专利名称：一种同时抽提体液中病原体rna和dna的方法及其专用的抽提液的制作方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域，涉及诊断基因芯片，尤其涉及一种同时抽提体液尤其是血液中中病原体RNA和DNA的方法，。
基因芯片是二十世纪九十年代发展起来的一项前沿生物技术。将大量的靶基因片段有序地、高密度地(点与点之间的距离一般小于500μm)排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。
美国affymetrix公司于二十世纪八十年代末至90年代初，率先开展了这方面的研究(Fodor,S.P.A.et al.(1991)Science 251,767-773.)。1992年，该公司运用半导体照相平板技术，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，诞生了世界上第一块基因芯片(Southern,E.,Maskos,U.&Elder,R.(1992)Genomics 13,1008-1017.)。同时，探针的荧光标记，激光共聚焦扫描(U.S Patent 5981965)和计算机分析(U.S Patent 5974164)等技术也随之发展。1995年，第一块以玻璃为载体的基因芯片(微矩阵)在美国Stanford大学诞生(Schena,M.等(1995)Science.270.(20):467-480.)，这标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的时期。
原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限，因而基因特异性差，而且随长度的增加合成错误率随之增高，作为基因表达谱研究远不如cDNA芯片。cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，也叫微矩阵(Microarray)(DeRisi,J.等(1997)Science278,680-686.)。基因点样密度虽不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用传统载体，如混合纤维素滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张载玻片4万个基因。而cDNA芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，用作表达谱研究结果可靠。目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片(Baldwin,D等(1999)Curr Opin Plant Biol 2(2):96-103.)。
基因芯片最早是由于高通量、大规模研究基因功能的需求而产生的，但随着基因芯片技术的日渐成熟，人们惊喜地发现基因芯片在传染性疾病和遗传病的诊断上有独特的应用前景和巨大的商业市场。感染性病原体诊断芯片就是将待测病原体的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，将从病人血清中抽提出病原体的DNA或RNA经扩增标记荧光后与芯片进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描，再经计算机分析，判断阴阳性。诊断芯片区别于其他检测手段的优越性在于(1)检测样品为各类致病基因片段，提高了检测效率；(2)因无需机体免疫反应，能及早诊断，且待测样品用量较少；(3)诊断芯片技术是DNA杂交技术和荧光标记技术相结合的分子诊断方法，有极高的灵敏度、特异性和可靠性；
(4)自动化程度高，利于大规模推广应用。在疾病诊断方面，已有一些单一疾病基因诊断芯片产品上市，例如美国的Affymetrix公司已利用基因芯片进行爱滋病病毒(HIV)的研究工作，并有商业化的GeneChip HIV PRT诊断芯片上市，用于爱滋病的早期诊断。但芯片技术在疾病诊断上的应用尚处于起步阶段，还未大面积推广，原因主要有(1)基因芯片技术是一项全新的技术，对人才、技术、资金的要求很高，目前只有一小部分的科研机构和高科技公司完全掌握了该项技术；(2)从理论上而言，诊断芯片可以检测出体液中所有已存在的病原体，从而做到疾病的早期预防和治疗。为了检测出体液中可能存在的DNA或RNA病原体，要求获得相应病原体的DNA模板或获得RNA模板进行逆转录获得其DNA，然后进行PCR扩增荧光标记，并将扩增产物用于诊断芯片的DNA杂交检测。因此，用较简便的方法获得体液中可能存在的各种病原体的DNA、RNA模板已成为该领域的一个技术难题，目前尚无很好的方法。
本发明的目的在于提供一种同时抽提体液(包括但不限于血液、尿液、唾液)中病原体RNA和DNA的方法，通过相应的抽提试剂和抽提方法，用较简便的方法获得体液可能存在的各种病原体的DNA、RNA模板，用于PCR扩增，有助于提高诊断基因芯片技术的准确性和特异性。
本发明亦是这样实现的本发明所公开的是一种抽提方法体液中病原体RNA和DNA方法，具体如下(1)取体液50ul，加入抽提液1-10μl,25-45℃,3-15分钟。(2)煮沸5-15分钟。(3)50-80℃,10-30分钟，打开盖子。(4)再加入2-10μl超纯水悬浮，静止5-20分钟。(5)12000-15000rpm，离心5-15分钟。(6)取上清8μl做RT-PCR。抽提液(1000μl)的配制如下100μlDEPC(焦碳酸二乙酯)+5μlNP40+895μl水NP40为AMRESCO公司生产的化学试剂名，分子量为603。
以下将通过实施例对本发明的有关细节作进一步的阐述，但实施例并不限制本发明的保护范围，有关的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，举一反三地应用于同时抽提体液中病原体RNA和DNA，，这也在本发明的保护范围之内。
实施例1(1)抽取一已确症的感染有乙型肝炎病毒(DNA病毒)和丙型肝炎病毒(RNA病毒)的患者血液，取血清50ul，加入抽提液5μl,37℃,5分钟。
(2)煮沸10分钟。
(3)70℃,20分钟，打开盖子。
(4)再加入5μl超纯水悬浮，静置10分钟。
(5)13000rpm，离心10分钟。
(6)取上清8μl做RT-PCR。
(7)将制备的探针与诊断芯片上的靶基因进行DNA杂交；(8)将诊断芯片用ScanArray 3000扫描仪扫描，并使用Imagene软件分析杂交结果，发现该血清样品与乙型肝炎病毒靶基因和丙型肝炎病毒靶基因呈阳性反应。
通过说明书所公开的技术方案和实施例表明，本发明的同时抽提体液中病原体RNA和DNA的方法具有以下优点(1)方法简便，速度快；(2)由于操作步骤较少，得率高，稳定性好。
权利要求
1.一种同时抽提体液中病原体RNA和DNA的方法，其特征在于，抽提的步骤为(1)取体液至少5ul，加入抽提液1-100μl,25-45℃,3-15分钟。(2)煮沸5-15分钟。(3)50-80℃,10-30分钟，打开盖子。(4)再加入2-10μl超纯水悬浮，静止5-20分钟。(5)12000-15000rpm，离心5-15分钟。(6)留取上清备用。
2.如权利要求1所述的一种体液中病原体RNA和DNA同时抽提方法，其特征在于，最适条件为(1)取血清50ul，加入抽提液5μl,37℃,5分钟。(2)煮沸10分钟。(3)70℃,20分钟，打开盖子。(4)再加入5μl超纯水悬浮，静置10分钟。(5)13000rpm，离心10分钟。(6)留取上清备用。
3．一种用于权利要求1所述方法的专用抽提液，其特征在于，抽提液(1000μl)的配制如下100μlDEPC(焦碳酸二乙酯)+5μlNP40+895μl水。
全文摘要
本发明公开了一种同时抽提体液中病原体RNA和DNA的方法及其专用的抽提液,其步骤包括:(1)取体液至少5ul,加入抽提液1－100μl,25－45℃,3－15分钟,(2)煮沸5－15分钟,(3)50－80℃,10－30分钟,打开盖子,(4)再加入2－10μ′l超纯水悬浮,静止5－20分钟,(5)12000－15000rpm,离心5－15分钟,(6)留取上清备用。专用的抽提液中含有1DEPC(焦碳酸二乙酯)和NP40。该方法简便,速度快;由于操作步骤较少,得率高,稳定性好。
文档编号C12Q1/68GK1314492SQ0011499
公开日2001年9月26日 申请日期2000年3月20日 优先权日2000年3月20日
发明者毛裕民, 谢毅, 肖自力 申请人:上海博道基因开发有限公司