培养基中继续培养20~25 d，此时可见所述类原 球茎体在幼嫩切面上及周围长出数个大小不等的新的类原球茎体； 当所述新的类原球茎体直径长到〇. 4~0.5cm大小时，将所述新的类原球茎体顶端去掉， 切割深度达到生长点部位约±0.2cm位置，并且连同所述的类原球茎体一起转入所述一级 增殖培养基中，进行液体旋转培养，之后转入所述二级增殖培养基中，液体和固体培养基反 复培养，继代周期30~35 d; 如此反复，直到获得足够的类原球茎体;培养条件为:光照强度18.75~25 μπιο? · Hf2 · s-1，光照时间12 h · d-1，温度为24~28°C。4. 根据权利要求3所述的促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，其特征 在于:所述一级增殖培养基为：1/2MS+BA1~5 mg/L+KTO.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +椰子 水 50~150ml/L+白糖 25g/L。5. 根据权利要求3所述的促使蝴蝶兰类原球茎体快速增殖培养蝴蝶兰的方法，其特征 在于：所述二级增殖培养基为固体培养基，成分为：1/2MS+BA1~5mg/L+KT 0.5~3 mg/L + NAA0.1~0.5 mg/L + 椰子水50~150ml/L+白糖25g/L+琼脂5.5g/L。
【文档编号】A01H4/00GK105875414SQ201610412905
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】陈春满, 张善信
【申请人】陈春满, 张善信